Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

Magnetische modulatie-biosensing of MMB is een nieuwe techniek voor de detectie van biologische moleculen. Hier wordt een proof-of-principle assay getoond waarin interleukine 8 wordt gedetecteerd wanneer interleukine 8, ook wel IL 8 genoemd, wordt toegevoegd aan een reactiemengsel met antilichaam-gecoate magnetische kralen door middel van een biotinylated anti-IL 8 antilichaam en fluorescent gelabeld streptavidine. Er wordt een moleculaire sandwich gevormd die het fluorescente molecuul effectief verbindt met de magnetische kraal.

De reactie wordt geplaatst in een vet en een wisselend magnetisch veld. Gradiënten worden aangelegd via twee elektromagnetische polen, die de kraaltjes in een oscillerende beweging brengen. De periodieke beweging van het kraaltje waaraan fluorescerende eiwitten zijn gebonden, in en uit een orthogonale laserstraal, produceert een fluorescentiesignaal dat wordt opgevangen door een PMT en gedemoduleerd.

Met behulp van een lock-in versterker kan de beweging van de beads worden gevisualiseerd door een CCD-camera in plaats van de PMT te gebruiken; synchrone beweging is zichtbaar in monsters waarin de magnetische beads via IL eight aan fluorescerende eiwitten zijn gekoppeld. Hoi, ik ben Adia van het Nonlinear Optics and Laser Lab van de afdeling Physical Electronics aan de Telaviv Universiteit. Ik ben NoGo van de afdeling Biological Sciences aan de University of Illinois in Chicago, en ik ben Marcelo Erlich van de afdeling Cell Research and Immunology van de Tel Aviv Universiteit.

Vandaag laten we u een methode zien voor snelle homogene detectie van biologische assays met behulp van een magnetisch modulatiesysteem voor biosensing. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om specifieke eiwitten en DNA-sequenties bij lage concentraties te detecteren. Laten we beginnen.

Begin deze procedure door voor elke reactie een buis klaar te zetten en te labelen, inclusief een doelmonster en een niet-doelcontrolemonster. Voeg aan elke buis de volgende componenten van de bio plex Precision Pro cytokine assay één voor één toe: gekoppelde magnetische kralen, detectie-IL8-antilichaam, streptavidine-PE en IL8-doelwit. Vul het volume aan tot 100 µL met assaybuffer en schud vervolgens 30 minuten op een compacte orbitale schudker.

Nadat de monsters 30 minuten bij kamertemperatuur zijn geschud, worden ze direct in cuvetten geplaatst voor analyse. Maak de heldere cuvetten van het MMB-systeem schoon met lensreinigingspapier en 70% ethanol. Het instrument dat voor de analyse wordt gebruikt, bestaat uit een laser met een verdubbelde frequentie van 488 nanometer die als excitatielichtbron dient en via een dichroïsche bundelsplitser van 562 nanometer op een microscoopobjectief wordt gericht.

De objectieflens van de microscoop focust de laser tot een bundelbreedte van 27 micrometer in een 400 micrometer brede BO-silicaatglazen buis. Het uitgezonden licht wordt spectraal gefilterd met twee opeenvolgende banddoorlaatfilters, gedetecteerd door een fotomultiplicator (PMT) en gedemoduleerd met een lock-in versterker. Een zelfgebouwde stroommodulator wordt gebruikt om opeenvolgend een blokgolf aan elke elektromagneet te leveren.

De amplitude moet 1,4 ampère zijn met een frequentie van één tot zes hertz, aangezien de beads elke cyclus tweemaal de laserstraal binnengaan en verlaten. De demodulatiefrequentie bij de lock-in versterker is twee tot 12 hertz. Start het systeem door de sleutel van de 488 nanometer laser op de aan-positie te zetten en de stroom in te schakelen.

Stel vervolgens het laservermogen in op het minimum, ongeveer vier tot zes milliwatt. Zet de oscilloscoop aan en schakel daarna de PMT in. Plaats vervolgens de monsterkuvet tussen de twee elektromagnetische polen.

Gebruik de rotatietrap van de vete om ervoor te zorgen dat de laserstraal door de vete gaat en niet tegen de wanden van de vet slaat. Gebruik de XY- en Z-translatietrap van de vete om de positie ervan ten opzichte van de objectieflens en de elektromagnetische polen te wijzigen. Om de koppeling van fluorescent licht in de detector te optimaliseren, moet de vete iets achter de polenlijn worden geplaatst.

Stel nu de oscilloscoop in op tijdtrace-meting. Stel de gainregeling van de PMT in op 0,5 bolts. Zet vervolgens de stroommodulator aan en stel de frequentie in op drie hertz.

Wacht 30 seconden om aggregatie en condensatie van de kraaltjes mogelijk te maken. De magnetische kraaltjes zullen beginnen te oscilleren en naar de voorkant van de buis bewegen. Wanneer de laserstraal de oscillerende kraaltjes raakt, moet er een flikkering van gereflecteerd laserlicht vanuit de kraaltjes zichtbaar zijn.

Let op dat de kralen sneller bewegen naarmate de stroommodulatie toeneemt en langzamer naarmate deze afneemt. De positie van de kralen in de buis kan worden aangepast met behulp van de micrometergestuurde tafels. Om de beweging van de kralen bij de polen te visualiseren, kan een CCD-camera worden geplaatst in plaats van de PMT.

De oscilloscoop detecteert het periodieke signaal van de fluorescentie-gekoppelde beads en registreert het tijdsverloop op de oscilloscoop. De opgeslagen gegevens kunnen met MATLAB worden geanalyseerd; reactiemengsels met en zonder IL eight werden geanalyseerd via MMB. In alle reacties met het target vormden de beads één enkel dicht aggregaat dat synchroon in en uit de laserstraal bewoog.

Zonder het doelwit waren de kralen echter minder geaggregeerd en was hun beweging minder uniform. Hier tonen de poolmodulatieklok in het geel en het PMT-uitgangssignaal in magenta de modulatiefrequentie voor elke pool op twee hertz. Daarom ligt de demodulatiefrequentie op vier hertz, zoals theoretisch verwacht.

Wanneer de kraaltjes de laserstraal passeren, detecteert de PMT het fluorescentielicht en ontstaat er een piek in de uitgangsspanning van de PMT wanneer het PMT-signaal en de dubbele modulatieklok naar de lock-in versterker worden gevoerd. De gevoelige phasedetector synchroniseert de resultaten met een hoge spanning. De twee kleuren geven twee verschillende scans aan bij dezelfde doelconcentratie.

De zwarte lijnen vertegenwoordigen het gemiddelde van elk signaal. De lock-in versterker detecteerde geen signaal toen de controlemonster werd getest. De lock-in versterker leverde in dit geval geen gesynchroniseerd signaal.

Dit feit, samen met het visuele verschil in aggregatie, suggereert dat het MMB-systeem en het verschil in de tijdtrace-metingen van het PMT-uitgangssignaal de aanwezigheid van het ILH-doelwit duidelijk kunnen identificeren. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe biologische moleculen snel en homogeen kunnen worden gedetecteerd met behulp van magnetische modulatie, met IL eight als voorbeeld voor biosensing.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de laserveiligheidsvoorschriften te volgen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.