Name: Linearisatie van de Bradford Protein Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Leer een geoptimaliseerde Bradford-eiwitbepaling met linearisatieprocedure voor nauwkeurige eiwitkwantificatie in biochemisch onderzoek. Deze methode verhoogt de gevoeligheid tien keer en vermindert detergentinterferentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit document is gewijd aan de nagedachtenis van wijlen dr. Zvi Selinger, die gastheer van de originele onderzoek hier beschreven.

Linearisatie van de Bradford Protein ijklijn: De Coomassie briljant blauw eiwit assay, algemeen bekend als de Bradford assay 1, wordt op grote schaal gebruikt vanwege de snelle en handige protocol, alsook de relatieve gevoeligheid. Helaas is er een grote mate van kromming over een breed scala van proteïne concentraties (afb. 1). Daarom is slechts een beperkt aantal relatief hoge concentraties van eiwitten, 2-10 mg / ml BSA, gebruikt voor de kalibratie grafiek, die beter past dan lineaire regressie (afb. 1, groen). Echter, de niet-lineariteit vereist eiwit concentratie van de onbekende monsters te vallen binnen de beperkte bereik van de ijklijn om een ​​grote fout te vermijden, en het vermindert ook de nauwkeurigheid van het beperkte bereik. De niet-lineariteit vormt een ernstig probleem in het bijzonder wanneer microgram hoeveelheden eiwit niet beschikbaar zijn, en het vereist vaak meerdere verdunningen van de onbekende monsters. Zoals vermeld in de oorspronkelijke Bradford papier, "de bron van de niet-lineariteit is in het reagens zelf omdat er een overlap in het spectrum van de twee verschillende kleuren vormen van de kleurstof." 1. In feite drie vormen van de Coomassie briljante blauwe kleurstof worden in zuur-base evenwicht op de gebruikelijke zure pH-waarde van de test 2. De rode, blauwe en groene formulieren hebben absorptie maxima bij 470, 590, en 650 nm, respectievelijk (afb. 2). De blauwe is de vorm die het eiwit bindt, de vorming van een complex dat intens licht absorbeert bij 594 nm 3, 4 (afb. 2). Bradford merkte ook op dat "de achtergrond waarde voor het reagens steeds neemt af naarmate er meer kleurstof is gebonden aan eiwit" 1 (afb. 3). We daarom geprobeerd om de vermindering van de 590 nm achtergrond berekenen als toenemende hoeveelheden eiwit worden toegevoegd, door het meten van de verandering van de absorptie bij 450 nm, waar het eiwit-dye complex niet absorberen. We vonden dat de dalende achtergrond gedeeltelijk, maar niet volledig, is goed voor de niet-lineariteit (afb. 4). Vervolgens hebben we de hypothese dat de daling in de vrije kleurstof concentratie een vervorming van de lineaire respons produceert, want zoals eiwit-dye binding in evenwicht is 5, complexvorming niet alleen afhankelijk van de concentratie van de vrije eiwit, maar ook op die van de vrije kleurstof (Fig. 5). Rekening houdend met zowel kwesties met betrekking tot de variabele concentratie van de kleurstof vrij, ontwikkelden we een wiskundige vergelijking die een lineair verband tussen eiwit-concentratie en de verhouding van absorptie metingen, 590 nm meer dan 450 nm (Fig. 6) beschrijft. Een gedetailleerde beschrijving van de theoretische en experimentele studie kunt u vinden in onze publicatie uit 1996 in Analytical Biochemistry 6. De wiskundige vergelijking was experimenteel getest en een lineaire kalibratiecurve over het gehele eiwitconcentraties bereik (Fig. 7) opleveren. Bovendien werd de vergelijking ook gevalideerd door een onafhankelijke bepaling van de juiste pH-afhankelijke waarde van de Y-as intercept 6. Gedetailleerd protocol voor de verbeterde Bradford Protein Assay, met behulp van een Microplate Absorptie Reader: <ol><li> Bereid een 0,1 mg / ml stamoplossing van de standaard, bovine serum albumine. Een andere standaard kan worden gekozen, maar er rekening mee dat dezelfde norm moet worden gebruikt in alle experimenten. </li><li> Verdun de onbekende monsters in gedeïoniseerd water. Streven naar 50 tot 50 ug / ml. Toch, hoger of lager eiwitconcentraties zijn aanvaardbaar, omdat er geen duidelijke grens voor de lineaire bereik van de test. Wel moet de meting worden in het lineaire bereik van de absorptie lezer. </li><li> Verdun de Bradford reagens (Bio-Rad) 2,5-voudige in gedeïoniseerd water. </li><li> Voeg 0 en 10-50 ul van BSA voorraad oplossing voor het drievoud putten (het creëren van een 0-5 microgram BSA kalibratie-curve). Aan te vullen met gedeïoniseerd water tot 100 ul bereik / goed. </li><li> In verschillende bronnen, voeg 100 ul van onbekende monster in triplo. Verschillende concentraties van het onbekende monster kan worden gebruikt om de nauwkeurigheid te verhogen. </li><li> Voeg 100 ul van de verdunde Bradford reagens aan alle putjes. Totale volume is 200 pl / well. </li><li> Wacht tenminste 5 min, maar niet meer dan 60 minuten voor kleur ontwikkeling. </li><li> De Blank moet 200 pl van gedeïoniseerd water (en niet de nul eiwit kleurstof goed) zijn. </li><li> Meet de absorptie bij 590 nm en bij 450 nm. </li><li> Maak een ijkgrafiek door de netto absorptie waarden bij 590 nm en bij 450 nm. Merk op dat de nul-eiwit (dye alleen) waarde moet worden opgenomen als een data punt (afb. 8). </li><li> Bereken de concentratie van het onbekende monster op basis van de lineaire vergelijking van de ijklijn (Fig. 9). </li></ol> Representatieve resultaten: In tegenstelling tot de absorptie bij een golflengte van 590 nm, de verhouding van absorptiewaarden, 590 nm meer dan 450 nm, is lineair wet eiwitconcentratie (afb. 10). Het eiwit concentratie van het onbekende monster kan eenvoudig worden berekend met behulp van lineaire vergelijking van de ijklijn (Fig. 10, vergelijking). Het is echter een grotere nauwkeurigheid verkregen door het meten van een aantal onbekende monster verdunningen. Te dien einde, voor te bereiden twee grafieken. De eerste is een ijklijn voor de standaard met ug eiwit op de X-as (fig. 11, rechts). De tweede grafiek is voor het onbekende monster, met pi van het origineel onverdund monster op de X-as (fig. 11, links). De kleurstof enige waarde moeten worden opgenomen in beide grafieken (fig. 11). Het eiwit concentratie van het onbekende monster wordt verkregen door deling van de hellingen van het onbekende monster en de standaard (afb. 11, vergelijking). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Conventionele Bradford ijklijn. Het lineaire bereik wordt vertegenwoordigd door groene symbolen. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Spectra van het eiwit-dye complex en van de kleurstof alleen. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Protein-dye evenwicht. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vermindering van de juiste berekende achtergrond vermindert gedeeltelijk niet-lineariteit. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Protein-dye evenwicht. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Wiskundige basis voor de linearisatie van de Bradford eiwit assay. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Linearisatie van de Bradford ijklijn. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. Berekening van de Extinctieverhouding waarden. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="Figuur 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9. Een lineaire Bradford ijklijn. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="Figuur 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 10"> Figuur 10. Linearisatie van de Bradford ijklijn. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="Figuur 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 11"> Figuur 11. Onbekend monster-concentratie berekening.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

De Bradford eiwit assay is populair vanwege het gemak van de prestaties en de relatieve gevoeligheid. De linearisatie over het gehele eiwitconcentraties assortiment verkregen door het protocol hier gepresenteerde verder de assay vereenvoudigd, zoals de onbekende monsters hoeven niet te vallen binnen het bereik van de ijklijn. Belangrijk is dat de verbeterde protocol biedt verder de volgende voordelen ten opzichte van de oorspronkelijke Bradford protocol: <ol><li> Verhoogde nauwkeurigheid...

<table><tbody><tr><td>Bradford-reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate absorbantiemeter</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linearisatie van de bradford protein assay

Linearization of the Bradford Protein Assay

Bepaling van de microgram hoeveelheden van eiwit in de Bradford Coomassie brilliant blue test wordt bereikt door het meten van absorptie bij 590 nm. Deze meest voorkomende test maakt een snelle en eenvoudige eiwitten kwantificering in cellysaten, cellulaire fracties, of recombinant eiwit samples, met het oog op normalisering van de biochemische metingen. Echter, een intrinsiek niet-lineariteit compromissen de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van deze methode. Er wordt aangetoond dat onder standaard testomstandigheden, de verhouding van de absorbantie metingen bij 590 nm en 450 nm is strikt lineair met eiwit concentratie. Deze eenvoudige procedure verhoogt de nauwkeurigheid en verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, waardoor de kwantificering tot 50 ng van runder serum albumine. Bovendien is de storing vaak geïntroduceerd door detergenten die gebruikt worden om de cellysaten creëren sterk verminderd door het nieuwe protocol. Een lineaire vergelijking ontwikkeld op basis van massa-actie en Beer de wet past perfect bij de experimentele data.

De nauwkeurigheid en gevoeligheid van eiwit vaststelling door de snelle en handige Bradford assay in gevaar wordt gebracht door intrinsieke niet-lineariteit. We tonen een eenvoudige procedure die linearisatie verhoogt de nauwkeurigheid, verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, en vermindert de inmenging van wasmiddelen.

Linearisatie van de Bradford Protein Assay

De bepaling van microgramhoeveelheden eiwit in de Bradford Coomassie brilliant blue-assay wordt gerealiseerd door de meting van de absorptie bij 590 nm. ...

De Bradford-proteinassay begint met het toevoegen van een BSA-standaard in toenemende hoeveelheden en verdunningen van een onbekend monster aan een 96-wellsplaat; er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het variabele volume aan te vullen. Vervolgens wordt het Bradford-reagens toegevoegd aan alle wells, behalve aan de blanco, die water moet bevatten; dit wordt na vijf minuten uitgevoerd. De absorbentie wordt gemeten bij 590 nanometer voor de detectie van het proteïne-kleurcomplex en bij 450 nanometer.Voor de linearisatie van de grafiek is de verhouding tussen de absorbentiewaarden bij 590 nanometer en bij 450 nanometer strikt lineair met de eiwithoeveelheid. Hallo, ik ben van de afdeling Biochemie aan de Universiteit van Tel Aviv in Israël, ik ben Or uit het lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van een verbeterd gelineariseerd Bradford-protocol.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eiwithoeveelheid in SZaS te normaliseren, bijvoorbeeld voordat we gels laden. Laten we beginnen. In de Bradford-assay bevinden drie vormen van de Coomassie Brilliant Blue-kleurstof zich in een zuur-gebaseerd evenwicht bij de ge

linearization-of-the-bradford-protein-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.

Procedure en belangrijkste optimalisatie strategieën voor een geautomatiseerde capillaire elektroforetische gebaseerde Immunoassay-methode

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Dit protocol beschrijft hoe actinekometen op de oppervlakken van kralen kunnen worden geproduceerd met behulp van in de handel verkrijgbare eiwitingrediënten. Dergelijke systemen bootsen de uitstekende structuren in cellen na en kunnen worden gebruikt om fysiologische mechanismen van krachtproductie op een vereenvoudigde manier te onderzoeken.

Reconstitutie van op actine gebaseerde motiliteit met commercieel verkrijgbare eiwitten

Dit artikel biedt een protocol voor eiwitkwantificering met behulp van de Bradford-test en een smartphone als analytisch apparaat. Eiwitniveaus in monsters kunnen worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een foto van een microplaat die met een smartphone is gemaakt.

RGBradford: Eiwitkwantificering met een smartphonecamera

Hier beschrijven we protocollen voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS) waarbij de ubiquitine-ligases Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) en Cereblon (CRBN) betrokken zijn.  Biofysische methoden die hierin worden geïllustreerd, zijn onder meer oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC).

De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

We beschrijven een methode voor het gebruik van cyclodextrine om de uitwisseling tussen lipiden van het plasmamembraan met exogene lipiden te bemiddelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met experimenten die transmembraaneiwitten bestuderen, die zich anders gedragen in lipidevlotachtige omgevingen dan in niet-vlotachtige omgevingen.

Lipidenuitwisselingstest in levende cellen

Eiwitten binden aan filamenteuze actine (F-actine) door middel van verschillende actine-bindend modules. In deze video laten we zien de procedure van de actine co-sedimentatie, die een in vitro test routinematig gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen die binden F-actine te analyseren.

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

Leer een geoptimaliseerde Bradford-eiwitbepaling met linearisatieprocedure voor nauwkeurige eiwitkwantificatie in biochemisch onderzoek. Deze methode verhoogt de gevoeligheid tien keer en vermindert detergentinterferentie.

Linearisatie van de Bradford Protein Assay

Meer video's verkennen