Name: Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryos en montage van een Celadhesie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Leer de dissectie van organisator- en dierlijke pool-explantaten van Xenopus laevis embryo's en het opzetten van een celadhesie-assay. Deze methode onderzoekt celmigratie en adhesie-eigenschappen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Voorbereiden Hechting Chambers (de dag vóór de injectie / dissectie) Hechting Assay Chambers Als u een conventionele samengestelde microscoop (optische lokaliseert boven het podium), is het ncecessary om een ​​lage hoogte hechting kamer als volgt. Bij gebruik van de omgekeerde-optiek microscoop, dan &quot;NUNC Lab-Tek Chambered dekglaasje&quot; kan gewoon worden gebruikt, en sla de stappen # 1 - 2. <ol><li> Bevestig een van de &quot;pers-to-seal silicium isolator&quot; op een 40 x 24 mm dekglas. Druk stevig op de isolator om de dekglas op schone werkblad en zie van de andere kant om ervoor te zorgen dat de isolator geheel is bevestigd zonder luchtbellen. </li><li> Optioneel: Doe de hechting kamers in een glazen petrischaal met een Whatman filter papier en autoclaaf in droge-cyclus te steriliseren. Cool hen naar RT. </li></ol> Coaten van de Kamer <ol><li> Doe een 200ml druppel van de werkoplossing van cadherine (10mg/ml) of met fibronectine (20mg/ml) op het midden van een autoclaaf hechting kamer, met behulp van sigmacoated geel tips. Incubeer bij RT gedurende 4 uur. </li><li> Haal de cadherine of met fibronectine oplossing en transfer naar een 1,5 ml buis. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor de komende twee weken. </li><li> Doseer 500 ml van 4% BSA in 1x MBS-H naar de kamer te blokkeren. Incubeer bij RT gedurende 1 uur. </li><li> Zuig het BSA-oplossing. Was de kamer met 500ml 1x MBS-H twee keer. Na de tweede wasbeurt, zuigen de meeste van de MBS-H (niet volledig), en op te slaan in een gesloten verpakking bij 4 º C. Deze hechting kamer is goed voor de komende 2 - 3 dagen. </li></ol> Dissectie en dissociatie van Animal Cap Explantaten <ol><li> Incubeer de geïnjecteerde embryo&#39;s in 0.1x MBS-H, verdund van de geautoclaveerde 1x MBS-H, als niet-geautoclaveerde medium ergens draagt ​​weinig kiemen die kunnen verstoren de gedissocieerde dier dop cellen. </li><li> Maak 1x Barth&#39;s agarose platen en CMF-MBS agarose platen met 60mm gerechten, minstens evenveel als het aantal van uw monsters. Giet geautoclaveerd 1x MBS-H in 1x Barth&#39;s platen. Voor de CMF-MBS borden, giet er 10 ml van de CMF-MBS. </li><li> Als de embryo&#39;s worden stadium 8,5, start het ontleden van het dier caps in de plaat een 1x Barth&#39;s. 10 tot 15 explantaten per monsters zijn meestal genoeg voor een experiment. </li><li> Breng het dier dop explantaten naar een CMF-MBS plaat. Incubeer de explantaten voor 45 - 60 minuten tot de explantaten zijn volledig gescheiden. Gentle gemoedsbewegingen in om de 15 minuten zal helpen de dissociatie. </li></ol> Celadhesie Assay <ol><li> Zaaien van de cellen: Doseer 500ml 1x MBS-H om de hechting kamer bereid in de stappen in de bovenstaande punten, Adhesie Assay Chambers en Coating de Kamer. Breng de gedissocieerde dier dop cellen van de CMF-MBS plaat om de hechting kamer met behulp van P200 met een sigmacoated en gehakte-off geel tips. </li><li> Optioneel: Indien mogelijk, voorzichtig zuigen het medium tot ongeveer 2 / 3 tot de helft, zonder bloot cellen aan de lucht. Voeg ongeveer dezelfde hoeveelheid verse MBS-H, om ervoor te zorgen dat het medium voldoende Ca 2 + bevat en Mg 2 +. </li><li> Incubeer bij RT voor 45 - 90 minuten. Kijk dus regelmatig op de cellen te zien of ze zijn verbonden aan de onderkant. </li><li> Nu kunt u het beeld van de cellen onder een microscoop. </li><li> Zet de hechting kamer op een rooster slide glas. Breng een van de hoeken van de hechting kamer naar een hoek van het raster dia. Tel en noteer het nummer van het bijgevoegde cellen in verschillende netten. </li><li> Giet 1L van MBS-H in een grote plastic emmer (bijv. Tupperware, etc.). Voorzichtig de hechting slide kamer te maken aan de bodem van de emmer. Draai het op de orbitale schudder gedurende vijf minuten bij lage snelheid (50 - 60rpm). </li><li> Leg de hechting kamer op de grid schuift, het afstemmen van de dezelfde hoek van de kamer naar dezelfde hoek van het raster glijbaan, zoals werd gedaan in stap # 5 van deze sectie, Celadhesie Assay. Tel het aantal cellen die verbonden blijven op hetzelfde rooster die je hebt geteld voordat het wasgoed. Bereken het percentage van cellen die bevestigd blijft na het wassen. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Gemodificeerd Barth&amp;rsquo;s medium: recept voor 1 L: 5,14 g NaCl 5 mg KCl 0,2 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g HEPES, vrij zuur. Stel de pH bij naar 7,4 met NaOH. Autoclaveren.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Dit is de Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-vrije versie van MBS-H. Recept voor 500 mL: 2,57 g NaCl 37,5 mg KCl 0,1 g NaHCO&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g HEPES, vrij zuur. Stel de pH bij naar 7,4 met NaOH. Autoclaveren.</td></tr><tr><td>1% agarose/1x Barth&amp;rsquo;s platen</td><td></td><td></td><td></td><td>evenveel als het aantal monsters</td></tr><tr><td>1% agarose/CMF-MBS platen</td><td></td><td></td><td></td><td>evenveel als het aantal monsters</td></tr><tr><td>E-cadherine/Fc-chimeer</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Los 0,1 mg vaste E-cadherine op in 100 µL 1x MBS-H met 40% glycerol om een 100x masterstock (1,0 mg/mL) te maken. Bewaren bij &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Maak vlak voor gebruik een 1/100 verdunning met 1x MBS-H om een werkoplossing van 10 µg/mL te verkrijgen. Er is 200 µL van deze werkoplossing per monster nodig.</td></tr><tr><td>Fibronectine, 0,1% oplossing</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Deze kant-en-klare oplossing kan als 50x stock worden gebruikt. Maak vlak voor gebruik een 1/50 verdunning met 1x MBS-H om een werkoplossing van 20 &amp;mu;g/mL te verkrijgen. Er is 200 &amp;mu;L van deze werkoplossing per monster nodig. Ik raad het gebruik van vaste fibronectine NIET aan, omdat dit moeilijk op te lossen is bij een concentratie van 0,1% voor het maken van de stockoplossing. Hoewel deze kant-en-klare 0,1% oplossing duurder is, is deze beter voor het verkrijgen van consistente resultaten.</td></tr><tr><td>4% BSA /MBS-H</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>BSA: molecular biology grade fractie V</td></tr><tr><td>Sigmacoted gele tips</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nr. 1 dekglasjes</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm of 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Press-to-seal siliconen isolator</td><td>Instrument</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm diepte x 20 mm diameter</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 wells/slides</td></tr><tr><td>Grid-objectglas</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td>of Finder-reticule voor celtelling</td></tr></tbody></table>

ontleding van organisator en dierlijke pole explantaten van xenopus laevis embryo&#39;s en montage van een celadhesie assay

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Deze video toont de techniek die gebruikt wordt voor de voorbereiding van organisator en dier pole explantaten van Xenopus laevis embryo&#39;s, waaronder het gebruik van de wenkbrauw mes - een speciale tool gemaakt dissectie van je wenkbrauw. Het protocol voor het monteren van een adhesie-test wordt ook gegeven, die probes voor de aanwezigheid van belangrijke adhesiemoleculen op het oppervlak aanwezig organisator of dierlijke paal cellen die essentieel zijn voor een goede ontwikkeling.

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo&#39;s en montage van een Celadhesie Assay

Hallo, mijn naam is Sochi Agata. Ik ben postdoctoral onderzoeker in het laboratorium van Dr. Ken Cho bij de afdeling ontwikkelings- en celbiologie aan de University of California Irvine. Vandaag laat ik de dissectie en adhesie-assay zien van animal cap-explantaten of organizer-explantaten van XUS-kikkerembryo's.Deze procedure kan worden gebruikt om de celadhesiekenmerken en celmorfologie van cellen afkomstig van gedisseceerd weefsel te bestuderen. Deze procedure omvat de dissectie van een specifiek weefsel uit een embryo van de Xenopus-kikker, waarbij de cellen worden gedissocieerd in een calcium- en magnesiumvrij medium, waarna deze gedissocieerde cellen worden overgebracht naar condities met calcium en magnesium op een glazen objectglas dat is gecoat met celadhesiemoleculen. Met deze procedure kan het celgedrag, de celmigratie en de adhesiekenmerken van de gedisseceerde Xenopus-cellen worden bestudeerd.Voor de gehele procedure van embryo-dissectie en de adhesie-assay gebruik ik eerst speciale instrumenten. Dit is een calcium- en magnesiumvrije 1x-buffer, bespoten met 1% agro. En dit is, precies hier, een 1x-buffer, bespoten met 1% agro, waarop u het embryo disseceert.En dit is ee

dissection-organizer-animal-pole-explants-from-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.

Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer

Animal caps overexpressie genproduct (s) worden getransplanteerd om de flank van de ontwikkeling...

Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.

Dissectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neurale lijst voor<em&gt; In vitro</em&gt; Explantaatkweek of<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantatie

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo's. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.

Mucociliary Epithelial Organoids van Xenopus Embryonal Cells: Generatie, Cultuur en High-Resolution Live Imaging

Leer de dissectie van organisator- en dierlijke pool-explantaten van Xenopus laevis embryo's en het opzetten van een celadhesie-assay. Deze methode onderzoekt celmigratie en adhesie-eigenschappen.

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo's en montage van een Celadhesie Assay

Meer video's verkennen