Toepassing van Stopped-flow Kinetics Methoden om het werkingsmechanisme van een DNA Repair eiwit Onderzoek

Dit is een presentatie van twee stopped-flow-methoden voor het meten van de reactiekinetiek van het DNA-mismatch-reparatie-eiwit MutS2-MutS6. MutS2-MutS6 herkent basepaar-mismatches in DNA en signaleert reparatie in een reactie aangedreven door ATP. De eerste methode meet de binding van MutS2-MutS6 aan DNA door de toename in fluorescentie van een 2-aminopurine-base die naast een GT-mismatch in het DNA is gepositioneerd. De reactanten worden gemengd in een stopped-flow-apparaat en in de loop van de tijd gemonitord om de snelheidsconstante te bepalen.

De tweede methode meet de activiteit van Mush2-Mush6 ATPase met behulp van een fluorescent fosfaatbindend eiwitreporter. De reagentia worden gemengd in een stopped-flow apparaat en in de tijd gevolgd. Om de snelheidsconstanten voor ATP-hydrolyse en fosfaatvrijgave te bepalen, worden de resulterende kinetische gegevens gebruikt om het werkingsmechanisme van Mush2-Mush6 bij DNA-mismatchherstel te verduidelijken.

Hoi, ik ben Noah Biro van het MONI-laboratorium van de afdeling moleculaire biologie en biochemie aan de Wesleyan University. Hoi, ik ben DJ J, ook van het laboratorium van Man aan de Wesleyan University. En ik ben Chris Dset, ook van het laboratorium van JI.

Vandaag laten we u twee op fluorescentie gebaseerde assays zien om de kinetiek van een reactie op een tijdschaal van milliseconden te monitoren. We gebruiken deze methoden in ons laboratorium om te bestuderen hoe het DNA-reparatie-eiwit MutSα mismatched baseparen in DNA bindt en de reparatie initieert. Laten we beginnen.

Voordat deze procedure kan beginnen, moeten de benodigde eiwit- en DNA-reagentia direct beschikbaar zijn. Verkrijg s visier mush two mush six eiwit dat eerder is overgeëxprimeerd in coli en is gezuiverd via ionenuitwisselings- en affiniteitschromatografie. Om de DNA-reagentia te genereren, dient enkelstrengs DNA te worden aangeschaft, gemodificeerd met de fluorescente nucleotide-analogon 2-aminopurine; zuiver de strengen via denaturerende polyacrylamide-gelelektroforese en anneal deze om gemistmatcht duplex DNA te genereren met 2-aminopurine direct naast een GT-mismatch.

Bereid op dezelfde wijze ongelabeld DNA voor vanuit ongewijzigd enkelstrengs DNA. De gebruikte DNA-sequenties zijn terug te vinden in het geschreven gedeelte van dit protocol. Waarborg gedurende deze procedure een hoge experimentele integriteit door hoogwaardige chemicaliën te gebruiken om fluorescerende onzuiverheden te minimaliseren.

Filter daarnaast alle stamoplossingen door een membraan van 0,2 micrometer om partikels te verwijderen die het stopped-flow apparaat zouden kunnen verstoppen. Bereid voor de DNA-bindingsexperimenten monsters voor met een eindvolume van 400 microliters per monster, wat voldoende is voor ongeveer 10 kinetische traces. Bewaar de monsters op ijs.

Om de eiwitactiviteit te behouden, bereid het DNA-monster voor op een concentratie van 0,12 micromolar en het Mush2Mush6-monster op een concentratie van 0,8 micromolar in DNA-bindingsbuffer. Dit zal resulteren in uiteindelijke concentraties van 0,06 micromolar DNA en 0,4 micromolar Mush2Mush6 na een één-op-één menging in de stopped-flow.

Een stopped-flow instrument maakt gebruik van een aandrijfmotor om de reactantoplossingen gelijktijdig en snel vanuit de aandrijfspuiten in een menginrichting te persen. De gemengde oplossing stroomt vervolgens naar een observatiecel voor gegevensverzameling om het instrument voor te bereiden. Controleer eerst of de computer en de controller zijn uitgeschakeld.

Zet vervolgens het circulerende waterbad aan om de lamp te koelen en ontsteek de lamp. Stel de monochromator in op de gewenste excitatiegolflengte, namelijk 315 nanometer. Stel voor twee aminopurine de SL-breedte in op de gewenste waarde.

Plaats een filter met een cutoff van 350 nanometer bij de fotomultiplierbuis of PMT om het fluorescentiesignaal van de twee aminopurines op te vangen. Zet de controller en de computer aan. Zet vervolgens het circulerende waterbad aan.

Dit vult de watermantel rond de aandrijfspuiten om de gewenste temperatuur tijdens het experiment te handhaven. Voer ten slotte het stop-flowprogramma uit onder het menu voor P-M-T-H-V-besturing. Stel de PMT-spanning in, die aanvankelijk kan variëren om de PMT-gevoeligheid aan te passen, maar vervolgens constant moet worden gehouden.

Meet tijdens het experiment de donkerstroom om te corrigeren voor elektrische achtergrondruis. Was vervolgens de aandrijfspuiten van de stopped-flow en de observatiecel. Zet het monsterlaadventiel in de laadpositie.

Vul een spuit van één milliliter met gedeïoniseerd gefilterd water. Bevestig de spuit aan de vulpoort onder de aandrijfspuit en druk het water tussen de twee spuiten door. Herhaal dit proces tweemaal voor beide spuiten.

Aandrijfspuit voor gebruik in het experiment. Vul vervolgens de aandrijfspuiten met water om de observatiecel te spoelen. Zet het monsterlaadventiel in de 'fire'-positie.

Gebruik het commando 'adjust syringe drive' om de aandrijfplaat te laten zakken en water door de observatiecel en in de uitgangslinie te duwen. Let erop dat de zuiger niet tot aan het uiteinde van de aandrijpspuit wordt geduwd. Til tot slot de aandrijfplaat op en zet het ventiel in de laadpositie.

Spoel één keer met reactiebuffer en maak de spuiten leeg. Om te beginnen met de DNA-bindingsexperimenten, brengt u elk monster over van de buis naar een nieuwe spuit van één milliliter. Bevestig elke spuit aan een laadpoort en duw de oplossing in de aandrijfspuit.

Verwijder eventuele luchtbellen door de oplossing handmatig tussen de twee spuiten te duwen met korte tussenpauzes. Laat vervolgens de aandrijfplaat zakken tot deze de bovenkant van de aandrijfspuiten raakt. Open voor de gegevensverzameling het venster voor de ingestelde tijdkanalen.

Selecteer de modus van het gegevensverzamelkanaal voor de data-analyse en het aantal te verzamelen traces. Voer de gegevensverzameltijd in waartijdens 1000 datapunten worden verzameld. Zet vervolgens de klep in de vuurpositie en klik op de knop voor gegevensverzameling.

Deze actie start het mengen van mush twee, mush zes en DNA, waarna de reactie in de observatiekamer wordt gebracht. De fluorescentie-emissie van de cellen vanuit 2-aminopurine wordt gemonitord. Verzamel ten minste vijf kinetische traces om een hoogwaardige dataset te verkrijgen en sla het bestand op wanneer het experiment is voltooid.

Open elk gegevensbestand en bereken het gemiddelde van meerdere kinetische traces. Sla vervolgens het gemiddelde gegevensbestand op en exporteer dit naar een grafisch programma voor analyse. Zet tot slot de lamp uit en spoel de spuiten en de observatiecel grondig uit met water.

Schakel vervolgens de rest van de apparatuur uit, behalve het circulerende waterbad. Dit blijft nog 15 minuten aanstaan om de lamp te koelen. De kinetische gegevens voor de binding van mush twee mush zes aan gemistapt DNA worden het best benaderd door een enkele exponentiële functie, wat resulteert in een snelle associatiesnelheid in de orde van 10 ⁷ per molar per seconde; analoge stopped-flow-experimenten leveren de dissociatiesnelheid van het mush twee mush zes gemistapt DNA-complex op, die zeer traag verloopt met 0,01 tot 0,02 per seconde.

Deze resultaten bieden een directe maat voor de snelheid en affiniteit waarmee MutS2-MutS6 een gemisteld basenpaar bindt tijdens de DNA-reparatiereactie. Vervolgens zal een stopped-flowexperiment worden uitgevoerd om de ATPase-activiteit van MutS2-MutS6 te meten.

Onder de pre-steady-state condities voor deze assay is het absoluut essentieel om het gebruik van glas in alle stadia van de reagensbereiding te vermijden, inclusief eiwit- en DNA-zuivering, om de achtergrondniveaus van fosfaat te minimaliseren. Fosfaatbindend eiwit of PBP, dat is gezuiverd uit E. coli en gelabeld met de MDCC-fluorofoor, wordt gebruikt als reporter om de fosfaatvrijgave na een ATP-hydrolyse te meten. MDCC-PBP is een robuuste reporter van pre-steady-state ATP-hydrolyse en fosfaatvrijgavekinetiek. Het bindt vrij phosphate snel en met een hoge affiniteit, wat resulteert in een grote toename van de MDCC-fluorescentie.

Bereid een monster voor met vier micromolaire mush, twee mush six-eiwit met of zonder zes micromolaire mismatch-DNA. Bereid een ander monster voor met één millimolaire vers opgeloste HEP en 20 micromolaire M-D-C-C-P-V-P om eventueel contaminerend fosfaat te verwijderen. Voeg purine-nucleoside-fosforylase en zeven methylguanine toe aan de monsters en laat deze gedurende ten minste 20 minuten op ijs incuberen.

Bereid het stopped-flow apparaat voor zoals eerder beschreven. Verwijder daarnaast eventuele fosfaatverontreinigingen uit de aandrijfspuiten met purine, nucleoside, fosforyl en zeven-methylguanine. Incubeer gedurende 20 minuten. Stel de excitatiegolflengte in op 425 nanometers en gebruik een 450 nanometer cutoff-filter met de PMT voor de detectie van M-D-C-C-P-B-P fluorescentie.

Vul de aandrijfspuiten met de monsters zoals eerder beschreven. Stel de parameters voor gegevensverzameling in en klik op 'collect data' om mush twee mush zes te mengen met een TP en M-D-C-C-P-B-P; monitor de fosfatvrijgave door mush twee mush zes en de gekoppelde toename in M-D-C-C-P-P-P fluorescentie in de loop van de tijd. Verzamel ten minste vijf kinetische traces om een dataset van hoge kwaliteit te verkrijgen en sla het bestand op; bereken het gemiddelde van meerdere kinetische traces en exporteer het gegevensbestand voor analyse zoals eerder beschreven. Maak een kalibratiecurve om de lineaire relatie tussen de fosfaatconcentratie en M-D-C-C-P-P-P fluorescentie te bepalen; meng eerst M-D-C-C-P-P-P met verschillende fosfaatconcentraties onder dezelfde experimentele condities in de stopped flow.

Zet vervolgens de maximale M-D-C-C-P-P-P fluorescentie uit tegen elke fosfaatconcentratie voor de kalibratiecurve en gebruik de helling om de fosfaatconcentratie in de Mush2-Mush6 reacties te bepalen. Zet de fosfaatconcentratie uit tegen de tijd en fit de gegevens aan een exponentiële en lineaire functie. Deze functie beschrijft een burst van pre-steady-state ATP-hydrolyse en fosfaatvrijgave, gevolgd door de lineaire steady-state fase van de reactie. De kinetische gegevens tonen aan dat Mush2-Mush6 ATP hydrolyseert en fosfaat snel vrijgeeft met een snelheid van 1,4 per seconde in de eerste katalytische omzetting.

Hierop volgt een langzame stap in de reactie die daaropvolgende omzettingen beperkt tot een zevenmaal tragere, steady-state katalytische constante van 0,2 per seconde. Wanneer mush to mush six echter gebonden is aan mismatch DNA, wordt de burst van ATP-hydrolyse en fosfaatvrijgave onderdrukt. Deze resultaten tonen direct aan dat bij binding aan een gemistst basepaar en DNA, mush too mush six overschakelt naar een ATP-gebonden toestand.

Deze overschakeling is een cruciale stap in de DNA-herstelreactie. We hebben zojuist aangetoond hoe een stop-flow instrument kan worden gebruikt om de kinetiek van een reactie in real-time te meten. Dergelijke metingen hebben ons begrip van het werkingsmechanisme van MASH two, MASH six en DNA-mismatchherstel vergroot.

Bij het uitvoeren van dit soort experimenten is het belangrijk om kwalitatief hoogwaardige reagentia te gebruiken, waaronder zeer zuiver DNA en eiwit, en speciale zorg te besteden aan het voorkomen van fosfaatcontaminatie in de ATP-assay. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.