Name: Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer weefselbepaling met de Animal Cap Transplantatie Assay in Xenopus laevis embryo's. Deze methode toont hoe genoverexpressie cel fate kan sturen en ectopische weefsels vormt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van onderzoek naar Blindness (Career Development Awards voor MEZ en ASV en een onbeperkte subsidie ​​aan de afdeling Oogheelkunde), de E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ en ASV) en het National Eye Institute / NIH (MEZ voorkomen , subsidies R01EY015748 en R01EY017964).

Deel I. Set-up voor de ACT-test <ol><li> Genereer afgetopt RNA voor injectie zoals voorgesteld door de fabrikant, met behulp van hun fenol: chloroform zuiveringsmethode (bijvoorbeeld mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA dat codeert voor een fluorescerend eiwit wordt gebruikt als een tracer. We overschrijven ofwel geel fluorescerend eiwit (YFP) of mCherry 5 cDNA, die in een pCS2 + expressievector. </li><li> Trek borosilicaatglas capillaire buizen aan taps toelopende glas tips met behulp van een micropipet trekker vormen. We maken gebruik van Sutter Micropipet Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), zoals eerder beschreven 6. </li><li> Maak steriele oplossingen in tabel 1 van een 10 X Marc's gemodificeerd Ringer (MMR) oplossing voorraad (10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES, 1 M NaCl, pH 7,5, geautoclaveerd en opgeslagen bij RT). </li><li> Isoleer testes van een mannelijke kikker en bewaar het weefsel bij 4 ° C in een steriele oplossing van 1X MMR / gentamicine (50 ug / ml gentamycine-sulfaat, BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Dit kan worden gedaan tot een week voor de start van het experiment, maar het is verliest de effectiviteit in de tijd. </li><li> Eileg oplossing (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma basis, 2,62 mM NaHCO 3 en 2,75 mM MgSO 4, op pH 7,6) kan worden gemaakt als een 8X voorraad, die kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal twee weken. Opmerking: pas op voor besmetting in deze oplossing, omdat dit de kwaliteit van uw eieren beïnvloeden. </li><li> Genereer injectie platen. Om dit te doen, smelten 1% agarose in 0.4x MMR in de magnetron, voeg ~ 6 ml gesmolten agarose-oplossing in 60 mm platen, zachtjes uitrollen een elastomeer mal (figuur 1) op de top van de oplossing om bubbels te voorkomen en laat afkoelen voor ongeveer 20 minuten bij RT. Voor het bepalen van de benodigde nummer, kunt u overwegen het aantal experimentele condities (bijvoorbeeld 1, YFP, 2, YFP + Noggin) en het aantal getransplanteerde gastheer embryo's nodig. Voor onze experimenten hebben we het genereren van minstens 20 getransplanteerd gastheer embryo's voor elke experimentele conditie. Bij 18-19 ° C, embryo's zal op het podium 15 voor ongeveer een uur. Als het duurt een uur uit te voeren 20 transplantaties, dan twee bevruchting tijdstippen nodig zijn, ervan uitgaande dat de gastheer embryo's accepteren alle transplantaties. Daarom zal vier injectie gerechten nodig zijn (2 x 2 exp voorwaarden bemesting tijdstippen = 4). Bewaar de platen bij 4 ° C gedurende maximaal een week. </li><li> Genereer cap isolatie platen met behulp van 1% agarose + 0,7 x MMR met schimmels als voor de injectie plaat. Maak hetzelfde aantal cap isolatie als injectie platen plus een extra bemesting per tijdstip (4 + 2 bemesting tijdstippen = 6). </li><li> Injecteren vrouwen met 500 eenheden humaan choriongonadotrofine laat op de dag op de dag voor micro-injectie. Bewaar vrouwtjes bij 16-18 ° C gedurende de nacht. </li></ol> Deel II. RNA micro-injectie van Xenopus laevis embryo's A. Voorbereiding voor micro-injectie <ol><li> Verwijder hormonaal geïnduceerde vrouwelijke en plaats ze in individuele tanks met 1X eileg-oplossing (ELS). Opmerking: we maken geen gebruik van eieren die zijn geweest in de ELS meer dan twee uur als de kwaliteit van de eieren wordt verminderd. Daarom ongeveer een uur voor in vitro fertilisatie, we leggen alle eieren uit de tank, zodat alleen vers gelegde eieren worden verzameld. </li><li> Bereid de naald voor micro-injectie door knippen uit de tip om een ​​25 tot 35 micrometer diameter te verkrijgen. Plaats de naald op de picoinjector en te kalibreren, zodat het uitdeelt 10 nL per injectie. </li><li> Stel een incubator op 14 ° C. </li><li> Zodra vrouwen hebben eieren voor ongeveer een uur, verwijder dan de eieren van de tank met behulp van een transferpipet en plaats ze in 60 mm petrischalen. Verwijder zo veel ELS uit de eieren mogelijk te zijn en te vervangen door 1X MMR. De eieren kunnen meteen worden bemest of verblijf in 1X MMR voor maximaal een uur. Voor de transplantatie assay, is het het beste om twee schotels, 80% vol van een enkele laag van eieren in maximaal bevruchten drie verschillende partijen rond 11 uur, 's middags en 1 uur. Na injectie, zullen ze worden geplaatst bij 14 ° C, zodat ze zal groeien tot de gewenste stappen voor de cap isolatie (fase 8,5-9) en transplantatie (etappe 15, zie Deel I, # 6 hierboven). </li><li> Het controleren van de kwaliteit van de testes, voeren we een vroege ochtend bevruchting (~ 8 uur), waardoor we testes uittreksel uit een ander mannetje als het sperma van de eerste is niet levensvatbaar. Let op: wij homogeniseren ~ 0,25 testes in 1 ml 1X MMR en voeg ongeveer 5 tot 7 druppels per plaat van de eicellen. </li><li> In vitro bevruchten van de eieren met gehomogeniseerde testes en een uur later, de gelei laag op de eieren met behulp van de-jelly oplossing te verwijderen (164μl 1M DTT + 10mL 1 M Tris, pH 8,8 tot 50 ml geautoclaveerd nanopure water). Wacht tot ze bij twee-cellig stadium te sorteren, die ongeveer twee uur duurt bij 18 ° C beginnen of 1,5 uur bij kamertemperatuur (22 ° C). </li><li> Met behulp van een transfER pipet, sorteren uniform gepigmenteerd en gelijkmatig verdelen embryo's, zoals getoond in de linker dier kap in figuur 3, in de bron van een injectie schaal gevuld met 0.4x BMR + 6% Ficoll. </li></ol> B. micro-injectie <ol><li> Stretch Parafilm over de bovenkant van een 60 mm petrischaal deksel. Pipetteer 2 pi van uw eerste RNA-monster op de Parafilm en zuig met behulp van de PLI-100 om uw injectienaald te vullen. Zorg ervoor om te controleren of de naald nog steeds 10 nL doseren van het monster vóór het begin van injectie. </li><li> Injecteren 20-30 twee-cellig stadium embryo's (beide blastomeren) met 500 pg YFP RNA in een schotel en je gen van belang (bijvoorbeeld 20 pg Noggin RNA) plus YFP RNA in een andere schaal 7. </li><li> Plaats 100 tot 200 niet-gespoten embryo's per tijdstip in een andere injectie schotel met de Ficoll oplossing. Verplaatsen in en uit de couveuse op hetzelfde moment als de geïnjecteerde embryo's. Dit zijn de gastheren om gebruikt te worden in deel IV. </li><li> Na injectie, incuberen alle embryo's bij 14 ° C gedurende de nacht. Herhaal dit voor alle tijdstippen. </li></ol> Deel III. Isoleer dier doppen van geïnjecteerde embryo's <ol><li> Arriveren vroeg in de ochtend om de embryo's podium. De vroegste tijdstip moet worden in fase 9. Verwijder die dat niet deden overleven. Ga verder met de volgende stappen uit te werken met elk tijdstip in batches. </li><li> Giet de Ficoll oplossing van elk bord en voeg weer 0,7 x MMR / gentamicine oplossing. Om een ​​pet isolatie schotel, voeg een flinke hoeveelheid van 0,7 x MMR / gentamicine oplossing. Los embryo's van hun injectie schotel putten met behulp van een transferpipet en plaats in de vers bereide dop isolatie gerecht. </li><li> Isoleren van dieren caps in 0,7 x MMR + gentamicine oplossing, het houden van twee of drie intacte embryo's voor enscenering. Of de Gastromaster, uitgerust met een gele punt omgebogen tot 400 micrometer, of een paar scherpe nummer 5 tang kan worden gebruikt. </li><li> Leg caps in 14 ° C incubator tot de volgende dag. De host embryo's moet worden verwijderd uit de incubator op hetzelfde moment als de caps te houden in dezelfde ontwikkelingsfase als de donor weefsel. </li></ol> Deel IV. Transplantatie van caps op flank <ol><li> Verwijder het kapje en embryo's van de eerste keer dat punt van de 14 ° C incubator en het stadium van de embryo's. Sorteer voor uniforme geel of rood fluorescerend-positieve caps, afhankelijk van de tracer geïnjecteerd (figuur 2). </li><li> Tel het aantal caps en verwijder het dubbele van het aantal van fase 12 tot 13 embryo's op een vers bereide injectie schotel met 0,7 x MMR / gentamicine oplossing. Met scherpe # 5 tang, verwijder de vitelline membraan van elkaar. Overbrengen naar de plaat met de caps, maar wees voorzichtig. Zonder hun vitelline membranen, kunnen embryo's snel los op het wateroppervlak. </li><li> Met behulp van de gastromaster (gele tip, 200-250μm gebogen draad, hoogste stand) of # 5 tang, verwijderen van een 200 pm plein aan de kant van de embryo's in stadium 14-15 (figuur 3). Daarna, snijd een kapje in de helft (met de gastromaster of de # 5 pincet) en plaats het weefsel in het gat gemaakt in de gastheer embryo. Draai de embryo tegen het goed om genezing mogelijk te maken. Doe dit voor zoveel embryo's als je kunt, terwijl ze op het podium 15. Herhaal dit voor alle tijdstippen. </li><li> Het embryo zal genezen meestal binnen 30 minuten. Verwijder de dode cellen (wit) met een zachte borstel beweging met een # 5 pincet. Groeien ze op 18 ° C gedurende de nacht. </li><li> Onder het ontleden fluorescentie microscoop, een soort embryo's met fluorescent-gelabeld, getransplanteerde weefsel. Leg ze terug bij 18 ° C te groeien tot het podium 42-43. </li><li> Verdoven van de dieren in tricaïne. Op dit punt, kunt u foto's onder een fluorescentie microscoop dissectie. Nadat je klaar bent, te repareren, sectie en immunostain of het uitvoeren van in situ hybridisatie met behulp van markers voor uw weefsel van belang. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Ontwerp van plexiglas voor het uitbrengen van het elastomeer mal wordt gebruikt voor het maken van embryo holding gerechten. Een 38 x 38 mm rond-hoekig vierkant (~ 5 mm diep) is gerouteerd uit een stuk plexiglas, dat is 50 x 50 mm vierkant en 25 mm dik. Circulaire, gelijkmatig verdeelde Wells (1,5 mm diameter) zijn geboord 1 mm diep in het plastic. Om de elastomeer mal voor de micro-injectie gerechten, we gegoten Sylgard elastomeer in het plexiglas en liet het te stollen, als per instructies van de fabrikant. Dit elastomeer mal wordt gebruikt om de injectie en cap isolatie platen te maken. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Animal cap sorteren voorafgaand aan de transplantatie is belangrijk, omdat uitdrukking kan variëren. Animal dop op de linker uitdrukt gelijkmatig mCherry het hele weefsel, terwijl de explantatie aan de rechterkant heeft vlekkerig uiting en zal worden weggegooid. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een host tadpole heeft ontwikkeld, een eye-achtige structuur op zijn flank van de getransplanteerde dieren cap-cellen. Een TL-beeld is overlayed op de helderveld beeld.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

In deze video, hebben we aangetoond onze versie van de klassieke technieken die worden gebruikt door Xenopus biologen, die we herschikt om het dier dop transplantatie assay te creëren. Bij kamertemperatuur, Xenopus embryo&#39;s ontwikkelen zich zeer snel door stadia 9 en 15. Door ze bij 14 ° C, de ontwikkeling van het embryo wordt vertraagd en nog veel meer transplantaties kunnen worden uitgevoerd in een experiment. Als het nodig is om de embryo&#39;s groeien naar oudere stadia (&gt; 42/43), dan raden ...

<table><tbody><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat capillaire buisjes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Sutter micropipet-puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinesulfaat [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard/elastomeer Kit 1.1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm polystyreen petrischaal</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>humaan choriongonadotrofine</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Pico-Injector micro-injectiesystemen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Dumostar #5 pincet</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

weefsel bepaling met behulp van de animal cap transplantatie (act) assay in xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Veel eiwitten spelen een dubbele rol in de embryonale ontwikkeling. Degenen die lot van de cel bepalen regelen in een specifiek weefsel kan ook invloed hebben op de ontwikkeling van een groter gebied van het embryo. Dit maakt de definitie van zijn rol in een bepaald weefsel moeilijk te analyseren. Bijvoorbeeld:<em&gt; Noggin</em&gt; Overexpressie in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s zorgt ervoor dat de expansie van de gehele voorste regio, waaronder het oog<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Uit dit resultaat, is het niet bekend of Noggin speelt een directe rol in het oog van vaststelling of die door het veroorzaken van een uitbreiding van zenuwweefsel, indirect Noggin oog vorming beïnvloedt. Na dit complex fenotype maakt studeren in het oog specifieke rol in het lot van de cel bepaling moeilijk te analyseren. We hebben een test die dit probleem ondervangt. Profiterend van de pluripotente aard van de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Dier cap<sup&gt; 3</sup&gt;, Hebben we een test van het vermogen van genproduct (s) te testen, zoals<em&gt; Noggin</em&gt; Of het oog veld transcriptiefactoren (EFTFs), om caps te zetten in het bijzonder weefsel of celtypes door het transplanteren van dit weefsel op de zijkant van het embryo<sup&gt; 4</sup&gt;. Hoewel we hebben gevonden of Noggin eiwit behandeling of een verzameling van transcriptiefactoren kan het netvlies lot van de cel bepalen in dierlijke caps, kan deze procedure worden gebruikt om de gen-product (en) die betrokken zijn bij het specificeren van andere weefsels en te identificeren.

Animal caps overexpressie genproduct (s) worden getransplanteerd om de flank van de ontwikkeling van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s om vast te stellen of weefsel wordt bepaald.

Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Veel eiwitten spelen een dubbele rol bij de embryonale ontwikkeling. Eiwitten die de bepaling van het cellot in een specifiek weefsel reguleren, kunnen ook de ontwikkeling beïnvloeden ...

Het algemene doel van de A CT-assay is om te testen of een gen of genen van belang het primitieve ectoderm kunnen sturen naar een specifiek cellulair lot. De procedure begint met de overexpressie van de RNA's die coderen voor een fluorescent reportergen en het gen of de genen van belang in ontwikkelende Xenopus laevis-embryo's. De volgende stap is het dissekeren van de animal cap of het primitieve ectoderm dat de overgeëxpresseerde RNA's tot expressie brengt, en deze te laten groeien tot stadium 15.De derde stap van de procedure is het verwijderen van weefsel op de flank van een gastembryo in stadium 15. De laatste stap is het transplanteren van de helft van het donor-animal cap-weefsel op de flank van het gastembryo en het laten groeien van de gast tot stadium 42 tot 43. De resultaten tonen de vorming van ectopisch weefsel, zoals oogachtige structuren, aangetoond door coupes en immunokleuring voor weefselspecifieke markers.Hallo, ik ben and sine van de afdeling Oftalmologie aan de Upstate Medical University. Vandaag laat ik u de procedure zien die wij de animal cap transplant assay noemen, die ik heb ontwikkeld in samenwerking met Mike Suber. We gebruiken deze assay in beide laboratoria om de genen te bestuderen die voldoende zijn voor oogvorming.Laten we beginnen. Ter voorbereiding van deze procedure worden de cap-RNA's voor injectie klaargemaakt door noggin of een ander gen van belang en YFP, te gebruiken als tracer, te transcriberen. Bereid daarnaast de MMR-gebaseerde oplossingen voor, een voorraad van acht x eiafzetoplossing en de naalden voor het injecteren van de embryo's.Een op maat gemaakte elastomeermallen wordt gebruikt voor het maken van schaaltjes voor het vasthouden van embryo's. Maak per experimentele conditie één injectieplaat door 1% AROS in 0,4 XMMR in een magnetron te smelten. Breng ongeveer zes milliliter van de oplossing over in een plaat van 60 millimeter.Plaats voorzichtig een elastomeervorm bovenop de oplossing om bellen te voorkomen en laat dit ongeveer 20 minuten afkoelen. Genereer bij kamertemperatuur één isolatieplaat voor de dop per experimentele conditie, met gebruik van 1% AGROS plus 0,7 XMMR met vormen zoals zojuist is getoond voor de injectieplaten. Bereid extra platen voor voor elk tijdstip.Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor details over het berekenen van de tijdspunten. Isoleer vervolgens deze weefsels van een mannelijke kikker en bewaar het weefsel bij 4 °C in een steriele oplossing van 1X MMR aangevuld met 50 µg/mL Gentamicine.Dit kan tot een week voor de start van het experiment worden gedaan, maar houd er rekening mee dat het sperma na verloop van tijd aan effectiviteit verliest, laat op de dag voor de micro-injectie. Injecteer de vrouwtjes met 500 units menselijk choriongonadotrofine. Plaats de vrouwtjes gedurende de nacht bij 16 tot 18 °C.Nu is alles gereed voor de micro-injectie de volgende dag. Begin met het verwijderen van de hormonaal geïnduceerde vrouwtjes en plaats ze in individuele tanks met één XELS. Bereid de naald voor de micro-injectie voor door de punt eraf te knippen.Om een diameter van 25 tot 35 micrometer te verkrijgen, plaatst u de naald in de PLI 100 pico injector en kalibreert u deze zodanig dat er 10 nanoliter per injectie wordt toegediend. Stel een incubator in op 14 graden Celsius door de uitgang bij deze lagere temperatuur te plaatsen na het injecteren met RNA; de ontwikkeling van het embryo wordt hierdoor vertraagd, waardoor er veel meer transplantaties in één experiment kunnen worden uitgevoerd. Verwijder ongeveer een uur voor de bevruchting de eitjes uit het aquarium. Zodra de vrouwtjes gedurende een extra uur eitjes hebben gelegd, gebruikt u een transferpipet om de vers gelegde eitjes uit het aquarium te verwijderen.Let op dat eieren die langer dan twee uur in de ELS-oplossing hebben gezeten, niet worden gebruikt. Aangezien de kwaliteit van de eieren afneemt, worden de eieren in petrischalen van 60 millimeter geplaatst. De schaal is voor ongeveer 80% gevuld met een enkele laag eieren.Verwijder zoveel mogelijk ELS uit de eicellen en vervang dit door één XMMR. De eicellen kunnen tot een uur in één XMMR blijven. Voer vervolgens in vitro fertilisatie van de eicellen uit met gehomogeniseerde testes.Het is het beste om de embryo's in drie aparte batches te bevruchten rond 11:00 uur, 12:00 uur en 13:00 uur, zodat ze kunnen uitgroeien tot het gewenste stadium: stadium 8,5 tot 9 voor cap-isolatie en stadium 15 voor transplantatie. Verwijder een uur na de bevruchting van de eitjes de geleiomhulling met D-jelly-oplossing en spoel deze grondig met 0,1 XMMR; wacht vervolgens tot de bevruchte eitjes het tweecellige stadium hebben bereikt.Om te beginnen met het sorteren, wordt een injectieschaaltje voorbereid dat gevuld is met 0.4 XMMR plus 6% F ccal. Zodra de embryo's het tweecelstadium bereiken, wordt een transferpipet gebruikt om uniform gepigmenteerde en gelijkmatig delende embryo's in de put van het injectieschaaltje te sorteren.Ga over tot micro-injectie; span eerst het profiel over de bovenkant van een 60 millimeter petrischaaldeksel. Pipetteer twee µL van het RNA-monster op de biofilm en aspireer dit. Gebruik de pico-injector om de injectienaald te vullen.Controleer voor aanvang van de injectie of de naald nog steeds 10 liters monster dispenseert. Het RNA wordt in beide blastomeren van het embryo in het tweecellig stadium geïnjecteerd. Injecteer 20 tot 30 embryo's elk met 500 picograms Y-F-P-R-N-A en plaats deze in één schaal.Inject nog eens 20 tot 30 embryo's, elk met 20 picograms Nain-RNA dat is voorgemengd met Y-F-P-R-N-A, en plaats deze in een schaaltje. Plaats daarnaast per tijdstip 100 tot 200 niet-geïnjecteerde embryo's in een ander injectieschaaltje met de FICO-oplossing. Verplaats deze embryo's op dezelfde tijdstippen in en uit de incubator als de geïnjecteerde embryo's.Dit zijn de gastheren die gebruikt worden voor het transplanteren van de kapsels na injectie. Incubeer alle embryo's gedurende de nacht bij 14 °C. Herhaal dit voor alle geplande tijdstippen.Na de incubatie gedurende de nacht kan de animal cap worden geïsoleerd. Kom vroeg in de ochtend om de embryo's te stadieren. Vergeet niet om ook de niet-geïnjecteerde gastembryo's uit de incubator te halen.Het vroegste tijdstip moet stadium negen zijn. Verwijder eerst de embryo's die niet zijn overleefd. Ga vervolgens over tot het isoleren van de dierpolecaps van de levensvatbare embryo's, waarbij per tijdstip in batches wordt gewerkt naar een schaal voor cap-isolatie.Voeg een royale hoeveelheid 0,7 XMMR plus gentamycine-oplossing toe. Giet vervolgens de fol-oplossing af van elke plaat met de geïnjecteerde embryo's en voeg opnieuw 0,7 XMMR plus gentamycine-oplossing toe. Verplaats de embryo's uit de putjes van hun injectieschaal met een transferpipet en plaats ze in de vers voorbereide isolatieschaal met dop.Gebruik een gastro master voorzien van een gele tip die tot 400 micrometers is gebogen, of een scherp pincet nummer vijf om de animale polen te isoleren in 0,7 XMMR plus Gentamicine-oplossing. Bewaar twee of drie intacte embryo's voor de stadiebepaling. Plaats de geïsoleerde animale polen samen met de gastembryo's terug in de incubator bij 14 graden Celsius tot de volgende dag, wanneer de polen op de flank van de gastembryo's worden getransplanteerd.Verwijder de doppen en gastembryo's van het eerste tijdstip uit de incubator van 14 graden Celsius, bepaal het stadium van de embryo's en sorteer ze op uniforme fluorescentie-positieve doppen. Tel het aantal doppen en verwijder deze. Verplaats een dubbel aantal gastembryo's met een scherpe pincet nummer vijf naar een vers geprepareerd injectieschaaltje met 0,7 XMMR plus Gentamycine-oplossing.Verwijder het Lene-membraan van elk gastembryo. Breng ze over naar de plaat met de dopjes, maar wees voorzichtig nu de Lene-membranen zijn verwijderd. Embryo's kunnen snel dissociëren aan het wateroppervlak; gebruik hiervoor de gastro master uitgerust met een gele tip met een gebogen draad van 200 tot 250 micrometer op de hoogste stand, of gebruik pincet nummer vijf.Verwijder een vierkant van 200 µm aan de zijkant van het embryo in stadium 14 tot 15. Gebruik hiervoor opnieuw de gastro master of de pincet nummer vijf. Snijd een dopje doormidden en plaats het weefsel in het gat dat in het gastheerembryo is gemaakt.Draai het embryo tegen de wand van het putje aan om genezing mogelijk te maken. Doe dit voor zoveel mogelijk embryo's terwijl ze zich in stadium 15 bevinden. Herhaal dit voor alle tijdspunten.Het embryo geneest gewoonlijk binnen 30 minuten. Verwijder vervolgens met een pincet nummer vijf de dode cellen, die wit van kleur zijn, met een voorzichtige borstelende beweging. Laat de getransplanteerde embryo's gedurende de nacht groeien bij 18 °C.Sorteer na de incubatie gedurende de nacht, onder een dissectie-fluorescentiemicroscoop, de embryo's met fluorescentie-gelabeld getransplanteerd weefsel. Plaats de geselecteerde embryo's terug bij 18 °C om te laten groeien tot stadium 42 tot 43. Wanneer de dieren het gewenste stadium hebben bereikt, anestheseer ze in trica, examineer ze onder een dissectie-fluorescentiemicroscoop en maak foto's.De getransplanteerde embryo's kunnen vervolgens worden gefixeerd, gesneden en immunogekleurd, of men kan in situ hybridisatie uitvoeren met markers voor een weefsel van belang. Hier zijn representatieve resultaten van een gast-kikkervisje met donorweefsel dat een fluorescerende tracer en noggin tot expressie brengt één dag na transplantatie. Let op hoe het weefsel zich ophoopt aan de zijkant van het kikkervisje.De gastembryo's die gecontroleerd donorteweefsel ontvangen dat uitsluitend de fluorescerende tracer tot expressie brengt, beginnen de animal cap-cellen al in hun flank te incorporeren. Een paar dagen later vormen de kikkervisjes die donordelen met nain-expressie oogachtige structuren op hun zijde, terwijl de kikkervisjes die het gecontroleerde donorteweefsel hebben ontvangen, fluorescerende cellen op het oppervlak van hun huid hebben. We hebben u zojuist laten zien hoe u de animal cap transplantatie-assay uitvoert in Zaps Lavis.Bij het uitvoeren van deze assay is het belangrijk om te onthouden dat alles gereed moet zijn voordat de procedure van die dag begint, zodat de embryo's niet sneller ontwikkelen dan u ze kunt verwerken. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Dit artikel een gemakkelijke en snelle werkwijze voor het visualiseren van verschillende neuronale celpopulaties in het centrale zenuwstelsel van embryonale ontwikkeling middels immunofluorescentiekleuring op de afdelingen.

Het beoordelen van Primary neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s met behulp van Immunokleuring

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

Dit is deel één van een uitgebreid Xenopus-bemonsteringsprotocol . De bemonsterde weefsels zijn de hartventrikel, de arteriële stam, de linker leverkwab, de galblaas, de long, de alvleesklier, de milt, het strottenhoofd, de slokdarm, de maag, de darmen, de teelballen, de vetlichamen, de eileider, de gepaarde nieren, de ischiasplex, de huid, de thymus en het hele oog.

Efficiënte technieken voor uitgebreide bemonstering van toegankelijke weefsels bij volwassen Xenopus

Leer weefselbepaling met de Animal Cap Transplantatie Assay in Xenopus laevis embryo's. Deze methode toont hoe genoverexpressie cel fate kan sturen en ectopische weefsels vormt.

Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis

Meer video's verkennen