Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC's) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC's

Mesenchymale stamcellen, afgekort als MSC's, worden geïsoleerd uit een vrouwelijke rag dolly-rat van zes tot acht weken oud en gekweekt in een Petri-schaal van 10 centimeter totdat ze een confluentie van ongeveer 80% bereiken. Om de MSC's te verrijken, worden de cellen gekleurd met biotin-geconjugeerde primaire antilichamen, gevolgd door streptavidine-geconjugeerde magnetische beads. Gemarkeerde cellen worden vervolgens via magnetisch geactiveerde cel sortering gescheiden in twee fracties: de negatieve fractie en de positieve fractie.

Vervolgens wordt flowcytometrie-analyse gebruikt om de expressie van oppervlaktemarkers te bevestigen. Ten slotte worden klooncilinders gebruikt om MSC's afgeleid van enkele kolonies te verkrijgen. Hallo, ik ben Lee van het laboratorium van Christina Chang van de afdeling Chemical Engineering and Material Science aan de Michigan State University.

Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie en verrijking van chy stamcellen, evenals het verkrijgen van cellen afgeleid van enkele kolonies. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het proliferatie- en differentiatiegedrag van rode stamcellen te bestuderen. Laten we beginnen.

Mesenchymale stamcellen of MSC's worden geïsoleerd uit een zes tot acht weken oude vrouwelijke Sprague-Dawley rat. Begin deze procedure door de femuren en tibia uit de achterpoten van het geëuthanaseerde dier te snijden. Verwijder de huid en spieren, plaats de gedissecteerde femuren en tibia enkele seconden in 70% isopropanol en breng ze vervolgens over in 1X DPBS.

De volgende stappen moeten in een biologische veiligheidskast worden uitgevoerd. Draag eerst het femur en de tibia over naar een schaal van 10 centimeter met DMEM. Snijd vervolgens met een schaar de twee uiteinden open terwijl u elk bot met een pincet vasthoudt.

Bevestig een naald van 22 gauge aan een spuit van drie milliliter en vul deze met DMEM. Steek de naald in één geopend uiteinde van het bot en spoel het merg in een buis van 50 milliliter. Herhaal dit twee tot drie keer per bot totdat al het merg is verkregen.

Resuspendeer de cellen en breng de celsuspensie vervolgens door een cellenzeef van 70 µm om botresten en bloedaggregaten te verwijderen. Centrifugeer de cellen bij 200 ×g bij 4 °C gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant via aspiratie en resuspendeer de cellen in 25 mL MSC-medium.

Breng 10 milliliters cel-suspensie aan in elk van twee 10 centimeter kweekschalen. Incubeer de kweekschalen in een 37 degrees Celsius 5%carbon dioxide incubator gedurende één tot twee weken. Zodra de eerder geïsoleerde rat MSCs een confluentie van ongeveer 80% bereiken, wordt het medium geaspireerd en worden vier tot vijf milliliters trypsine EDTA aan elke schaal toegevoegd.

Plaats de schalen terug in de incubator en laat ze ongeveer vijf minuten incuberen. Voeg om de cellen te laten loslaten een gelijke hoeveelheid kweekmedium toe om de trypsine te inactiveren. Verzamel de cel-suspensies in een buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen bij 200 GS bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Nu demonstreren we de verrijking van MSC's aan de hand van twee oppervlaktemarkers, CD 54 en CD 90. Hiervoor gebruiken we de BD I magneet, een cel-separatiemagneet van BD Biosciences. Begin met het resuspenderen van de celpellet in celkleuringsbuffer op een concentratie van 20 miljoen cellen per milliliter.

Voeg vervolgens biotinylated CD 54-antilichaam en een biotinylated CD 90-antilichaam toe aan de celsuspensie en meng deze voorzichtig. Na incubatie op ijs gedurende 15 minuten worden de gelabelde cellen gewassen met een overmaat aan 1X BD IMAG-buffer. Centrifugeer de gelabelde cellen bij 200 $\times$g bij 4 °C gedurende vijf minuten. Bereid de BD IMAG streptavidine-partikels voor door deze grondig te vortexen, en voeg vervolgens 40 µL partikels toe per 10 miljoen cellen.

Meng de deeltjes grondig met de gelabelde cellen en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij zes tot 12 °C. Label tijdens deze incubatietijd een rondbottomige reageerbuis voor het opvangen van de positieve fractie. Breng na afloop van de incubatie het labelvolume naar 20 miljoen cellen per milliliter.

Gebruik één Expedia I mag buffer. Breng de gelabelde cellen over naar de opvangbuis voor de positieve fractie. Plaats de buis met de positieve fractie op de BDI-magneet en laat deze zes minuten staan.

Verwijder vervolgens, terwijl de buis met de positieve fractie nog op de BDI-magneet staat, het supernatant met een glazen Pasteurpipet. Neem daarna de buis met de positieve fractie van de BDI-magneet en plaats deze op ijs. Voeg één milliliter ijskoude 1x BDI-magbuffer toe en resuspendeer de cellen door voorzichtig te mengen.

Plaats de buis terug op de BDI-magneet en laat deze twee tot vier minuten staan. Verwijder het supernatant met een nieuwe glazen pastierpipet. Herhaal het wassen zoals eerder beschreven.

Nog een keer. Verwijder ten slotte het supernatant met een nieuwe glazen Pasteur-pipet. Neem vervolgens de buis uit de BDI-magneethouder.

Suspendeer de cellen in één milliliter kweekmedium en overbreng de celsuspensie naar een buis van 50 milliliter die 25 milliliter medium bevat. 1 vierkante kolf van 75 centimeter voor het onderhouden van de cellen. En een schaal van 10 centimeter voor flowcytometrie.

Om de procedure voor het scheiden van MSC's afkomstig van enkele kolonies te starten, worden de cellen geplate met ongeveer 50 tot 100 cellen per 10 centimeter schaal en geïncubeerd in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende één tot twee weken. Examineer tijdens deze periode van één tot twee weken goed geïsoleerde kolonies met een omgekeerde microscoop. Zodra de kolonies een voldoende grootte van meer dan 100 cellen per kolonie hebben bereikt, worden de kolonies met een permanente marker op de bodem van de schaal gemarkeerd.

Kies een kolonie om te markeren en zorg ervoor dat er geen andere kolonies in de directe omgeving aanwezig zijn. Aspireer het medium en was de schaal één keer met 1X-DPBS met behulp van een pincet. Neem een steriele klooncilinder en plaats deze voorzichtig rond de gemarkeerde kolonie.

Herhaal dit totdat er over elke gemarkeerde kolonie een klooncilinder is geplaatst. Voeg 100 microliters tripsine EDTA toe aan elke klooncilinder en plaats de schaal terug in de incubator. Controleer na vijf minuten de cellen onder de microscoop om te zien of ze afronden.

Wanneer de cellen zijn losgekomen, voegt u een gelijke hoeveelheid kweekmedium toe om de trypsine te inactiveren. Meng de celsuspensie met de 200 microliter micropipet en breng de celsuspensie over naar een schaaltje van 60 millimeter dat drie milliliter voorverwarmd kweekmedium bevat. Label de schaaltjes en plaats ze terug in de incubator nadat de plastic-adherente cellen zijn geïsoleerd.

De MSC's zouden de volgende dag na het uitplaten zichtbaar moeten zijn. Terwijl de cellen blijven prolifereren, moeten confluente cellen eruitzien als de cellen in deze fasecontrastafbeelding, waarbij de meerderheid een spoelvormige of stervormige morfologie heeft; passageren is gepast wanneer de cellen een confluentie van ongeveer 80% bereiken.

Na trypsinisatie moeten de losgekoppelde cellen er rond uitzien en in het medium zweven. Zodra de MSC's zijn verrijkt door middel van magnetische cellsortering, wordt er flowcytometrie uitgevoerd om de expressie van oppervlaktemarkers te verifiëren. Als de verrijking succesvol is, moeten de cellen een positieve kleuring vertonen voor de MSC-markers CD 54 en CD 90, maar een negatieve kleuring voor de HSC-marker CD 45; isotypecontroles IgG twee A en IgG één worden als negatieve controles gebruikt.

Wanneer cellen op een juiste clonale dichtheid zijn uitgezet, moeten kolonies ontstaan uit individuele cellen, zoals in dit voorbeeld wordt getoond. Klooncilinders kunnen vervolgens worden gebruikt om de kolonies te scheiden, waarna de uit de kolonies verkregen cellen afzonderlijk kunnen worden gekweekt. In deze twee voorbeelden zijn de cellen afkomstig van één kolonie spoelvormig, terwijl de cellen afkomstig van een andere kolonie rond zijn.

We hebben u nu getoond hoe u willekeurige en algemene stamcellen kunt isoleren en verrijken, en ook hoe u cellen afgeleid van enkele kolonies kunt verkrijgen. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat bloedstolsels en botresten tijdens de isolatie moeten worden verwijderd. Gebruik de optimale hoeveelheid antilichaam tijdens de verrijking en markeer goed geïsoleerde kolonies tijdens de koloniescheiding.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.