Ophalen van Muis Eicellen
28 april 2007
Dit protocol laat de techniek voor de extractie van eicellen of een vroeg stadium bevrucht embryo uit de eileider van muizen. De mogelijkheid om de infindibulum identificeren en steek een stomp uiteinde naald in is het essentieel om de juiste uitvoering van de procedure.
Mijn naam is Amanda dli. Ik kom uit het laboratorium van Dr. Paul Verana aan de University of California Irvine. Vandaag zal ik u de procedure voor de oöcytaspiratie laten zien.
Dit houdt in dat de videx van het vrouwtje wordt geïsoleerd. Zodra de ovex zijn geïsoleerd, injecteren we FHM-medium door de videx, waarna de cytes uit de uterus zouden moeten komen. Wanneer dit is voltooid, isoleren we de cytes in het medium en gebruiken we deze voor toekomstige experimenten.
Naast het isoleren van cyten kunt u deze procedure ook gebruiken voor het isoleren van embryo's op specifieke tijdstippen. Een reden waarom het nuttig is om deze procedure in videoformaat te bekijken, is dat de verschillende delen van de eileider zeer moeilijk te herkennen kunnen zijn. In deze video zal ik het infundibulum aanwijzen, waar u het FHM-medium injecteert.
De dissectieinstrumenten die u zult gebruiken, zijn twee sets scherpe pincetten en één schaar met scherpe bladen. De eileiders die van het vrouwtje zijn weggenomen, worden geplaatst in FHM-medium in een weefkweekschaal van 35 millimeter. De eitjes worden verzameld met een stompstompige naald van 30 millimeter bevestigd aan een spuit van 1 milliliter, waarbij de eileider wordt gestabiliseerd met een scherp pincet.
FHM is een opvangmedium dat wordt gebruikt voor het oogsten van de cellen. KSOM is het medium dat wordt gebruikt om de cellen in de incubator te laten groeien indien zij bevrucht raken. Zodra de eicellen en embryo's uit de eileider zijn gehaald, gebruiken we een glazen transferpipet die uit een capillairbuisje is getrokken; hieraan bevestigen we wat slangetjes om ze vervolgens via mondpipettering over te brengen naar het opvangmedium.
Een glazen concave schaal wordt gebruikt om de embryo's en eitjes vast te houden. Deze kunnen in elke concave cirkel worden geplaatst zodat ze zich op een aparte locatie bevinden, wat het makkelijker maakt om ze terug te vinden. Deze schaal wordt in deze houder geplaatst, zodat deze in een CO2-incubator kan worden gezet zonder gebruik van olie.
Bovenop het FHM-medium of KSOM, afhankelijk van het medium, wordt water in de basis geplaatst, de kraan gesloten en blijft de vloeistof op zijn plaats. 70% ethanol wordt gebruikt om te voorkomen dat er haren bij komen. Er wordt een kleine incisie gemaakt in de buikregio en een incisie in de buikholte.
We vergroten een incisie om de buikregio bloot te leggen. Zodra dit is gedaan om de uterus bloot te leggen, verschuiven we de darmen terzijde, waarna de uterus duidelijk zichtbaar is. De uterus is Y-vormig en we nemen een deel van de uterus weg.
Wanneer deze wordt doorgesneden, ziet de eileider eruit als spaghetti. Ik zal proberen een deel van de eileider te nemen. Ik neem de UCT en een deel van de eierstokken, die zijn ingebed in vet.
De andere zijde zal nu worden behandeld. Op dit punt pakken we opnieuw de eierstok of de baarmoeder op. Pak hier de baarmoeder vast en snijd onder het aanhechtingspunt. De eileiders zijn op dit punt zichtbaar.
Ik neem een deel van de OV-eierstok mee. Dit wordt vervolgens in medium geplaatst. De uterus trekt nog steeds samen.
De uterus bestaat uit glad spierweefsel, waardoor de neuronen nog steeds vuren, zelfs wanneer deze is losgekoppeld van het lichaam. De uterus wordt hier getoond. Hoewel de eileider op spaghetti lijkt en het eierstokje zich daarboven bevindt, is de eileider in feite niet verbonden met het eierstokje.
Hoewel we op dit punt slechts een deel van het ovarium hebben getoond, is mijn dominante hand mijn rechterhand, waarmee ik de stompe naald van gauge 30 vasthoud. Ik gebruik deze als een pincet om de in fibula te isoleren. Zodra deze is geïsoleerd, breng ik de stompe naald in de in fibula aan en injecteer ik een hoeveelheid vloeistof die uit de uterus zal stromen.
Mijn linkerhand houdt scherpe pincetten vast. Deze worden gebruikt om de in fibula te isoleren en alles op zijn plaats te houden. De am dula is een trompetvormig isolaat hier.
De punt van mijn naald bevindt zich in het fibula, dat door de weefsellaag heen wees. Oké. Om er zeker van te zijn dat ik alle embryo's en eitjes heb geïsoleerd, knijp ik in de uterus zoals men in een tube tandpasta knijpt. Zodra u zich richt op de vetkussentjes, zoekt u naar wat lijkt op vetdruppeltjes die perfect symmetrisch zijn.
Er bevindt zich er nu één net links van dat lange vetlichaam. Dat is één enkel ei. Wat ik nu ga doen, is met de micropipet het ei opzuigen en het in wat meer bewaarmedium plaatsen, zodat we de eieren zelf kunnen isoleren.
Vandaag heb ik u laten zien hoe u cytes uit het vrouwelijke voortplantingsstelsel isoleert. Daarnaast heb ik u de verschillende structuren van de eileider getoond. In het bijzonder het infundibulum, wat de enige structuur is waarin u het FHM-medium kunt injecteren.
Met een naald van 30 gauge. Met deze techniek heb ik oocyten en eventuele embryo's geïsoleerd die aanwezig waren in het vrouwelijke voortplantingsstelsel. Ik kan deze gebruiken voor genexpressiestudies of transgeen werk.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor het terugwinnen van oocyten en vroege embryo's van vrouwelijke Peromyscus, een genus knaagdieren. De procedure is ontworpen om de collectie van deze reproductieve cellen te optimaliseren voor downstream toepassingen, zoals genexpressiestudies en transgeen onderzoek.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Reproductieve biologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Knaagdier-model systemen
Achtergrond
- Weinig studies zijn erin geslaagd om de embryogenese of reproductieve biologie van Peromyscus te manipuleren.
- Het optimaliseren van de winning van oocyten en embryo's is essentieel voor het bevorderen van genetische en ontwikkelingsstudies in dit model.
- Een nauwkeurige identificatie van de structuren van het voortplantingsstelsel is cruciaal voor een succesvolle celisolatie.
- Het Peromyscus Genetic Stock Center werkt samen om deze protocollen te verfijnen.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode te bieden voor het isoleren van oocyten en embryo's van vrouwelijke Peromyscus.
- Om verder onderzoek naar genexpressie en transgene technieken met behulp van deze cellen te vergemakkelijken.
- Om anatomische oriëntatiepunten en technische stappen te verduidelijken voor een effectieve celterugwinning.
Gebruikte methoden
- Dissectie van het vrouwelijke voortplantingsstelsel om de uterus en eileiders bloot te leggen.
- Gebruik van scherpe pincetten en scharen voor weefselisolatie.
- Injectie van FHM-medium in het infundibulum van de eileider met behulp van een 30-gauge stompe naald en spuit.
- Verzamelen van oocyten en embryo's in bewaarmedium met behulp van een glazen transferpipet en de mondpipetteertechniek.
- Plaatsen van de teruggewonnen cellen in een glazen concave schaal voor incubatie of verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van oocyten en embryo's uit de eileider en baarmoeder van vrouwelijke Peromyscus.
- Duidelijke identificatie van belangrijke anatomische structuren, zoals het infundibulum, voor nauwkeurige injectie van het medium.
- Demonstratie van technieken om de efficiëntie van de terugwinning te maximaliseren, inclusief voorzichtig manoeuvreren en visuele aanwijzingen.
- Voorbereiding van cellen voor downstream toepassingen, zoals genexpressieanalyse of transgeen werk.
Conclusies
- Het beschreven protocol maakt betrouwbare winning van oocyten en embryo's uit Peromyscus-vrouwtjes mogelijk.
- Beheersing van de anatomische identificatie en de technische stappen is cruciaal voor reproduceerbaarheid.
- Deze methode ondersteunt geavanceerde genetische en ontwikkelingsstudies in Peromyscus-modellen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Betrouwbare winning van muizeicyten en embryo's is fundamenteel voor genetische manipulatie, transgeen onderzoek en ontwikkelingsbiologie in preklinische discovery. Dit protocol maakt gestandaardiseerde collectie van hoogwaardige reproductiecellen mogelijk, ter ondersteuning van downstream genexpressie- en functionele studies. Geoptimaliseerde oocytenwinning in Peromyscus-modellen breidt de translationele toolkit voor vroege biopharma R&D uit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt precieze isolatie van oocyten en embryo's mogelijk voor hypothese-gestuurde genetische studies.
- Ondersteunt functionele validatie van reproductieve en ontwikkelingsdoelen in knaagdiermodellen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door het leveren van consistent biologisch materiaal voor de analyse van signaalpaden.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde biologische inputs voor de ontwikkeling en optimalisatie van assays.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in screening-workflows op basis van embryo's.
- Bereidt gevalideerde monsters voor voor kwantitatieve genexpressie- en fenotypische assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt continuïteit mogelijk van genetische manipulatie tot de ontwikkeling van preklinische modellen.
- Ondersteunt de afstemming op ziekterelevante systemen door middel van gecontroleerde embryo-terugwinning.
- Vermindert biologische variabiliteit, waardoor het voorspellend vertrouwen in downstream-studies wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor het ophalen van oocyten en embryo's bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en de generatie van preklinische modellen, en biedt fundamenteel materiaal voor genetische, transgene en ontwikkelingsgerichte workflows.
- Discovery Biology: Levert oocyten en embryo's van hoge integriteit voor hypothesetoetsing en padanalyse.
- Screening: Levert reproduceerbare biologische monsters voor assay-gereedheid en kwantitatieve evaluatie.
- Analytics: Maakt het verzamelen van meetbare output mogelijk voor vergelijkende genexpressie en ontwikkelingsstudies.
- Translational Research: Slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinische validatie door de ontwikkeling van modelsystemen te ondersteunen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar protocol voor consistente celterugwinning over verschillende onderzoeksprogramma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in genetische studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert het ophalen van cellen, wat de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid verbetert.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische en ontwikkelingsprogramma's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de voortplantingsanatomie van knaagdieren en microdissectie.
- Vereist toegang tot gespecialiseerd dissectie-instrumentarium, media en incubatie-infrastructuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een reproduceerbare monsterkwaliteit.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende knaagdierstammen of ontwikkelingsstadia.
- Afhankelijk van nauwkeurige anatomische identificatie voor een optimale opbrengst en reproduceerbaarheid.
