Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis
May 23rd, 2010
Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om live beeldvorming en eenvoudige kwantificeringsmethoden te demonstreren om de morfologie van embryonale epitheelcellen te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst alle gereedschappen en apparaten klaar te maken. De tweede stap van de procedure is het uitnemen van X explan uit kikkerembryo's en ze in kamers voor langdurige kweek te plaatsen.
De derde stap van de procedure is het verzamelen van hoogwaardige beelden van epitheelcellen in realtime. De laatste stap van de procedure is het kwantificeren van morfologische details van epitheelcellen met behulp van Image J. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die getraceerde celafgebieden en membraanintensiteiten tonen door middel van hoge resolutie confocale microscopie. Hallo, ik ben Sagar Joshi van het Davidson Laboratory in de afdeling Bioengineering aan de Universiteit van Pittsburgh.
Vandaag zullen we u een procedure laten zien voor live celbeeldvorming en kwantitatieve analyse van Xenos lavia embryonale epitheelcellen. We gebruiken deze procedure om realtime veranderingen in het celskelet te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Om kamers voor het kweken van dierlijke kapdoppen voor te bereiden, gebruik siliconenvet om een aangepaste acrylkamer of kleine nylon-wasknop af te sluiten op een groot 45 bij 50 millimeter dekglas. Voeg één milliliter van 1% BSA toe in één derde XMBS in de kamer. Bekleed kleine dekglasfragmenten met dezelfde oplossing en incubeer gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius.
Om de hechting van de X explan aan het glas te verminderen, spoel en vul de kamer met DFA-medium tot net voordat u de xs overbrengt, spoel de dekglasfragmenten op dezelfde manier. Dompel ze vervolgens in een schaal met DFA-cultuurembryo's die op het stadium van één tot vier cellen zijn micro geïnjecteerd met het gewenste MR NA tot het gewenste stadium in één derde XMBS. Gebruik een overdrachtspijp met een schuine opening om de embryo's over te brengen naar een schaal met DFA onder een stereo-dissectiemicroscoop.
Gebruik een pincet om de embryo's te vergroten om een dierlijk CapEx-plant te verwijderen. Gebruik een haarlus om een embryo in één positie te ondersteunen. Gebruik een haarmes om een kleine incisie in de dierlijke pool te maken.
Maak herhaalde gladde flikkerende sneden om de incisie te verlengen en het ectoderm van de dop te verwijderen. Verwijder drie of vier x explan op dezelfde manier. En gebruik een overdrachtspijp om ze naar de voorbereide kweekkamer te verplaatsen.
Gebruik de haarlus om elke X explan te positioneren, zodat het epitheel naar de bodem van de kamer kijkt. Gebruik een pincet. Houd een dekglasfragment op zijn centrum vast.
Dompel de uiteinden in siliconenvet. Plaats één fragment over elke X explan. Bevestig elk fragment licht op zijn plaats met kleine daubs siliconenvet.
Zorg ervoor dat u de X explan niet met overmatige kracht volledig verplettert. Vul de kamer met DFA, bekleed de bovenste randen van de kamer met siliconenvet. Vervolgens verzegelt u de bovenkant met een 24 x 40 millimeter dekglas.
Pas het niveau van de DFA binnen de kamer aan om luchtbellen te verminderen en gebruik weefsel om eventuele overloop weg te deppen. De X-planten kunnen nu langdurig worden gekweekt in de verzegelde kamer gedurende een dag bij kamertemperatuur, beweeg de 20 x objectief van een confocale microscoop op zijn plaats. Plaats de kamer met de X explan op het microscoopplatform en plaats kleine balanceergewichten op de kamer om deze onder helder veld in positie te houden.
Pas de focus aan en gebruik grove positionering om de apicale uiteinden van de oppervlakkige cellen te visualiseren. Schakel over naar fluorescentie en een objectief met hogere vergroting. Om enkele afbeeldingen of time-lapse films van het explan-epitheel te verzamelen, stem de acquisitie af om de best mogelijke afbeelding te verkrijgen.
Verwijs naar het schriftelijke gedeelte van dit protocol voor tips over afstemmen en beeldvorming. Houd het laservermogen zo laag mogelijk. Leg afbeeldingen of time-lapse films van het x explan-epitheel vast.
Verwijs naar het schriftelijke gedeelte van het protocol voor suggesties over gegevensverzameling. Confocale beeldabestanden kunnen op verschillende manieren worden geanalyseerd. Hier zijn twee voorbeelden van hoe u gegevensbestanden kunt analyseren met behulp van Image J-analysesoftware met bio-formaten plugin.
Om het celoppervlak van een epitheelcel te meten, trekt u het analysemenu naar beneden en klikt u op metingen instellen. Selecteer het selectiegereedschap uit de werkbalk en omlijn de cel in het analysemenu, selecteer gereedschappen en vervolgens ROI-beheer. Om de manager van interessegebieden te openen, drukt u op controle t.
Om de omtrek aan de ROI-beheerder toe te voegen, selecteert u en voegt u zo veel omtrekken toe als u wilt vanuit de afbeelding. Klik vervolgens op opslaan om de ROI-set in de ROI-beheerder op te slaan. Klik op meten.
Het resultatenvenster toont nu de gemeten gebieden van elke ROI. Om de intensiteit van een celmembraan te meten, selecteert u het rechte lijngereedschap uit de Image J-werkbalk. Teken een loodrechte lijn over het membraan.
Druk op CTRL T zoals in het vorige voorbeeld. Om de selectie aan de ROI-beheerder toe te voegen, trekt u het analysemenu naar beneden en klikt u op profiel plotten om een plot van relatieve intensiteiten over de lijn te genereren. Om de grafiek als afbeelding op te slaan, klikt u op opslaan in het nieuwe plotvenster dat verschijnt.
Trek het lijstmenu naar beneden naar bestand en sla vervolgens op. We hebben u zojuist laten zien hoe u levend beeld kunt maken en embryonale epitheelcellen kunt kwantificeren vanuit uitgesneden dierlijke CapEx explan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden antibiotica en antibiotica toe te voegen aan de DFA. Om bacteriële en schimmelgroei te ontmoedigen, wees extra voorzichtig bij het indrukken van explantaten onder de dekglasjes, omdat meer dan vereiste druk de ex explan
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel demonstreert live beeldtechnieken om de morfologie van embryonale epitheliale cellen in Xenopus te bestuderen. Het benadrukt methoden voor het isoleren van kikkerweefsels en het visualiseren van levende epitheliale cellen met behulp van confocale microscopie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Xenopus embryonale epithelia dienen als model voor het bestuderen van celgedrag.
- Live-cel beeldvorming complementeert traditionele histologie.
- Het begrijpen van epitheliale morfogenese is cruciaal voor ontwikkelingsstudies.
- Confocale microscopie maakt real-time visualisatie van cellulaire dynamica mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om live beeldtechnieken voor epitheliale cellen te demonstreren.
- Om morfologische details van epitheliale cellen te kwantificeren.
- Om een protocol te bieden voor het isoleren en cultiveren van kikkerweefsels.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van gereedschappen en apparatuur voor beeldvorming.
- Excisie van weefsels uit kikkerembryo's voor cultivering.
- Verzamelen van hoge resolutie beelden van epitheliale cellen.
- Kwantificeren van celmorfologie met behulp van Image J software.
Belangrijkste resultaten
- Hoge resolutie beelden van levende epitheliale cellen werden verkregen.
- Kwantitatieve analyse onthulde gevolgde celangebieden en membraan intensiteiten.
- Live beeldvorming leverde inzichten op in celgedrag tijdens morfogenese.
- Methoden werden gevalideerd voor langdurige cultivering van kikkerweefsels.
Conclusies
- Live-cel confocale microscopie is effectief voor het bestuderen van epitheliale cellen.
- De methoden kunnen worden toegepast op verschillende ontwikkelingsbiologie studies.
- Resultaten verbeteren het begrip van epitheliale morfogenese.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging and quantitative analysis of embryonic epithelial cells in Xenopus laevis provide a dynamic platform for interrogating morphogenetic processes relevant to early discovery and target validation. High-resolution confocal microscopy enables real-time measurement of cellular morphology and protein localization, supporting predictive confidence in developmental biology models. This workflow enhances the translational value of epithelial systems for mechanistic de-risking and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of cytoskeletal changes and cell shape dynamics in real time.
- Supports functional validation of molecular targets involved in epithelial morphogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying cell area and membrane intensity changes.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes measurement of morphological parameters using reproducible Image J analysis.
- Enables high-content screening of compounds affecting epithelial cell behavior.
- Supports assay scalability and platform reuse for comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing dynamic epithelial processes.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation via quantitative outputs.
- Reduces biological risk by providing predictive, real-time cellular readouts.
- Supports biomarker identification through live imaging of protein localization.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, leveraging live-cell imaging for robust data generation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through real-time morphological analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers precise measurements of cell area and membrane intensity for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by supporting disease-relevant system modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse epithelial studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epithelial biology.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized imaging instrumentation and analysis software (e.g., Image J).
- Necessitates cross-team standardization of imaging and measurement protocols.
- May require adaptation for different model systems or tissue types.
- Dependent on optimal culture conditions and careful sample handling to ensure data quality.
