Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis

Het algemene doel van deze procedure is om live-imaging en eenvoudige kwantificeringsmethoden te demonstreren voor de analyse van de morfologie van embryonale epitheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst alle benodigdheden en apparatuur klaar te zetten. De tweede stap van de procedure is het excideren van X-explanen uit kikkerembryo's en deze onder te brengen in kamers voor langetermijncultuur.

De derde stap van de procedure is het in real-time verzamelen van beelden met een hoge resolutie van epitheelcellen. De laatste stap van de procedure is het kwantificeren van morfologische details van epitheelcellen met behulp van Image J. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die gevolgde celoppervlakken en membraanintensiteiten laten zien via confocale microscopie met een hoge resolutie. Hallo, ik ben Sagar Joshi van het Davidson Laboratory van de afdeling Bioengineering aan de University of Pittsburgh.

Vandaag laten we u een procedure zien voor live-cell imaging en kwantitatieve analyse van embryonale epitheelcellen van Xenos lavia. We gebruiken deze procedure om veranderingen in het celcytoskelet in realtime te bestuderen. Laten we beginnen.

Om kamers voor te bereiden voor het kweken van animal caps, gebruikt u siliconenvet om een op maat gemaakte acrylkamer of een kleine nylon ring af te dichten op een groot dekglas van 45 bij 50 millimeter. Voeg één milliliter 1% BSA in een derde XMBS toe aan de kamer. Coat kleine fragmenten dekglas met dezelfde oplossing en incubeer deze gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius.

Om de adhesie van de X explan aan het glas te verminderen, spoelt u de kamer en vult u deze met DFA-medium; vlak voor het overbrengen van de xs spoelt u de fragments van het dekglas op dezelfde manier. Dompel deze vervolgens onder in een schaal met DFA-kweekembryo's die in het een- tot viercellige stadium waren gemicro-injecteerd met het gewenste MR NA tot het gewenste stadium in één derde XMBS. Gebruik een transferpipet met een schuine opening om de embryo's onder een dissecterende stereomicroscoop over te brengen naar een schaal met DFA.

Gebruik een pincet om de embryo's te prepareren voor het excideren van een animal cap-explantaat. Gebruik een haarlus om een embryo in één positie te ondersteunen. Gebruik een haarmes om een kleine incisie in de animalpool te maken.

Maak herhaalde, vloeiende snijbewegingen om de incisie te verlengen en het ectoderm van de dop te verwijderen. Exciteer drie of vier x explan op dezelfde wijze. Gebruik vervolgens een transferpipet om deze naar de voorbereide kweekkamer te verplaatsen.

Plaats elk X-explan met de haarloop zodanig dat het epitheel naar de bodem van de kamer is gericht. Houd met een pincet een fragment van een dekglas in het midden vast.

Doop de uiteinden in siliconenvet. Plaats één fragment over elke X explan. Fixeer elk fragment voorzichtig op zijn plaats met kleine beetjes siliconenvet.

Vul de kamer voorzichtig met DFA, zonder de X explan met overmatige kracht te verbrijzelen. Bedek de bovenranden van de kamer met siliconenvet. Sluit de bovenkant vervolgens af met een dekglas van 24 x 40 millimeter.

Pas het niveau van de DFA in de kamer aan om luchtbellen te verminderen en gebruik weefsel om eventuele overloop weg te deppen. De X planten kunnen nu langdurig in de afgesloten kamer worden gekweekt gedurende een dag bij kamertemperatuur; breng het 20 x objectief van een confocale microscoop in positie. Plaats de kamer met de X explantaat op de microscooptafel en leg kleine balanceergewichten op de kamer om deze in positie te houden onder helderveldverlichting.

Stel de focus in en gebruik de grove positionering om de apicale uiteinden van de oppervlakkige cellen te visualiseren. Schakel over naar fluorescentie en een objectief met een hogere vergroting. Om enkelvoudige beelden of time-lapse video's van het geëxplaneerde epitheel te verzamelen, stemt u de acquisitie af om de best mogelijke beeldkwaliteit te verkrijgen.

Raadpleeg het geschreven gedeelte van dit protocol voor tips over het afstellen en het maken van beelden. Houd het laservermogen zo laag mogelijk. Leg beelden of time-lapse-films vast van het x explan epitheel.

Raadpleeg het geschreven gedeelte van het protocol voor suggesties over de gegevensverzameling. Confocale afbeeldingsbestanden kunnen op verschillende manieren worden geanalyseerd om gegevens te extraheren. Hier zijn twee voorbeelden van hoe gegevensbestanden kunnen worden geanalyseerd met Image J-analysesoftware met de bio-formats-plug-in.

Om het celoppervlak van een epitheelcel te meten, opent u het analysemenu en klikt u op 'set measurements'. Selecteer het selectiegereedschap uit de werkbalk en omtrek de cel; selecteer vervolgens in het analysemenu 'tools' en daarna 'ROI manager'. Druk op Ctrl+T om de ROI-manager (Regions of Interest manager) te openen.

Om de omtrek aan de ROI-manager toe te voegen, selecteert u zoveel mogelijk omtrekken uit de afbeelding als gewenst en voegt u deze toe. Klik vervolgens op save om de ROI-set op te slaan in de ROI-manager. Klik op measure.

Het resultatenvenster toont nu de gemeten oppervlakten van elke ROI. Om de intensiteit van een celmembraan te meten, selecteert u de tool voor rechte lijnen in de ImageJ-werkbalk. Teken een loodrechte lijn over het membraan.

Druk op CTRL T zoals in het vorige voorbeeld. Om de selectie aan de ROI-manager toe te voegen, opent u het analysemenu en klikt u op 'plot profile' om een plot van de relatieve intensiteiten over de lijn te genereren. Om de grafiek als afbeelding op te slaan, klikt u op 'save' in het nieuwe plotvenster dat verschijnt.

Open het lijstmenu, ga naar bestand en kies vervolgens 'opslaan als'. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u embryonale epitheelcellen uit een uitgesneden dierlijk CapEx-explantaat in vivo kunt beelden en kwantificeren. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden antibioticum en antibioticum aan het DFA toe te voegen. Om bacteriële en schimmelgroei te voorkomen, dient u extra voorzichtig te zijn bij het aandrukken van de explantaten onder de dekglasjes, aangezien een te hoge druk het explantaat kan beschadigen.

Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat de optimale instellingen op de confocale microscoop moeten worden gehanteerd om beeldgegevens van maximale kwaliteit te verkrijgen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.