Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters
2 juni 2010
We zien een donker veld microscopie op basis van Gabor-achtige filter om subcellulaire dynamiek maatregel binnen enkele levende cellen. De techniek is gevoelig voor veranderingen in de structuur van de organellen, zoals mitochondriën fragmentatie.
In deze video wordt optische verstrooiingsmicroscopie gebruikt om mitochondriale fragmentatie tijdens apoptose te kwantificeren. Hoewel optische verstrooiingsmicroscopie in dit protocol normaal gesproken geen fluorescentie vereist, worden er fluorescente beelden gemaakt voor validatiedoeleinden. Na het instellen van het beeldvormingssysteem, worden cellen gelabeld met MIT tracker groen en behandeld met stor sporin om apoptose te induceren.
Optische gegevens worden verzameld om veranderingen in de oriëntatie van cellulaire organellen binnen twee uur te detecteren. Het begin van mitochondriale fragmentatie kan worden gemeten met behulp van de optisch verstrooide gegevens, die een afname in de mate van oriëntatie van subcellulaire deeltjes laten zien. De gegevens worden vervolgens gevalideerd door de optisch verstrooide gegevens te correleren met de fluorescente gebieden die mitochondriën bevatten.
Hallo, ik ben Nada Bustani van het Bio Optics Laboratory in de afdeling Biomedische Techniek van Rutgers University. Ik ben Rob Pak van het Bio Optics Lab, en ik ben Deen ook van Bio Lab. Vandaag laten we je een procedure zien voor het kwantificeren van subcellulaire morfologische dynamica met behulp van een methode die niet afhankelijk is van fluorescerende kleurstoffen.
We gebruiken deze techniek in ons laboratorium om dynamische veranderingen in subcellulaire structuur tijdens apoptose of geprogrammeerde celdood te bestuderen. Dus laten we beginnen. Begin deze procedure door handschoenen gedurende 70% ethanol te steriliseren.
Plaats vervolgens een voorbereide 100 nano molare stockoplossing van miot tracker groen en voorverwarmd BAEC celcultuurmedium in de kap met het licht uit en steriliseer alle oppervlakken. Plaats vervolgens een zes-wells kweekschaal met cellen geplaatst op dekglas onder de kap. Gebruik een paste pipet verbonden met een vacuümlijn.
Verwijder het cellmedium uit de wells. Voeg vervolgens onmiddellijk twee milliliter van het gelabelde medium toe aan elke well om cellen te labelen. Mitochondriën. Bedek de weefselkweekplaat om blootstelling aan direct daglicht te voorkomen en plaats de cellen snel terug in de incubator.
Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius terwijl de cellen incuberen. Bereid eerst de optische opstelling voor, zet de kwikboogklemmen aan. Zet vervolgens de computermicroscoopcamera's en laserplug in het digitale micro-spiegelapparaat of DMD in de draaiende diffuser.
Kijk vervolgens door de microscoopoculaire om te zien of de optische lancering is uitgelijnd. Het gezichtsveld moet helder worden verlicht door laserlicht. Om het monster te laden, plaatst u één tot twee kleine druppels immersieolie boven een 63 x olie-immersieobjectief terwijl deze helemaal naar beneden gaat.
Plaats vervolgens op de stage een dia met een raster van lijnen op regelmatige intervallen van 10 micrometer, genoemd de gradi, en verhoog het objectief zodat de olie het in focus grijpt. Focus vervolgens de zeshoekige rand van het veld van de condensator. Stop zodat het is uitgelijnd in centrale Kohler-verlichting.
De zeshoekige rand moet in het oculaire worden gecentreerd en scherp gefocust. Gebruik vervolgens de positieknoppen van de veldstop van de condensator om het veldstop over het gezichtsveld te centreren. Start IP lab en voer de instellingen in om de camera te bedienen.
Bevestig dat de camera is ingesteld op frametransfermodus. Voer de opdrachten focus opnemen uit om live-preview te starten. Stel vervolgens de indexvoorvoegsel en de locatie van het bestand in waarnaar de afbeeldingen worden opgeslagen.
Start vervolgens RS image. Bepaal de instellingen om de cool snap camera te bedienen. De klokmodus moet op normaal worden ingesteld.
Start de DMD-software. Plaats de donkerveldiris op het scriptmenu. Klik vervolgens op laden en resetten.
Om het script handmatig te starten, stelt u de microscoop optiv-balk in de viewport in op LSM. Dit stuurt het beeld door de DMD in de uitgelijnde optica. Het projecteert het donkerveldbeeld op de CCD van de Cascade Five 12 camera.
Het donkerveldbeeld zou op de live-preview in IP lab moeten verschijnen. Als dat nodig is, focus het beeld op de live-preview. Stel de belichtingstijd hoog genoeg in om minimaal 10.000 tellen signaal in het beeld te garanderen.
Neem vervolgens een momentopname van het gezichtsveld met behulp van de opdracht enkele opname na verwerving. Gebruik de opdracht opslaan als geïndexeerd om de afbeelding op schijf op te slaan. De afbeelding van de GTI meet de grootte van het gezichtsveld.
Verplaats nu de GTI-steekproef zodat deze zich buiten het gezichtsveld bevindt en alleen de achtergrond zichtbaar is. Vang een achtergrondafbeelding van het veld met een belichtingstijd die voldoende is om minimaal 5.000 tellen te verkrijgen. Deze afbeelding zal helpen bij achtergrondafschrijving van de ongefilterde beelden.
Laad nu om Gabor-gefilterde beelden van de achtergrond te verkrijgen, het Gabor Filter Bank-script naar de DMD-besturingssoftware. Voer het hele script uit om de filters naar het onboardgeheugen van de DMD te bufferen. Dit kan een paar minuten duren zodra het hele script is gebufferd.
Gebruik de start- en stopmarkeringen binnen de DMD-software om ervoor te zorgen dat er slechts één set filters die overeenkomt met één Gabor-achtige filter tegelijk wordt geladen. Voer het script uit om gefilterde beelden van de achtergrond te verkrijgen. De live beeldvoorbeeld zou van donkerveld naar het gefilterde beeld moeten veranderen.
Voor die filter opent u het acquisitiescript in IP lab vanaf schijf. Pas de belichtingstijd aan om ervoor te zorgen dat er minimaal 2000 tellen worden verkregen. Terwijl het DMD-script wordt uitgevoerd, annuleert u de live-preview in IP lab en voert u het acquisitiescript uit.
Dit verwerft automatisch index en slaat het gefilterde beeld op schijf op. Zodra de eerste afbeelding is verkregen, stopt u het script dat in DMD loopt. Verwijder de gebruikte opdrachten uit het script.
Vervang vervolgens de start- en stopmarkeringen aan het begin en einde van de volgende filterset. Herhaal de acquisitie in IP lab totdat de hele filterbank is gebruikt en alle gefilterde beelden zijn verkregen en opgeslagen. Bereid de cellen voor op platen door een soldeerbout
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een donkerveldmicroscopiemethode die gebruikmaakt van Gabor-achtige filtering om subcellulaire dynamiek in levende cellen te beoordelen. De techniek is bijzonder gevoelig voor veranderingen in organelstructuren, zoals mitochondriale fragmentatie tijdens apoptose.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Mitochondriale fragmentatie is een belangrijke indicator voor apoptose.
- Traditionele microscopiemethoden vereisen vaak fluorescentie, wat hun toepassing beperkt.
- Optische scattermicroscopie biedt een niet-invasief alternatief.
- Het begrijpen van organeldynamiek is cruciaal voor inzichten in de cellulaire gezondheid.
Doel van de studie
- Om mitochondriale fragmentatie te kwantificeren met behulp van optische scattermicroscopie.
- Om optische gegevens te valideren met fluorescentie-beeldtechnieken.
- Om het begrip van subcellulaire dynamiek tijdens apoptose te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Cellen gelabeld met MIT tracker green.
- Behandeling met storosporine om apoptose te induceren.
- Verzamelen van optische gegevens om de oriëntatie van organellen te monitoren.
- Correlatie van optische gegevens met fluorescentiebeelden voor validatie.
Belangrijkste resultaten
- Optische scattermicroscopie detecteert effectief mitochondriale fragmentatie.
- De gegevens tonen een afname in de oriëntatie van subcellulaire deeltjes aan.
- Fluorescente validatie bevestigt de nauwkeurigheid van de optische metingen.
- De methode biedt inzicht in de dynamiek van organellen tijdens apoptose.
Conclusies
- De Gabor-achtige filtermethode verhoogt de gevoeligheid van donkerveldmicroscopie.
- Deze techniek kan worden toegepast om diverse cellulaire processen te bestuderen.
- Inzicht in mitochondriale dynamiek is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Optische scatter-microscopie met behulp van tweedimensionale Gabor-filters maakt labelvrije kwantificering van subcellulaire structurele dynamiek mogelijk, zoals mitochondriale fragmentatie tijdens apoptose, waardoor een niet-invasieve methode ontstaat om de morfologie en functie van organellen in levende cellen te beoordelen. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie en mechanische risicoreductie in vroege discovery-fasen door kwantitatieve, reproduceerbare read-outs te bieden van subcellulaire veranderingen die correleren met functionele uitkomsten, zonder afhankelijkheid van fluorescente labels of complexe inverse scattering-modellen. De compatibiliteit van de techniek met bestaande microscopieplatformen en de mogelijkheid voor snelle screening faciliteren translationele continuïteit van discovery naar preklinische studies, wat het voorspellend vertrouwen in pathway-modulatie en compound-screening verhoogt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door veranderingen in de oriëntatie van organellen te kwantificeren als een functionele readout van subcellulaire stress- of doodspaden.
- Operationele waarde: Biedt labelvrije, live-cell compatibele metingen die de experimentele variabiliteit verminderen en reproduceerbare beoordelingen van target engagement ondersteunen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door verbinding-geïnduceerde morfologische veranderingen te koppelen aan apoptotische progressie via correleerbare optische signaturen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve aspectratio-kaarten uit Gabor-gefilterde beelden die dienen als objectieve, high-content morfologische parameters voor compound screening.
- Operationele waarde: Maakt snelle acquisitie van gefilterde beelden over honderden cellen mogelijk zonder hoge bemonsteringspercentages, wat schaalbare assay-formaten ondersteunt.
- Assay-gereedheid: De output wordt direct afgeleid van de veldtransformatie van het object, waardoor discretisatiefouten worden vermeden en consistente, labelvrije morfologische profilering mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Correleert optische scattergegevens met fluorescentievalidatie om een vertaalbare biomarker van organeldynamiek vast te stellen die toepasbaar is op diverse modelsystemen.
- Preklinisch Nut: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door vroege, meetbare indicatoren te verschaffen van door verbindingen geïnduceerde subcellulaire reorganisatie.
- Mechanistisch Inzicht: Biedt onderscheidende morfometrische parameters die de grootte, vorm en oriëntatie van organellen weerspiegelen zonder dat theoretische scattermodellen voor niet-sferische structuren vereist zijn.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door labelvrije beoordeling van subcellulaire dynamiek mogelijk te maken, van vroege hypothesetoetsing tot lead-optimalisatie, waarbij morfologische veranderingen dienen als functionele proxies voor padmodulatie en cellulaire gezondheid.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van pathways door het kwantificeren van verschuivingen in organeloriëntatie die gekoppeld zijn aan apoptose en differentiatie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten (bijv. aspectratio, oriëntatiekaarten) die vergelijking van compound-effecten over populaties mogelijk maken.
- Analytics: Biedt statistische distributies van morfologische parameters die teams helpen om condities te vergelijken en significante verschuivingen in de subcellulaire organisatie te identificeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie via correleerbare optische en fluorescentiesignalen, wat de afstemming van biomarkers voor organelstressresponsen ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare platformmogelijkheid op bestaande microscopen, waardoor de afhankelijkheid van gespecialiseerde fluorescentie-infrastructuur wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit te verminderen via directe, labelvrije meting van organelldynamiek.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via platform-agnostische implementatie en minimale monstervoorbereiding.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroege detectie mogelijk te maken van subcellulaire veranderingen die voorafgaan aan functionele uitkomsten, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering door objectieve, kwantitatieve morfologische gegevens te leveren ter ondersteuning van beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de uitlijning van de optische opstelling, inclusief laserbelichting, DMD-programmering en Kohler-instelling voor een optimale signaalacquisitie.
- Afhankelijk van instrumentatie die in staat is tot ruimtelijke lichtmodulatie (bijv. DMD) en gesynchroniseerde beeldacquisitiesystemen voor sequentiële filtergebaseerde beeldvorming.
- Vereist standaardisatie van beeldacquisitieprotocollen, belichtingstijden en de volgorde van de filterbanken tussen teams om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan optimalisatie van de belichtingsintensiteit en filterparameters vereisen, op basis van de subcellulaire brekingsindex en verstrooiingseigenschappen.
- Praktische beperkingen omvatten gevoeligheid voor out-of-focus licht en de noodzaak van een stabiele omgevingscontrole tijdens langdurige live-cell imaging.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:26
Protocol
2:18
Preparing the Optical Setup
6:57
Plating the Cells
5:26
Loading the Filterbank and Using the Setup to Acquire Filtered-Background Images
9:44
Performing Optical Scatter Microscopy
11:53
Representative Images
14:28
Conclusion
