Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van ontwikkelende embryo's afgeleid van oo-sites die in cultuur zijn gemanipuleerd. Dit wordt bereikt door eerst donor oo-sites van één vrouwtje te isoleren en deze naar wens in cultuur te manipuleren. De tweede stap van de procedure is om deze cyten met behulp van progesteron te stimuleren tot rijping en om potentiële gastvrouwtjes te injecteren met gonadotropine om de eiafscheiding te stimuleren.

De derde stap van de procedure is het kleuren van de donorcellen met vitale kleurstoffen en het voorbereiden van een vrouwtje om als gastheer te dienen. De laatste stap van de procedure is het chirurgisch overbrengen van de donorcellen naar de lichaamsholte van de gastheer, om enkele uren later de overgebrachte eitjes terug te winnen en te bevruchten. Uiteindelijk ontstaan er embryo's met een normale deling die zijn afgeleid van de experimenteel gemanipuleerde donor.

Cytes kunnen op dezelfde manier worden verkregen en geanalyseerd als normale embryo's. Hallo, ik ben Doug Houston van de University of Iowa. Vandaag zijn we bij de Cold Spring Harbor Xap-cursus om u te laten zien hoe u de procedure voor gastheeroverdracht uitvoert.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de rollen van maternale genproducten te bestuderen en de functies in de vroege zap-ontwikkeling te bepalen. Laten we beginnen. Controleer vóór aanvang van de chirurgische ingreep of het operatiegebied gedesinfecteerd is en of verse media en steriele instrumenten klaarstaan.

Klem een hechtnaald met de naaldhouder in de gewenste richting vast. Plaats een geanestheseerde vrouwelijke kikker op haar rug op een vochtig chirurgisch gaasje. Maak met een kleine irisschaar een incisie van één centimeter in de huid in het onderste deel van de buik, lateraal van de middellijn.

Snij niet in de buikspier. Gebruik een pincet om de spierlaag en de omliggende witgekleurde fascia op te tillen. Gebruik de irisschaar om één snelle, rechte snede door de spier te maken.

Vergroot de incisie naar één centimeter om de eierstok bloot te leggen. Gebruik een pincet om de eierstok vast te pakken en trek een lob naar buiten. Gebruik een schaar om de lob op het niveau van de lichaamswand af te knippen.

Plaats het weefsel in een schaal van 90 millimeter met oocytenkweekmedium of OCM en beoordeel onmiddellijk de kwaliteit van de eierstok onder een dissectiemicroscoop. Enkele oocyten kunnen met een pincet worden vrijgemaakt. Als de oocyten stevig zijn en een uniforme grootte en kleur vertonen, verwijder dan de gewenste hoeveelheid eierstokweefsel van de kikker en plaats dit in een Petrischaal van 90 millimeter met OCM.

Sluit de incisie. Steek de naald een paar millimeter lateraal ten opzichte van de incisie in, waarbij u er zeker van bent dat u zowel door de spier als door de fascia gaat. Gebruik een pincet om de naald te manoeuvreren, en zorg ervoor dat u het uiteinde van de hechtdraad niet volledig doortrekt.

Sluit de wond met een eenvoudige onderbroken hechting en chirurgische vierkante knopen. De techniek wordt in detail beschreven in de bijbehorende tekst. Herhaal de hechting bij de huidlaag.

Spoel het vrouwtje af met gedeïoniseerd water en plaats haar in een herstelbak gevuld met koel water. Gebruik direct na afloop van de operatie een schaar om de eierstok onder te verdelen. Snijd individuele lobben open, maak ze plat en snijd ze in vierkante stukjes van twee centimeter.

Spoel met schoon medium en gebruik een pincet. Draag vijf tot zes stukjes over naar een nieuwe 90 millimeter schaal met OCM om individuele cellen te isoleren. Begin met het overbrengen van één van de stukjes naar een kleine schaal met medium en plaats deze onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik horlogemakerspincetten om handmatig drie tot 500 oocyten te isoleren. Pak met een tweede paar pincetten de laag bindweefsel vast die een volgroeide oocyte in stadium zes omringt, vlakbij de stam. Pak de eierstok naast de oocyte vast met het eerste paar pincetten.

Trek voorzichtig over de oöcyt om de follikelhuls open te scheuren. Verwijder de cyte vervolgens voorzichtig uit het weefsel. Gedefolieerde cytes hebben geen zichtbare bloedvaten en zijn slapper dan cytes met intacte follikels.

Gebruik een vuurgepolijste pipet met een katoenen prop om groepen van 100 tot 150 oocyten over te brengen naar cultuurschalen van 60 millimeter die acht milliliter OCM bevatten. Bewaar de oocyten in hun schalen bij 18 °C. De oocyten kunnen nu naar behoefte worden gemicro-injecteerd met antisense-oligonucleotiden of mRNA's volgens diverse protocollen, om vervolgens in OCM te worden gekweekt in een incubator bij 18 °C.

Gebruik de oocyten voor transfer binnen 96 uur na isolatie op de avond voorafgaand aan de transfer. Incubeer de benodigde cyten met progesteron om ze te laten rijpen door 16 µL van 1 mM progesteron aan het medium met de cyten toe te voegen voor een eindconcentratie van 2 µM. Incubeer gedurende 10 tot 12 uur bij 18 °C op dezelfde avond en injecteer drie tot vijf vrouwtjes met 1000 units humaan choriongonadotropine per kikker om de eiafzetting te induceren.

Laat de vrouwtjes op de ochtend van de overdracht gedurende de nacht bij kamertemperatuur of 18 °C. Controleer onder de dissectiescoop of de gekweekte cytes zijn gerijpt. Voeg de vitale kleurstoffen toe en centrifugeer bij meer dan 10.000 ×g gedurende vijf minuten.

Om de achtergrondruis door debris te verminderen, voegt u 80 µL van de passende vitale kleurstof toe aan elke experimentele groep oocyten. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur op een schudplaat. Breng de gekleurde eitjes over naar een schaal van 90 mm met verse o cm en draai kort om ze te wassen.

Maak een pipette om de cyten over te brengen. Gebruik een diamantpotlood om een inkeping te maken in de pipette, ongeveer twee centimeter onder het taps toelopende gedeelte, en breek deze netjes af. Dit moet een pipette opleveren met een opening van 1,5 millimeter, net groot genoeg om een oocytenvuur te accommoderen.

Polijst de punt totdat de randen glad zijn zonder de punt te sluiten. Oocyten transplantatie. De chirurgische ingreep dient zo snel mogelijk te worden uitgevoerd.

Maak, zoals eerder beschreven, een incisie bij een geanestheseerd vrouwelijk dier dat eieren van goede kwaliteit legt. Deze incisie moet de minimale lengte hebben die nodig is om net de boring van de transferplaat te passen. Pipetteer minder dan één centimeter.

Wrijf de schaal met experimentele oocyten voorzichtig rond om ze in het midden van de schaal te verzamelen. Gebruik de voorbereide Pasteur-pipet om er zoveel mogelijk op te zuigen. Laat de oocyten naar het uiteinde van de pipet zakken om de hoeveelheid vloeistof die naar de kikker wordt overgebracht te minimaliseren.

Gebruik een pincet om één flap van spier- en fasciaweefsel vast te pakken en op te tillen. Voer de punt van de pipet in de incisie in en laat de oocyten langzaam in de lichaamsholte vloeien. Herhaal dit proces totdat alle oocyten zijn overgebracht.

Laat de spierlaag niet los om te voorkomen dat de oocyten uit de incisie lekken. Gebruik een pincet om beide zijden van de incisie vast te pakken en naar elkaar toe te brengen, zodat de cellen in de lichaamsholte kunnen zakken. Begin met het hechten van de spier- en fasci laag zoals voorheen, waarbij u erop let dat er naar boven toe spanning wordt gehouden totdat de eerste knoop is gelegd.

Hecht de huid. Spoel de kikker af met gedeïoniseerd water en laat haar herstellen zoals voorheen. De kikker zou twee tot drie uur na de operatie normaal beginnen met het leggen van eitjes.

Verzamel de eitjes door elke halve uur normaal uit te knijpen in een schaal met verzamelde eitjes, totdat het vrouwtje stopt met leggen. Voeg vier milliliters van een suspensie van vers verzameld sperma in one XMMR toe en incubeer vier minuten bij kamertemperatuur. Overspoel en spoel de eitjes grondig af met vloeistof op kamertemperatuur.

Incubeer punt één XMMR bij kamertemperatuur om activatie en splitsing mogelijk te maken. Gebruik op elk gewenst moment cysteïne om de gelei-omhulsels te verwijderen. De overgezette embryo's kunnen vervolgens, afhankelijk van de kleur, in afzonderlijke schaaltjes worden gesorteerd en als normale embryo's worden gekweekt.

Gewoonlijk zullen meer dan twee derde van de getransfereerde eitjes binnen enkele minuten na de bevruchting activeren, waarbij een robuuste corticale contractie aan de animalpool zichtbaar is. In de meeste experimenten zal meer dan de helft van de getransfereerde eitjes een normale eerste klieving ondergaan. Soms zal de klieving, op basis van onze ervaringen, ongeveer 20 minuten vertraagd zijn ten opzichte van de gast-eitjes.

30 tot 60% van de getransfereerde embryo's ondergaan een normale gastrulatie en zullen het neurale stadium overleven. De getransfereerde embryo's behouden hun kleur van de vitale kleurstof gedurende vele dagen van de ontwikkeling. Embryo's afgeleid van niet-geïnjecteerde controle-oocyten zullen er naar verwachting normaal uitzien.

Daarentegen zullen embryo's afgeleid van oocyten die zijn geïnjecteerd met bèta-catenine en antisense-oligo's, bijvoorbeeld, een gecentraliseerd uiterlijk hebben. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe embryo's kunnen worden verkregen uit oocyten die in cultuur zijn gemanipuleerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met gezonde, volgroeide donor-oocyten en gastvrouwen met eitjes van hoge kwaliteit te gebruiken. Daarnaast correleert het succes van de methode doorgaans met de snelheid waarmee de oocyten worden geïsoleerd en de chirurgische ingrepen worden uitgevoerd. Het kan daarom enige oefening kosten voordat consistente resultaten worden behaald.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.