Name: Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Leer DNA-extractie uit darmmicroben van de termiet Zootermopsis angusticollis voor microbiële ecologie. Deze methode onthult de complexe gemeenschap en biochemische routes in de achterdarm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Procedurele samenvatting voor termieten hele darm DNA-extractie: <ol><li> Chill termieten op het ijs, te verwijderen darm met behulp van steriele pincet en stabiliseren darm samples in de buffer. </li><li> Homogeniseren monsters in PVPP / SDS / phenol buffer. </li><li> Extract en DNA te zuiveren van ruw lysaat met Qiagen DNeasy kolommen. </li></ol> Protocol: <ol><li> Op ijs, verwijder de ingewanden van de werknemer kaste termieten met behulp van steriele pincet. </li><li> Onmiddellijk overdracht het lef en de inhoud in een steriele, nuclease-vrij buis met 50 ul ijskoude 1x moleculaire biologie kwaliteit TE-buffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Freeze monsters bij -20 ° C, of ​​ga rechtstreeks met de homogenisering. </li><li> Breng de darm monsters en buffer tot een steriele, nuclease-free 2 ml schroef buisje met vooraf geladen met 500 mg steriele zirconia / silica beads (0,1 mm) en 700 pi 1x TE buffer met 1% w / v polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ). </li><li> Voeg 50 ul van 20% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 500 ul van fenol op de monsters. </li><li> Homogeniseer (kraal beat) op de hoogste stand met behulp van drie cycli van 30 sec homogenisering en 30 sec van koelen op ijs. </li><li> Sediment onoplosbaar materiaal voor een min bij 8000 x g. </li><li> Zuiver 300-ul porties van de waterfase (bovenste) laag met Qiagen DNeasy kolommen volgens de methode beschreven voor het ruwe lysaat zuivering. </li><li> Kwantificeren nucleïnezuur-inhoud en te bevriezen monsters bij -20 ° C voor later gebruik. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

In onze ervaring, DNA geëxtraheerd uit de microbiële gemeenschappen van het hout geeft termiet soorten zoals Zootermopis nevadensis is voldoende zuiver voor PCR-sjabloon na een ronde van de extractie en zuivering. Echter, sommige termieten, zoals zwerfvuil-voeding en bodem geeft soorten hebben een hogere concentratie van humuszuren in hun darminhoud en kunnen extra zuivering van darm microbiële DNA nodig hebben. De totale DNA-opbrengst van de ingewanden van 5 Z. nevadensis werknemers is in de range van 10-30 mg. Voor de termiet soorten aanz...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/fenol</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>homogenisatiebuffer</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Gebruikt volgens het protocol voor isolatie van genomisch DNA uit ruwe lysaten (Appendix H, producthandleiding versie: juli 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) vervaardigd uit 100x concentraat</td></tr><tr><td>zirconia/silicakralen</td><td>Benodigdheden</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1% w/v polyvinylpolypyrrolidon bereid uit droog reagens als een 1x suspensie in TE-buffer</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Dier</td><td></td><td></td><td>Termieten</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>Natriumdodecylsulfaat 20% opl. in water uit droog reagens</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>TE-verzadigd, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Instrument</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Gebufferde zoutoplossing, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>Formulering per liter: 2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, en 10 mL van een 1 M opl. van NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Uitgerust met 40x objectief, 1.6x optivar en 10x oculairlenzen. Monsters werden bekeken met fasecontrastverlichting</td></tr></tbody></table>

extraheren van dna uit de gut microben van de termite (zootermopsis angusticollis) en visualiseren gut microben

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termieten zijn een van de weinige dieren waarvan bekend is dat de capaciteit om uitsluitend bestaan ​​door de consumptie van hout hebben. De termiet darm kanaal bevat een dichte en soortenrijk microbiële populatie die bij de afbraak van lignocellulose helpt voornamelijk in acetaat, de belangrijkste voedingsstof brandstof termiet metabolisme (Odelson &amp; Breznak, 1983). Binnen deze microbiële populaties zijn bacteriën, archaea methanogene en, in sommige (&quot;lagere&quot;) termieten, eukaryote protozoa. Zo, termieten zijn excellent onderzoek onderwerpen voor het bestuderen van de interacties tussen microbiële species en de vele biochemische functies die ze vervullen in het belang van hun gastheer. De soortensamenstelling van de microbiële populaties in termietenheuvels darmen evenals de belangrijkste genen die betrokken zijn in verschillende biochemische processen is onderzocht met behulp van moleculaire technieken (Kudo et al., 1998;. Schmit-Wagner et al., 2003;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). Deze technieken zijn afhankelijk van de extractie en zuivering van hoge kwaliteit nucleïnezuren van de termiet darm-omgeving. De extractie techniek wordt beschreven in deze video is een gewijzigde samenstelling van protocollen ontwikkeld voor de extractie en zuivering van nucleïnezuren van het milieu monsters (Mor et al., 1994;. Berthelet et al., 1996;. Purdy et al., 1996;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003;. Ottesen et al. 2006) en het produceert DNA van termiet einddarm materiaal dat geschikt is voor gebruik als sjabloon voor polymerase chain reaction (PCR).

Deze video illustreert de techniek voor de extractie van DNA van de soorten van microben woonachtig zijn in de termiet einddarm. De voorbereiding van een natte glijbaan berg, wat handig is voor het visualiseren van de darm microbiële gemeenschap wordt ook geïllustreerd, en een rondleiding door het soortenrijke darm-omgeving wordt gegeven.

Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben

Termieten behoren tot de weinige dieren waarvan bekend is dat ze in staat zijn om uitsluitend van hout te leven. Het spijsverteringskanaal van de termiet bevat een dichtbevolkte en ...

Hier is uw reactie op deze omgeving niet, is niet uniek. De meeste mensen, zelfs niet-wetenschappers, zijn, zijn behoorlijk verbijsterd. Ja. Door de, de diversiteit en complexiteit.Hallo, mijn naam is Eric Matson en ik ben postdoc bij de Department of Environmental and Science Engineering hier aan het California Institute of Technology. Mijn werk onder leiding van professor Jared Ledbetter richt zich op de microbiële interacties en de diversiteit van soorten die in de achterdarm van termieten leven. In het bijzonder zijn we geïnteresseerd in enkele van de biochemische routes die daar plaatsvinden, en specifiek in het proces van acetogenese, waarbij deze microben waterstof- en CO2-gassen consumeren en omzetten in acetaat, een cruciale voedingsstof voor het energiemetabolisme van de termietgastheer.Ikzelf en anderen in het laboratorium hebben specifieke primer-sets ontwikkeld om belangrijke enzymen in deze route te kunnen beoordelen. Om dit te kunnen doen, moeten we echter schone DNA-monsters van de gemeenschap genereren, DNA dat gebruikt kan worden als targets voor dit proces. Vandaag wil ik daarom demonstreren hoe we de termite-soort waar we het over hebben dissekeren, het DNA uit de achterdarm extraheren en dit vervolgens zuiveren voor later gebruik bij onderzoek.Vandaag gaan we ons concentreren op één specifieke termietensoort, namelijk Zo Opsis Nevadensis. Dit is een Californische vochtige houttermite die hier lokaal is verzameld; het is een vrij grote soort, waardoor de dissecties en extracties relatief eenvoudig uit te voeren zijn. Ik heb voor vandaag al enkele van de benodigdheden voorbereid die we voor de procedure nodig hebben.Een van de eerste dingen die we nodig hebben, is een bepaalde hoeveelheid ijs om de insecten die we gaan dissekeren te koelen. Ik heb ook wat TE-buffer vooraf gekoeld; deze bevat een verbinding die helpt het DNA te stabiliseren zodra het uit de cellen wordt vrijgegeven. Ik heb steriele vials die vooraf zijn gevuld met zirkoniumsilicaat-kraaltjes.Dit zijn kralen van 0,1 millimeter en er zit ongeveer een halve gram in. Dit is wat we daadwerkelijk gaan doen: mechanische shearing. Daarnaast heb ik een paar reagentia die worden gebruikt in de lysis- en zuiveringsprocedure.Hier heb ik een fles met 1% polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) in TE-buffer. PVPP is belangrijk voor het verwijderen van humuszuren uit de DNA-preparaten, die onze PCR-analyse van de resultaten kunnen remmen. Daarnaast heb ik wat natriumdodecylsulfaat, een surfactant die we zullen gebruiken om de cellen te helpen extraheren en te lyseren.En om vervolgens de dissectie van de termieten uit te voeren, hebben we alleen enkele steriele pincetten nodig. Deze hebben vrij fijne punten en dat is wat we daadwerkelijk zullen gebruiken om de darmkanalen te verwijderen. Ten slotte hebben we voor het mechanisch shearren hier een bead-beater die op zeer hoge toerentallen draait en die, samen met de zirkonia-silicaatkraaltjes, de mechanische disruptie van de cellen zal verzorgen.Nadat we de termieten in het veld hebben verzameld, brengen we ze hier naar het laboratorium. De meeste Californische vochtige houttermieten waarmee we werken, zijn zeer gevoelig voor uitdroging. Een van de verbeteringen die we in dit laboratorium hebben doorgevoerd, is de implementatie van kamers met een gecontroleerde vochtigheid, zoals deze aquariumtanks van 10 gallon.Hierin verzamelen we de individuele kolonies en houden we deze gescheiden in deze doosjes. Aan de basis van de tank bevinden zich containers met verschillende zoutoplossingen. Deze specifieke container bevat een kaliumfosfaatoplossing, waardoor de relatieve vochtigheid rond de 95 tot 96% blijft, wat ideaal is.En, onder die omstandigheden, zijn we erin geslaagd om de termieten daadwerkelijk in gevangenschap te laten fokken, hoewel we voor het uitvoeren van een experiment verse exemplaren uit het veld verzamelen. In deze doos ziet u een deel van het hout waar ze zich mee voeden. Dit is simpelweg Ponderosa- of Jeffreyden die we verzamelen op de locatie van het termietennest.Er zijn verschillende termietcasten, waaronder de mannelijke en vrouwelijke reproductieve exemplaren. Het grootste deel van de kolonie bestaat uit arbeiderstermieten, evenals een aantal soldaatcasten. Opvallend is dat de soldaten monddelen, mandibels, hebben die ontworpen zijn om de kolonie te verdedigen in plaats van om hout te eten.En zo zijn ze ook afhankelijk van de arbeiderstermieten om hen te voeden. En dus kun je in deze bak zowel arbeiders als soldaatentermieten zien, alsof sommige jongen die onlangs uit eieren zijn gearriveerd. Nou, hier in gevangenschap.Ik heb vijf workertermieten geselecteerd uit de groep die ik zojuist heb laten zien. Ik ben begonnen met het koelen ervan op ijs. Om de dissectie voor te bereiden, gebruik ik deze pincetten en werk ik met behulp van een dissectiemicroscoop, en hopelijk kunt u het grote darmvolume zien dat we uit elk van deze individuen kunnen verwijderen.Draai de termiet op zijn rug en houd met één pincet het kopereinde vast, terwijl u met de andere pincet simpelweg knijpt. Doe dit precies aan het uiterste puntje van het abdomen. Met één trekbeweging ziet u hoe het maag-darmkanaal uit het organisme wordt verwijderd. Oké.En u kunt zien dat het grote volume, ruwweg 30%40% van het gewicht van het insect, zich daadwerkelijk in die omgeving bevindt. En u kunt zien dat dit is verdeeld in verschillende secties. We hebben de voor Darm en vervolgens de middendarm, en dan deze hindgut-zak, wat de zeer grote kamer is die het grootste deel van de microbiële gemeenschap bevat die de fermentaties uitvoert.Ik heb hier de ingewanden van vijf werktermieten verwijderd. De volgende stap is het stabiliseren van de nucleïnezuren die zich in deze gemeenschap bevinden in een oplossing van ijskoud TE-buffer. Op dit punt kunnen ze worden ingevroren bij -20 °C als u in het veld werkt.Of we kunnen direct doorgaan met de extractieprocedure. Alle cellen en het DNA-materiaal bevinden zich echter nog steeds in het darmkanaal. Ik zal ze nu overbrengen naar 100 µL TE-buffer.Oké, voordat ik daadwerkelijk begin met de extractie van de darmmonsters, moet ik de buffer voorbereiden die ik ga gebruiken om de cellen en weefsels te disrupteren. Aan deze buis, waarin ik al ongeveer een halve gram zircon beads heb gedaan, voeg ik PVPP toe: 700 µL hiervan. Dit is de 1%-oplossing in TE-buffer, en 50 µL van een 20%-oplossing SDS.Het is belangrijk om het PVPP opnieuw te suspenderen voordat u het toevoegt, aangezien het onoplosbaar is in waterige buffers. Op dit punt zijn we klaar om het fenol aan het monster toe te voegen, dus ik ga een pipet gebruiken om ongeveer 500 µL toe te voegen. Oké. En daarmee zijn we klaar om met de extractie te beginnen. Ja.Nu het fenol is toegevoegd, kunnen we het darmmonster toevoegen dat we eerder uit de termiet hebben gedissecteerd; het helpt om de weefsels een klein beetje te macereren. Dit maakt de overdracht doorgaans wat eenvoudiger. En nu het fenol is toegevoegd, kunnen we beginnen met de mechanische disruptie met behulp van het bead-beatingapparaat.De techniek die we gaan gebruiken bestaat uit drie cycli op volle snelheid gedurende 30 seconden, gevolgd door 30 seconden op ijs. Het is belangrijk om de stap op ijs op te nemen om het monster af te koelen, omdat dit de neiging heeft op te warmen door wrijving. Ik plaats het monster nu in het bead-beating apparaat en start het programma voor 30 seconden. Oké.Aan het einde van de procedure moet u zien dat het grootste deel van het weefsel is gehomogeniseerd. Er mogen nog maar zeer weinig klontjes aanwezig zijn, en u zult zien dat het mengsel een schuimig uiterlijk heeft, waarschijnlijk door de aanwezigheid van SDS. Op dit punt zijn we klaar om te centrifugeren en vervolgens te beginnen met de eigenlijke extractie en zuivering van het DNA zelf uit dit monster.Nu we de cellen mechanisch hebben opengebroken, gaan we het onoplosbare materiaal centrifugeren. Dit doen we door de buis in de centrifuge te plaatsen en één minuut lang 8.000 ×g toe te passen. We verwachten nu dat het grootste deel van het oplosbare materiaal zich onderin de buis heeft verzameld.Wat we nu nodig hebben, is de waterige oplossing aan de bovenkant. Dit is wat we daadwerkelijk zullen toevoegen aan de KaiGen DNA-extractiekit, volgens de procedure voor ruw lysaat. Nu we ons monster hebben gecentrifugeerd, nemen we 200 µL supernatant per preparatie en zullen we het DNA extraheren met de A-D-N-E-Z KaiGen-kit, volgens het protocol dat is aangegeven voor ruw lysaat.Nu we de 200 µL van het darmmonster hebben, zal ik verdergaan met de Kyogen d easy kit volgens het protocol voor ruw lysaat. Bij elke darmentractie is het raadzaam om de status van de darminhoud te controleren. Dat doen we door een termiet te dissekeren om er zeker van te zijn dat dit representatief is voor wat we in het verleden hebben gezien.We zullen dat visueel doen door naar de cellen in deze microbiële gemeenschap te kijken. Precies aan de uiterste punt van het achterlijf hier. En aan één pool zou u het darmkanaal moeten zien.Dit is dus gewoon een gebufferde zoutoplossing die zeer nauw aansluit bij de samenstelling van het werkelijke darmvocht van de termiet. Ik ga dit nu een beetje versnijden en vervolgens voeg ik het toe aan het microscoopOBJECTglas om het te bekijken. Oké, nu zijn we klaar om dit onder de microscoop te bekijken.Ja, dat ziet er erg goed uit. Termietendarm. Er zijn vertegenwoordigers van alle drie de erkende domeinen van het leven.Er zijn eukaryote protozoa, er zijn methaan-oxiderende organismen en er zijn ook bacteriën. Ons laboratorium houdt zich hoofdzakelijk bezig met de bacteriële populatie in deze omgeving. Namelijk de SPI kes in dit specifieke type termieten; spire keets zijn een van de meest dominante bacteriële leden van de gemeenschap.En ons huidige onderzoek toont aan dat ze in feite in grote mate betrokken zijn bij CO2-reductieve ketogenese. Dit zijn verschillende typen protozoa, waarvan wordt aangenomen dat ze specifiek deelnemen aan de primaire afbraak van hout. Men denkt dat ze xylanases en cellulases bevatten die hun enzymen toegang geven tot deze houtpolymeren.Vervolgens fermenteren zij deze tot monosacharide-monomeren en polymeren die verder worden afgebroken door andere leden van de gemeenschap. Deze protozoa produceren zelf ook acetaat, maar een van hun bijproducten is waterstof en CO2, en deze waterstof en CO2 worden vervolgens weer gebruikt of geconsumeerd door de acetogene populaties in deze omgeving. Hier kunt u een zwerm protozoa-organismen zien, waarschijnlijk vlak naast een zeer grote soort Trichonympha.Het is een van de grootste organismen in de darm van de termiet. Wanneer u verder kijkt naar gebieden die deze grote protozoëncellen niet bevatten, zult u zien dat de achtergrond, dit soort interstitiële vloeistof, ook vol zit met spirocheten en andere bacteriële cellen. De complexiteit neemt dus zelfs in die ruimtes niet af.Eén van de zaken die ik wil benadrukken is dat het typische volume van een monster uit de achterdarm, zoals datgene dat we hier hebben bekeken, varieert van 2 tot 5 µL, afhankelijk van de grootte van de termiet. De natte preparaatbereiding die ik hier heb gemaakt, vertegenwoordigt dus eigenlijk een verdunning van ten minste 1:20 van die omgeving. Deze soorten zitten in de daadwerkelijke intacte darm dan ook veel, veel dichter op elkaar gepakt dan hier wordt weergegeven.Dit geeft u een voorstelling van zowel de dichtheid als de diversiteit van het leven in deze omgeving. Vandaag heb ik u laten zien hoe we het DNA uit de termieten-darm isoleren met deze gezuiverde monsters. Nu kunnen we de specifieke gerichte primer-sets toepassen.Concreet zullen we kijken naar genen voor formaatdehydrogenase, koolmonoxide-dehydrogenase en formaal-tetrahydrofolaat-synthese, wat drie van de primer-sets zijn die ons laboratorium heeft ontwikkeld. We zijn geïnteresseerd in het bestuderen van de diversiteit en specifieke sequentiekenmerken van een aantal van deze verschillende genen voor deze omgeving. Dit zal het PCR-amplificeren van de verschillende genen, het kloneren en sequenceren ervan en het opstellen van geninventarissen omvatten.Op basis van de resultaten kunnen we meer leren over de aard van enkele van deze interacties en specifiek hoe deze pathways in deze verschillende micro-organismen via dit proces zijn opgebouwd.

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Jared Leadbetter verklaart waarom de termiet-darm microbiële gemeenschap is een uitstekend systeem voor het bestuderen van de complexe interacties tussen microben. De symbiotische relatie bestaat tussen de host insecten en lignocellulose-afbrekende darm microben wordt uitgelegd, evenals het industrieel gebruik van deze micro-organismen voor de afbraak van plantaardige biomassa en het genereren van biobrandstoffen.

Het onderzoeken van de microbiële gemeenschap in de Termite einddarm - Interview

Jared Leadbetter neemt ons mee voor een wandeling in de natuur door de diversiteit van het leven woonachtig zijn in de termiet einddarm - een micro-omgeving met daarin 250 verschillende soorten die nergens anders op aarde. Jared blijkt dat de symbiose vertoond door dit systeem is multi-layered en omvat niet alleen een relatie tussen de termiet en zijn darmen inwoners, maar ook betrekking heeft op een complex web van symbiose tussen de darm microben zelf.

Lagen van Symbiose - Het visualiseren van de Termite einddarm microbiële gemeenschap

We presenteren de procedures aan te tonen dat liganden binden aan het oppervlak membraan van de protozoa cellulose verterende protozoa in de darm van de Formosan ondergrondse termieten met behulp van fluorescentie microscopie en dat liganden gekoppeld aan lytische peptiden kill...

Testen Protozoacidal Activiteit van Ligand-lytische Peptiden Against Protozoa Termite Gut In vitro (Protozoa Cultuur) en In vivo (Micro-injectie in Termite einddarm)

De actieve bacteriegemeenschappen geassocieerd met de darm van Spodoptera littoralis, werd bepaald door stabiele-isotoop probing (SIP) gekoppeld pyrosequencing. Met behulp van deze methodiek, de identificatie van de metabolisch actieve bacteriën soorten binnen de gemeenschap werd gedaan met een hoge resolutie en nauwkeurigheid.

Identificatie van metabool actieve bacteriën in de darm van de Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Stabiele Isotopen Onderzoek naar gebruik van<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Dit gestroomlijnde protocol beschrijft een workflow om bacteriën in complexe weefselmonsters te detecteren en in beeld te brengen, van het fixeren van het weefsel tot het kleuren van microben met fluorescerende in situ hybridisatie.

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

Om een axeeninsect te verkrijgen, wordt het eioppervlak gesteriliseerd en wordt de uitgekomen larve vervolgens grootgebracht met behulp van axeenbladeren. Deze methode biedt een efficiënte manier voor axeeninsectenbereiding zonder antibiotica toe te dienen of een kunstmatig dieet te ontwikkelen, dat ook kan worden toegepast op andere bladetende insecten.

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Compostmicrokosmos brengt de microbiële diversiteit in de natuur in het laboratorium om microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans te vergemakkelijken. Hier worden protocollen verstrekt voor het opzetten van microkosmosexperimenten, waarbij de experimenten het vermogen aantonen om de microbiële diversiteit van het milieu te moduleren om de relaties tussen microbiële diversiteit in het milieu en de samenstelling van het microbioom van de wormdarm te onderzoeken.

Compost microkosmos als microbieel diverse, natuurlijk-achtige omgevingen voor microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans

We stellen een geoptimaliseerd Scanning Electron Microscopie-protocol voor voor het visualiseren van zeer heterogene en delicate monsters die planten- en schimmelbiomassa bevatten, samen met microbiota en biofilm. Dit protocol maakt het mogelijk om de ruimtelijke dimensies van de microbiota-organisatie te beschrijven.

Microbiota van attine mierentuinen: visualisatie van een microbieel landschap door scanning elektronenmicroscopie

Leer DNA-extractie uit darmmicroben van de termiet Zootermopsis angusticollis voor microbiële ecologie. Deze methode onthult de complexe gemeenschap en biochemische routes in de achterdarm.

Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben

Meer video's verkennen