Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Dit protocol demonstreert een videobioinformatica-methode voor het meten van de groei van menselijke embryonale stamcelkolonies door het analyseren van time-lapse video's die zijn verzameld in een icon bio station CT-incubator, uitgerust met een camera voor videobeeldvorming. Menselijke embryonale stamcellen of HESC-kolonies worden gekweekt tot 70% confluentie, herplaatst en gedurende 48 uur geïncubeerd, waarna de HESC-kolonies gedurende nog eens 48 uur worden gefilmd in de Biot ct. De groeisnelheid wordt bepaald met behulp van segmentatie-verbetering en meetrecepten die zijn ontwikkeld met CL quant-software.

De recepten worden gevalideerd door vergelijking met Adobe Photoshop, een beeldanalysetool die nauwkeurige handmatige maskeraanpassing aan elke kolonie mogelijk maakt. Het opkomende veld van videobioinformatica kan worden gebruikt om de verwerking, analyse en winning van biologische gegevens uit microscopische video's te automatiseren. Hoi, ik ben Serena Lin van Dr.Prou Talbot's lab in het Department of Cell Biology and Neuroscience hier aan de University of California Riverside.

Hoi, ik ben Sean Fino, ook van het Talbot Lab. Hoi, ik ben TI Satish van het Cell Molecular and Developmental Biology Graduate Program. Vandaag laten we zien hoe je de groei van menselijke embryonale stamcelkolonies kunt meten met behulp van videobioinformatica-tools.

We gebruiken deze procedure in ons lab om de effecten van omgevingstoxicanten op het gedrag van menselijke embryonale stamcellen te meten. We zullen deze procedure demonstreren in onze nieuwe stamcelcorefaciliteit. Dus laten we beginnen.

Om HESC voor videoanalyse voor te bereiden, kweek HESC op matrigel gecoate zes-well platen tot 70% confluent aspibeer medium van één well met HESC en spoel twee keer met één milliliter PBS. Voeg één milliliter Accutane toe en incubeer gedurende één minuut bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Voeg vervolgens 10 tot 12 glazen kralen toe in de well en schud de plaat voorzichtig totdat de kolonies volledig loslaten.

Neutraliseer Accutane met één milliliter humaan embryonaal stamcelonderhoudsmedium of muis embryonaal fibroblasten geconditioneerd medium. Verzamel losgelaten cellen zonder de kralen in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 200 G. Decanteer het SUP natant en breek het pellet met 500 microliter vers humaan embryonaal stamcelonderhoudsmedium of M-T-E-S-R plateer 100 microliter van de HESC-suspensie druppelsgewijs in meerdere wells van een 12 well matrigel gecoate plaat.

Schudden de plaat voorzichtig heen en weer en observeer de culturen onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat celklompjes gelijkmatig over de wells verdeeld zijn. Plaats de plaat in een incubatiekast bij 37 graden en 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur om ervoor te zorgen dat de cellen plat en groot genoeg zijn om gemakkelijk te visualiseren. Na 48 uur aspireer het medium en was de wells met 500 microliter PBS om niet-bevestigde cellen te verwijderen, voeg vervolgens 500 microliter M-T-E-S-R-medium toe aan elk.

Plaats de plaat onmiddellijk in de Biot CT en begin met het verzamelen van time-lapse beelden. Probeer velden te selecteren met discrete enkele kolonies die niet waarschijnlijk zullen uitgroeien tot andere kolonies. In dit protocol worden cellen gedurende nog eens 48 uur gedurende zeven minuten per frame gevideo-opgenomen.

Om het segmentatierecept te maken, scant u eerst handmatig de hele video om te verifiëren dat deze een enkele kolonie bevat die gedurende de hele opnameperiode scherp blijft. Open vervolgens de segmentatiewizard in de CL quants-software en klik op de volgende knop. Selecteer het juiste beeldkanaal en klik op de volgende knop.

Kies zachte overeenkomst en klik op Volgende. Selecteer een of twee wilt gebieden door de buitenrand van de centrale zone van de kolonie in te cirkelen. Dit gebied moet zo klein mogelijk zijn, maar representatief moet zijn voor de hele kolonie.

Kies niet te veel regio's, omdat dit kan resulteren in een onnauwkeurige toepassing van het masker. Klik op de volgende knop. Selecteer Niet-willen-regio's door regio's te omcirkelen die geen deel uitmaken van de kolonie en geen deel uitmaken van de achtergrond.

Deze regio's hebben patronen die onderdrukt moeten worden, zoals puin en dode cellen. Klik op volgende. Selecteer achtergrond door regio's te omcirkelen die geen kolonies, puin of dode cellen zijn.

De achtergrond moet uniform zijn en waarschijnlijk in elke frame verschijnen. Gewoonlijk selecteren we de grijze achtergrond rond de kolonie. Klik op de volgende knop.

Er moet een gekleurd masker worden weergegeven over het gebied van belang als het masker het gebied van belang niet nauwkeurig bedekt. Het segmentatiedrempelbereik in de rechterbenedenhoek van het scherm kan worden verhoogd of verlaagd als een wijziging van het masker nodig is. Selecteer updates zachte overeenkomstgebieden.

Dit maakt het mogelijk om de wilt, niet-wilt of achtergrondgebieden te wijzigen. Als het masker bevredigend is, selecteert u toepassingsdrempel en sla mijn masker op. Klik vervolgens op de volgende knop.

Het masker wordt vervolgens in een andere kleur weergegeven. Selecteer voltooien. Het recept moet in de rechterbovenhoek van de software worden weergegeven als segmentatierecept.

Hernoem het recept indien gewenst door met de rechtermuisknop te klikken en een nieuwe naam in te voeren. Om het recept toe te passen. Klik met de rechtermuisknop en plaats de muis over.

Recept toepassen. Er verschijnt een menu waarmee u het aantal frames kunt selecteren dat u wilt gebruiken. Stel het frameinterval in op elke 20 frames om de maskertrouw te garanderen.

Controleer willekeurig handmatig 10% van de frames waarop het masker is toegepast om een verbeteringsrecept te maken dat ongewenste regio's in puin elimineert. Klik met de rechtermuisknop op de verbeteringsreceptmap en klik vervolgens op nieuw. Er zou een nieuw verbeteringsrecept moeten worden weergegeven vanuit het oorspronkelijke gezichtsveld.

Beweeg de muis over pictogrammen in de