Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris

Het volgende protocol beschrijft eiwitexpressie met gebruik van de methyl atrophic gist opus. De preparatie van elektrocompetente gistcellen en de transformatie van de vector met het gen van belang in PPAs worden getoond, gevolgd door een stap voor gist-DNA-zuivering om de juiste integratie van uw gen van belang in het gistgenoom te controleren. Ten slotte voeren we de expressie van het recombinante eiwit uit.

Hallo, ik ben Maria van het laboratorium van Steven Hallam bij de afdeling Microbiologie en Immunologie van de University of British Columbia. Ik ben Marcus, ook van het Helm Lab. Vandaag laten we u een procedure zien om recombinante eiwitten tot expressie te brengen in de TRO-gist PQ.Past stories.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om eiwitten van niet-gecultiveerde micro-organismen te bestuderen, waarbij omgevings-DNA is geëxtraheerd en gearchiveerd in meta-genomische bibliotheken. Laten we beginnen. De expressie van recombinante eiwitten in de methylotrofe gist Pichia pastoris vereist de klonering van uw gen van belang in frame in een Pichia-expressievector.

In ons experiment gebruiken we de vector PPIC Z alpha A. Deze vector bevat de AO X one-promotor voor strak gereguleerde, door methanol geïnduceerde expressie van het gen van belang, het alpha-factor secretiesignaal voor secretie van het recombinante eiwit, zaas en een resistentiegen voor selectie in zowel e coli als pic, een C-terminaal peptide dat een acemic-epitoop bevat en een polyhistidine-tag voor detectie en zuivering van het recombinante eiwit. Lineariseer voorafgaand aan de transformatie de vector die uw gen van belang bevat door middel van een restrictiedigestie. Wij gebruiken het enzym PME one, maar andere restrictieplaatsen zijn mogelijk, mits uw insert die restrictieplaats niet bevat.

Om voldoende gelineariseerd vector-DNA te verkrijgen, stelt u drie tot vier restrictiedigestiereacties van 50 µL op in afzonderlijke buisjes. Combineer na de digestie alle oplossingen en concentreer uw construct. Met behulp van een AmCon centrifugale filterunit en een MicroCon centrifugale filterunit heeft u vijf tot 20 µg gelineariseerd DNA in vijf tot 10 µL steriel water nodig voor transformatie in PPA dous. Om electrocompetente PPA dous voor te bereiden, strijkt u vier dagen voor de beoogde transformatie cellen uit op een A-Y-P-D-S plaat zonder SN; laat deze één tot twee dagen groeien bij 30 °C, of tot er twee dagen voor de transformatie enkelvoudige kolonies zijn gevormd.

Kweek vijf milliliter van de PPA of stam in YPD-medium in een Falcon-buis van 50 milliliter bij 30 °C gedurende de nacht. Plaats de Falcon-buis één dag voor de transformatie in een kolf om deze in de schudmachine te fixeren. Gebruik 0,25 milliliter van de overnight-cultuur om 500 milliliter vers YPD-medium in een kolf van twee liter te inoculeren.

Kweek de cellen opnieuw overnacht in een schudmachine bij 30 °C tot een OD 600 van 1,3 tot 1,5. Zorg dat er op de dag van de transformatie ijs, koud steriel water en één molair sorbitol aanwezig zijn. Centrifugeer de cellen bij 1500 Gs gedurende vijf minuten bij 4 °C.

Na centrifugatie suspenderen we de pellet in 500 milliliters ijskoud, steriel water. Afhankelijk van de capaciteit van de centrifugebuizen moet u het volume mogelijk verdelen over twee aparte buizen of meerdere runs uitvoeren. Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer de pellet in 250 milliliters ijskoud, steriel water.

Afhankelijk van de capaciteit van de centrifugebuizen kunnen de afzonderlijke celpellets in één buis worden gecombineerd. Resuspendeer de pellet vervolgens opnieuw. Breng de geresuspendeerde cellen over naar een 50 milliliter falconbuis in 20 milliliters ijskoud 1 molar sorbitol en centrifugeer.

Resuspend na een laatste centrifugatie de pellet in één milliliter ijskoude, één molar sorbitol tot een eindvolume van ongeveer 1,5 milliliter. Bewaar de geresuspendeerde cellen in microcentrifugebuisjes op ijs of bij vier graden Celsius totdat ze worden gebruikt voor transformatie. Bereid vóór de transformatie van het geconcentreerde gelineariseerde construct in PPA-opslagcellen de volgende reagentia en instrumenten voor.

Vul een microcentrifugebuis met één milliliter één molar sorbitol en plaats deze op ijs. Plaats een 0,2 centimeter electroporatiecup op ijs.

Label een steriele glazen buis van 15 milliliter en houd een steriel glazen pipetpunt bij de hand. Overbreng 80 microliters van de eerder bereide elektrocompetente cellen naar de ijskoude 0,2 centimeter electroporatiecuvet.

Voeg de plasma-DNA-oplossing toe aan de cellen en meng door de pipetpunt van links naar rechts te bewegen in de elektroporatiecuvet. Incubeer de cuvet met de cellen vijf minuten op ijs.

Veeg vervolgens de buitenkant van de cuvet af met het weefsel en pulseer de cellen volgens de parameters voor budding gist zoals voorgesteld door de fabrikant van uw specifieke electroporatieapparaat. In deze demonstratie wordt een BioRad Gene Pulser gebruikt met de volgende condities: een laadspanning van 1500 volt, een capaciteit van 25 micro farad en een weerstand van 200 ohm direct na het pulseren.

Voeg één milliliter ijskoud, één molair sorbitol toe aan het vet. Draag de inhoud van het vet over naar een steriele 15 milliliter buis met behulp van een steriele glazen pipettepunt. Incubeer de buis 1,5 uur bij 30 graden Celsius zonder te schudden.

Na 1,5 uur zijn de geëlektroporeerde cellen klaar om uit te platen. Voeg vijf tot 10 gesteriliseerde glazen kraaltjes toe aan elk van de vier gelabelde YPTS-platen die 100 micrograms per milliliter Zain bevatten. Verspreid 250 microliters van het elektroporatieproduct.

Meng op elke plaat en schud de plaat horizontaal om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Laat de platen 15 minuten drogen en verwijder vervolgens de kralen uit de agar door de platen om te keren. Wikkel de platen in zwart plastic om degradatie van het lichtgevoelige Zain te voorkomen en incubeer de platen ondersteboven gedurende twee tot drie dagen bij 30 °C totdat er kolonies zijn gevormd.

Selecteer 12 kolonies. Zuiver deze door de klonen uit te strijken op verse YPDS-platen die 100 µg/mL zeïne bevatten. Om PPA-cellen voor eiwitexpressie voor te bereiden, wordt een enkele kolonie van de gezuiverde pichia-kolonies geselecteerd en geïnoculeerd in 25 mL VMGY-medium in een steriele kolf van 250 mL; laat deze groeien bij 30 °C in een schudincubator totdat de cultuur een OD 600 van twee tot zes bereikt.

Wanneer de cellen de juiste OD 600 hebben bereikt, wordt er een glycerolstock van de cellen voor bewaring klaargemaakt. Breng 800 µL van de celcultuur over naar een cryovial van twee milliliter en voeg 200 µL gesteriliseerd glycerol toe. Bewaar de glycerolstock bij -80 °C.

Overbreng daarnaast 1,5 milliliters van de celkweek naar een microcentrifugebuis. Oogst de cellen door te centrifugeren bij 1300 GS gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Bewaar de pellet bij vier graden Celsius.

Deze cellen zullen worden gebruikt voor gist-DNA-zuivering om de pichia-stranden na PCR met insert-specifieke primers op een agarosegel te analyseren, om te bevestigen dat het gen van belang is geïntegreerd in het pichia-genoom. Draag de rest van de 25 milliliter cultuur over naar een 50 milliliter Falcon-buis en oogst de cellen door te centrifugeren bij 3000 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, schenk het supernatant af en plaats de buis ondersteboven op een tissue om resterende media te verwijderen; om het celpellet te wassen, resuspendeer het door te vortexen of te pipetteren in 20 milliliter BMMY-medium en centrifugeer.

Nadat het supernatant is weggegoten, wordt het celpellet opnieuw gesuspendeerd door middel van vortexen of pipetteren tot een OD 600 van 1,0 in BMMY medium om expressie te induceren. Breng de cultuur over naar een gebaffelde kolf van één liter en sluit de kolf af met een beker van 200 milliliter.

Wij raden het gebruik van baffelkolfen sterk aan, aangezien deze meer zuurstof in de cultuur brengen. Voor een efficiënte eiwitexpressie tijdens methanolinductie in het medium, wordt de kolf in de incubator geplaatst om de groei voort te zetten bij 30 °C. Het is belangrijk dat de temperatuur niet boven de 30 °C uitkomt als de temperatuur van uw incubator fluctueert.

Stel de temperatuur in op 28 °C. Voeg elke 24 uur gesteriliseerd puur methanol toe tot een eindconcentratie van 0,5% methanol om de inductie op bepaalde tijdstippen na de start van de expressie te handhaven; overbreng één milliliter van de cultuur naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer dit gedurende 2,5 minuten bij 1300 ×g. Breng bij kamertemperatuur het supernatant over naar een aparte 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Bewaar het supernatant en de celpellets bij -80 °C tot aan verdere analyse. De monsters van verschillende tijdstippen worden geanalyseerd om de optimale tijdsperiode voor eiwitexpressie na inductie vast te stellen. We tonen nu enkele representatieve resultaten van de succesvolle expressie van recombinante eiwitten met gebruik van PIA Pastis als gastheersysteem.

Deze western blot-afbeelding toont vier tot expressie gebrachte eiwitten na 24 uur expressie. Het antilichaam dat werd gebruikt voor immunoblottings was acemic HRP-antilichaam. De tweede baan is een negatieve controle en bevat supernatant van cellen die geen recombinant eiwit tot expressie brengen omdat ze getransformeerd waren met de oudervector.

We hebben zojuist aangetoond hoe u recombinante eiwitten kunt tot expressie brengen met behulp van de eukaryote gastheer PQ.Plus. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk dat uw construct is gesequenced om te bevestigen dat uw gen van belang is gekloond en in het juiste leesraam staat, en dat al uw platen en reagentia gereed zijn voordat u begint. Het is daarnaast belangrijk dat u een voldoende hoeveelheid gelineariseerd plasmide voorbereidt om een hoog aantal transformanten te verkrijgen vóór de eiwitexpressie door methanolinductie. Zorg ervoor dat u uw celpellet goed wast om alle resterende sporen van glycerol te verwijderen, aangezien dit de expressie van uw eiwit kan remmen.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met de experimenten.