Het analyseren Reacties van Mouse Olfactorische sensorische neuronen Met behulp van de Air-fase Electroolfactogram opnemen
2 maart 2010
De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatieve, gemakkelijk te voeren, en betrouwbare manier te beoordelen olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Dit protocol beschrijft een recording setup, muis weefsel voorbereiding, het verzamelen van gegevens, en de elementaire data-analyse.
Een voorbereiding van olfactorisch epitheel wordt op een schaal gemonteerd en in een stroom bevochtigde lucht geplaatst. Onder een dissectief microscoop wordt een referentie-elektrode elektrisch verbonden met het weefsel via een bufferoplossing. Een opname-elektrode wordt op het oppervlak van het olfactorische epitheel geplaatst.
Het olfactorische epitheel wordt gestimuleerd door computergestuurde geurpluizen die worden toegediend in een stroom bevochtigde lucht, die de geuren naar het olfactorische epitheel transporteert. EOG-signalen worden via een versterker en digitalisator naar de opnamecomputer gestuurd. Hallo, ik ben Catherine Ciar van het Laboratorium voor Hygiëne XO bij de Afdeling Biologie van de Johns Hopkins University.
Vandaag laten we u een procedure zien voor het opnemen van het elektro olfactogram van muizen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de reacties van olfactorische sensorische neuronen op geuren te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Het opnameapparaat bestaat uit een opname-elektrode, een referentie-elektrode, een luchttoevoerbuis, een monsterstandaard en een dissectief microscoop, allemaal verankerd op een luchttafel binnen een Faraday-kooi. Micromanipulatoren worden gebruikt voor het plaatsen van de elektroden in de luchttoevoerbuis. Er wordt een continue luchtstroom door gedestilleerd water geblazen om vocht toe te voegen voordat deze door de luchttoevoerbuis en over het monster passeert.
Een 60 millimeter kwekerijschaal gevuld met sard om aan te passen van zes tot acht millimeter wordt gebruikt als montageoppervlak voor het monster. Een putje en een kanaaltje worden uitgesneden in de bewaker in de montageschaal. Om een middel te bieden om de referentie-elektrode via een gemodificeerde ringer-oplossing elektrisch met het monster te verbinden.
De opname- en referentie-elektroden zijn verbonden met een versterker. Signalen van de versterker worden naar een digitalisator gestuurd en vervolgens naar een computer. XI graph-software wordt gebruikt om het stimulatieprotocol te besturen, het signaal op te nemen en de reacties te analyseren.
Een oscilloscoop is aangesloten na de versterker voor realtime monitoring van het elektrische potentieel tijdens het plaatsen van de opname-elektrode. En tijdens EOG-opnamen. De toevoer van de geurstoffen wordt geregeld door een pico spritzer, die is aangesloten op dezelfde computer die wordt gebruikt voor signaalverwerving net voordat een geurprik wordt afgegeven.
De uitgang van de pico spritzer is verbonden met een fles met vloeibare geurstoffen. De fles wordt vervolgens aangesloten op de luchttoevoerbuis. Laten we nu zien hoe we elektroden voor opname-experimenten kunnen voorbereiden.
De opname-elektrode is een chloorzilverdedraad in een getrokken glazen capillair gevuld met een gemodificeerde ringer-oplossing. De referentie-elektrode is een chloorzilverdedraad. Begin de voorbereiding van beide elektroden door een zilverdraad in de elektrodehouder te installeren.
Voor de opname-elektrode moet één tot twee centimeter draad uit het uiteinde van de elektrodehouder steken. Meer draad kan worden achtergelaten voor de referentie-elektrode. Om de zilverchloride-coating toe te voegen, plaatst u de draad in 0,1 molair natriumchloride en verbindt u de elektrodehouder met de positieve terminal van een 1,5 tot 9 volt DC-stroombron.
De negatieve terminal van de stroombron moet elektrisch worden verbonden met de 0,1 molaire natriumchloride-oplossing. Laat de chloridereactie gedurende 10 minuten doorgaan om eventuele statische lading tussen de opname- en referentie-elektrode te egaliseren. Raak de elektroden kort aan voordat u ze op het opnameapparaat installeert.
Trek vervolgens een glazen capillair met behulp van een micropipettrekker. De opening aan de punt van de capillair moet ongeveer vijf tot tien micron in diameter zijn. Gebruik een diamantpotlood om het stompe uiteinde van de capillair te markeren en af te breken, zodat het ongeveer twee centimeter langer is dan de zilverdraad.
Gebruik een butaanbrander om het gesneden uiteinde te polijsten, smelt nu 0,5% agros in een gemodificeerde ringer-oplossing. Gebruik een overdrachtspijp om een kleine hoeveelheid gesmolten agro-oplossing in de punt van de elektrode te trekken met behulp van een spuit die is verwarmd en getrokken om een lange dunne punt te hebben. Vul de getrokken capillair ongeveer half.
Met gemodificeerde ringer-oplossing, tik voorzichtig op de capillair om eventuele luchtbellen los te maken. Bewaar de gevulde elektrode in de opslagpot met een kleine hoeveelheid gemodificeerde ringer-oplossing op de bodem totdat deze klaar is om te worden gebruikt. Zodra een weefselmonster is voorbereid en klaar is voor opname, installeert u een gevulde capillair over de opname-elektrodedraad met de elektroden klaar.
Laten we een opname-experiment bekijken om te beginnen met het voorbereiden van weefsel voor opname. Verwijder de huid boven de schedel van een gedood muis en snij de kop in tweeën langs de middenlijn. Monteer de ene helft van de kop met de mediale kant naar boven op de montageschaal. Verwijder voorzichtig het septum om de turbinaten bloot te leggen.
Plaats de schaal met gemonteerde weefsels op de opnamestandaard. Lijn de standaard uit zodat de opnamelocatie op de turbinaten onder de microscoop is gecentreerd. Schakel nu de luchttank in om bevochtigde lucht bij ongeveer 600 milliliter per minuut naar het turbinaatoppervlak te leveren.
Plaats de luchttoevoerbuis zodat deze ongeveer 10 millimeter van de opnamelocatie verwijderd is. Stel de versterker in DC-modus, omdat AC-versterking artefacten in het EOG-signaal zal veroorzaken. Verkrijg met een laagdoorlaatfilter van één kilohertz en een versterking van 100 x.
Monteer nu de opname- en referentie-elektroden op de micromanipulatoren. Laat de referentie-elektrode zakken in de put op de montageschaal en bedek deze met gemodificeerde ringer-oplossing zodat deze elektrisch is verbonden met het weefsel. Laat voorzichtig de opname-elektrode zakken op het oppervlak van turbinaat twee B of drie.
De elektrode mag nauwelijks het oppervlak van het olfactorische epitheel aanraken. Wanneer de
Overzicht
Dit protocol beschrijft de techniek voor het registreren van het electro-olfactogram (EOG), een betrouwbare methode om de olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel te beoordelen. De procedure omvat de voorbereiding van het weefsel, gegevensverzameling en basisgegevensanalyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Olfactorische functie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het EOG is een waardevol instrument voor het bestuderen van olfactorische sensorische neuronen.
- Het omvat de stimulatie van het olfactorische epitheel met geurstoffen.
- De techniek maakt real-time monitoring van elektrische responsen mogelijk.
- Inzicht in de olfactorische functie is essentieel voor diverse biologische en medische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een methode aan te tonen voor het registreren van EOG vanuit het reukepitheel van muizen.
- Om de reacties van reuksensoneuronen op verschillende geurstoffen te analyseren.
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het reukepitheel en de opstelling van de elektroden.
- Gebruik van een dissectiemicroscoop voor de plaatsing van de elektroden.
- Stimulatie van het epitheel met computergestuurde geurstoff-puffs.
- Gegevensverwerving via een versterker en digitalisator.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registratie van EOG-signalen uit het reukepitheel.
- Demonstratie van de betrouwbaarheid en het gebruiksgemak van de procedure.
- Analyse van neuronale reacties op diverse odoranten.
- Vaststelling van een protocol voor toekomstig reukonderzoek.
Conclusies
- De EOG-registratiemethode is effectief voor het bestuderen van de reukfunctie.
- Dit protocol kan door onderzoekers worden gebruikt om responsen van olfactorische sensorische neuronen te onderzoeken.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze fundamentele techniek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Registratie van het elektro-olfactogram (EOG) in de gasfase maakt een kwantitatieve beoordeling van de functie van reuksensneuronen (OSN) in genetisch gemodificeerde muismodellen mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanistische risicoreductie binnen de sensorische neurowetenschappen. Deze methode biedt reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van OSN-responsen op stimulatie door geurstoffen, waardoor een onderlinge vergelijking van genetische en farmacologische manipulaties wordt gefaciliteerd. De betrouwbaarheid en standaardisatie maken het tot een waardevol instrument voor portfoliotriage en translationeel onderzoek in de olfactorische biologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe ondervraging van olfactorische transductiepaden in genetisch gemodificeerde muizen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van kandidaatgenen en signaleringscomponenten in OSN's.
- Biedt mechanische risicoreductie door het kwantificeren van responsamplitude, latentie en adaptatie.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij het koppelen van moleculaire targets aan sensorische fenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay vast voor het evalueren van de OSN-functie onder verschillende experimentele condities.
- Genereert kwantitatieve resultaten (amplitude, kinetiek) die geschikt zijn voor comparatieve analyse.
- Maakt screening mogelijk van genetische of farmacologische interventies die de olfactorische signalering beïnvloeden.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de assay en het hergebruik van het platform voor diverse odorant-panels.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen voor sensorische dysfunctie en de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Biedt continuïteit van moleculaire ontdekking tot preklinische validatie van olfactorische fenotypes.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van therapieën gericht op de zintuigen.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor translationeel onderzoek naar olfactorische aandoeningen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze EOG-registratiemethode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinische fase, waardoor een brug wordt geslagen tussen genetische manipulatie, functionele validatie en translationele beoordeling van olfactorische targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden in OSN-signalering.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt metrieken voor amplitude, latentie en adaptatie voor robuuste statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Maakt afstemming mogelijk met ziektemodellen en biomarkerstrategieën in de sensorische neurowetenschap.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Fungeert als een herbruikbaar platform voor lopende genetische en farmacologische studies naar olfactie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van OSN-targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert gegevensacquisitie en -analyse voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie in portefeuilles voor sensorische targets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van olfactorische onderzoeksprogramma's mogelijk.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en de preparatie van muisweefsel.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder versterkers, digitaliseerders en gecontroleerde geursystemen.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor de plaatsing van elektroden en stimuleringsprotocollen.
- Aanpassing aan verschillende genetische achtergronden of geurpanels kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Het behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel en het minimaliseren van adaptatie zijn cruciaal voor betrouwbare gegevensverwerving.
