Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van ontwikkelende embryo's afgeleid van OO-plaatsen die in culture zijn gemanipuleerd. Dit wordt bereikt door eerst donor-oo-plaatsen te isoleren van één vrouwtje en deze naar wens in culture te manipuleren. De tweede stap van de procedure is om deze cyten te stimuleren tot rijping met behulp van progesteron en om potentiële gastvrouwtjes te injecteren met gonadotropine om de eiafzetting te stimuleren.

De derde stap van de procedure is het kleuren van de donorcellen met vitale kleurstoffen en het voorbereiden van een vrouwtje om als gastheer te dienen. De laatste stap van de procedure is het chirurgisch overbrengen van de donorcellen naar de lichaamsholte van de gastheer, om enkele uren later de overgebrachte eicellen terug te winnen en te bevruchten. Dit resulteert uiteindelijk in normaal delende embryo's afkomstig van de experimenteel gemanipuleerde donor.

Cytes kunnen op dezelfde manier worden verkregen en geanalyseerd als normale embryo's. Hallo, ik ben Doug Houston van de University of Iowa. Vandaag zijn we bij de Cold Spring Harbor Xap-cursus om u te laten zien hoe u de host-transferprocedure uitvoert.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de rollen van maternale genproducten te bestuderen en de functies in de vroege ontwikkeling van zap te bepalen. Laten we beginnen. Zorg er vóór aanvang van de chirurgische ingreep voor dat het operatiegebied is gedesinfecteerd en dat vers medium en steriele instrumenten gereedstaan.

Pak een hechtnald in de naaldhouder in de gewenste oriëntatie. Plaats een geanestheseerde vrouwelijke kikker op haar rug op een vochtig chirurgisch gaasje. Maak met een kleine irisschaar een incisie van één centimeter in de huid in het onderste deel van de buik, lateraal van de middellijn.

Snijd niet in de buikspier. Gebruik een pincet om de spierlaag en het omringende witgekleurde fascia op te tillen. Gebruik de irisschaar om in één snelle beweging recht naar beneden door de spier te snijden.

Verbreed de incisie tot één centimeter om de eierstok bloot te leggen. Gebruik een pincet om de eierstok vast te pakken en trek een lob naar buiten. Gebruik een schaar om de lob af te knippen op het niveau van de lichaamswand.

Plaats het weefsel onmiddellijk in een schaal van 90 millimeter met oöcyt-kweekmedium of OCM en beoordeel de kwaliteit van de eierstok onder een dissectiemicroscoop. Een paar oöcyten kunnen met een pincet worden vrijgemaakt. Als de oöcyten stevig zijn en een uniforme grootte en kleur vertonen, verwijder dan de gewenste hoeveelheid eierstokweefsel van de kikker en plaats dit in een Petri-schaal van 90 millimeter met OCM.

Sluit de incisie. Steek de naald enkele millimeters lateraal van de incisie in, waarbij u ervoor zorgt dat u door zowel de spier als de fascia gaat. Gebruik een pincet om de naald te manipuleren en zorg ervoor dat u de staart van de hechtdraad niet volledig doortrekt.

Sluit de wond met een eenvoudige onderbroken hechtmethode en chirurgische vierkante knopen. De techniek wordt in detail beschreven in de bijbehorende tekst. Herhaal het hechten bij de huidlaag.

Spoel het vrouwtje af met gedeïoniseerd water en plaats haar in een herstelbak gevuld met koel water. Gebruik direct na afloop van de operatie een schaar om de eierstok te onderverdelen. Snijd de individuele lobben open, maak ze plat en snijd ze in vierkante stukjes van twee centimeter.

Spoel af met schoon medium en gebruik een pincet. Draag vijf tot zes stukjes over naar een schone 90 millimeter schaal met OCM om individuele cytes te isoleren. Begin met het overbrengen van één van de stukjes naar een kleine schaal met medium en plaats deze onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik horlogemakerspincetten om handmatig drie tot 500 oocyten te isoleren. Pak met een tweede pincet de laag bindweefsel vast die een volledig volgroeide oocyt in stadium zes omringt, nabij de voorraad. Pak het ovarium naast de oocyt vast met het eerste paar pincetten.

Trek lichtjes over de oöcyt om de follikellaag open te scheuren. Scheid de cyte voorzichtig en zorgvuldig van het weefsel. Defoliëerde cytes hebben geen zichtbare bloedvaten en zijn slapper dan cytes met intacte follikels.

Gebruik een vuurgepolijste pipet met een katoenen prop om groepen van 100 tot 150 oocyten over te brengen naar cultuurschalen van 60 millimeter die acht milliliter OCM bevatten. Bewaar de oocyten in hun schalen bij 18 °C. De oocyten kunnen nu naar wens worden gemicro-injecteerd met antisense-oligonucleotiden of mRNA's volgens diverse protocollen, en vervolgens worden gekweekt in OCM in een incubator bij 18 °C.

Gebruik oocyten voor transfer binnen 96 uur na isolatie op de avond voorafgaand aan de transfer. Incubeer de benodigde cyten met progesteron om ze te laten rijpen door 16 µL van 1 mM progesteron toe te voegen aan het medium dat de cyten bevat voor een eindconcentratie van 2 µM. Incubeer gedurende 10 tot 12 uur bij 18 °C op dezelfde avond en injecteer drie tot vijf vrouwtjes met 1000 units humaan choriongonadotrofine per kikker om de eiafzetting te induceren.

Laat de vrouwtjes op de ochtend van de overdracht een nacht bij kamertemperatuur of 18 °C staan. Controleer onder de dissectiescoop of de gekweekte oocyten rijp zijn geworden. Voeg de vitale kleurstoffen toe en centrifugeer bij meer dan 10 000 ×g gedurende vijf minuten.

Om de achtergrondruis door debris te verminderen, voegt u 80 µL van de geschikte vitale kleurstof toe aan elke experimentele groep oocyten. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur op een rocker. Breng de gekleurde eicellen over naar een schaal van 90 mm met verse o cm en draai kort rond om ze te wassen.

Maak een pipet voor het overbrengen van de cytes. Gebruik een diamantpotlood om een inkeping te maken in de pipet, ongeveer twee centimeter onder het taps toelopende gedeelte, en breek deze netjes af. Dit resulteert in een pipet met een boring van 1,5 millimeter, wat net groot genoeg is om een oöcyt te kunnen accommoderen.

Polijst de punt tot de randen glad zijn, zonder de punt te sluiten. Oocyttransplantatie. De chirurgische ingreep moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.

Maak een incisie zoals eerder beschreven bij een geanestheseerd vrouwelijk dier dat eieren van goede kwaliteit legt. Deze incisie moet de minimale lengte hebben die nodig is om net de boring van de transfer te passen. Pipetteer minder dan één centimeter.

Draai de schaal met experimentele oocyten voorzichtig rond om ze in het midden van de schaal te verzamelen. Gebruik de voorbereide Pasteurpipet om er zoveel mogelijk op te zuigen. Laat de oocyten naar het uiteinde van de pipet zakken om de hoeveelheid vloeistof die naar de kikker wordt overgebracht te minimaliseren.

Gebruik een pincet om één flap van de spier en fascia vast te pakken en op te tillen. Steek de punt van de pipet in de incisie en laat de oocyten langzaam in de lichaamsholte druppelen. Herhaal dit proces totdat alle oocyten zijn overgebracht.

Laat de spierlaag niet los om te voorkomen dat de oocyten uit de incisie stromen. Gebruik een pincet om beide zijden van de incisie vast te pakken en naar elkaar toe te brengen, zodat de cyten in de lichaamsholte kunnen bezinken. Begin met het hechten van de spier- en fascialaag zoals voorheen, waarbij u erop let dat u opwaartse spanning houdt totdat de eerste knoop is gelegd.

Hecht de huid. Spoel de kikker af met gedeïoniseerd water en laat haar herstellen zoals eerder beschreven. De kikker zou twee tot drie uur na de operatie normaal eitjes moeten beginnen te leggen.

Verzamel de eitjes door elke halve uur normaal te knijpen totdat het vrouwtje stopt met leggen in een schaaltje met verzamelde eitjes. Voeg vier milliliters van een suspensie van vers verzameld sperma in één XMMR toe en incubeer dit gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Spoel de eitjes uitgebreid met vloeistof op kamertemperatuur.

Incubeer punt één XMMR bij kamertemperatuur om activatie en splitsing mogelijk te maken. Gebruik op elk gewenst moment cysteïne om de gelei-coatings te verwijderen. De overgebrachte embryo's kunnen vervolgens worden gesorteerd in afzonderlijke schaaltjes op basis van kleur en als normale embryo's worden gekweekt.

Doorgaans zullen meer dan twee derde van de overgeplaatste eicellen binnen enkele minuten na bevruchting activeren, waarbij een robuuste corticale contractie aan de animalpool zichtbaar is. In de meeste experimenten zal meer dan de helft van de overgeplaatste eicellen een normale eerste klieving ondergaan. Soms zal de klieving in onze ervaring ongeveer 20 minuten vertraagd zijn ten opzichte van de gastheereicellen.

30 tot 60% van de getransfereerde embryo's ondergaat een normale gastrulatie en zal het neurale stadium overleven. De getransfereerde embryo's behouden de kleur van de vitale kleurstof gedurende vele dagen van de ontwikkeling. Embryo's afkomstig van niet-geïnjecteerde controle-oocyten zullen er naar verwachting normaal uitzien.

Daarentegen zullen embryo's die afgeleid zijn van oocyten geïnjecteerd met bèta-catenine en antisense-oligo's, bijvoorbeeld, een gecentraliseerd uiterlijk hebben. We hebben u zojuist laten zien hoe u embryo's verkrijgt uit oocyten die in cultuur zijn gemanipuleerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met gezonde, volgroeide donor-oocyten en gastvrouwtjes met eieren van hoge kwaliteit te gebruiken. Daarnaast correleert het succes van de methode doorgaans met de snelheid waarmee de oocyten worden geïsoleerd en de chirurgische ingrepen worden uitgevoerd. Het kan daarom enige oefening kosten voordat er consistente resultaten worden behaald.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.