Name: Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer hoe je embryonale stamcellen differentieert naar oligodendrocyt voorlopercellen met kleine moleculen in 30 dagen. Deze methode genereert Olig2+NG2+ OPC's met hoge efficiëntie voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels gesteund door subsidies aan WD van National Institutes of Health (RO1 NS059043 en RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stichting voor Anemie Research, Feldstein Medical Foundation, en de Shriners Hospitals for Children. We willen graag Dr David Pleasure en Jennifer Plane bedanken voor suggesties. Wij verklaren geen concurrerende belangen met betrekking tot dit artikel.

Gedetailleerde procedures van het genereren van oligodendrocyt voorloper cellen (OPC) van GFP-Olig2 muis embryonale stamcellen (mESCs): <ol><li> Muis ES-cellijn GFP-Olig2 (G-Olig2), wordt gekocht van de American Type Culture Collection (ATCC). De mESCs worden routinematig gepasseerd om de 3 dagen op een bestraald muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-laag. De MEF cellen worden uitgeplaat in 0,1% gelatine beklede zes-well weefselkweek plaat ten minste een dag voor passage van de SER. De Mesc kweekmedium is Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) (GIBCO) aangevuld met 20% foetaal runderserum (GIBCO), 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 0,1 mM β-mercapto-ethanol /, 1% niet-essentiële aminozuren ( NEAA), en 1000 U / ml leukemie remmende factor. </li><li> MES kolonies zijn getrypsiniseerd (TrypLE, 5 min, 37 ° C) in afzonderlijke cellen en gesuspendeerd in knockout serum vervanging (KSR) medium, dan de cellen worden overgebracht naar een Costar ultra-low attachment zes-well plaat (Corning) in een cel dichtheid van 50.000 cellen / cm 2. In deze omstandigheden, mESCs vorm embryoid organen (EBS). KSR medium bestaat uit-minimal essentieel medium (MEM-) aangevuld met 20% KSR, 1 mM natrium pyruvaat, 1% NEAA, en 0,1 mM β-mercapto-ethanol /. </li><li> Vanaf dag 4 tot dag 7, zijn retinoïnezuur (RA, 0,2 M) en purmorphamine (Pur, een M) opgenomen zoals weergegeven in Fig. 1A in KSR of N2 medium. De N2 medium is-MEM bevattende 1X N2 aan te vullen, 1 mM natrium pyruvaat, 1% NEAA, en 0,1 mM β-mercapto-ethanol /. Het medium is veranderd elke dag. </li><li> Op dag 8 worden opgesplitst EBS met TrypLE (5 min, 37 ° C) en uitgeplaat op 0,01% polyornithine-coating gerechten in OPC medium dat bestaat uit N2 middelgrote en fibroblast groeifactor-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Het medium is om de twee dagen. </li><li> De cellen zijn getrypsiniseerd (TrypLE, 3 min, 37 ° C) en opnieuw uitgeplaat ongeveer elke week wanneer ze confluent. Op dag 30, meer dan 80% van de cellen vertonen GFP/Olig2 expressie en zijn NG2-positief, kenmerkend voor OPC's. </li><li> Om spiking OPCs genereren, de BacMam Na + kanaal kit wordt gebruikt om Na v 1.2 subunit te introduceren in deze Mesc afgeleide OPCs. De BacMam reagens (1 ml, component A) wordt gemengd met PBS tot een uiteindelijk volume van 5 ml. Daarna wordt het gemengde BacMam reagens toegevoegd aan Mesc-afgeleide OPCs cultuur in een 60 mm cultuur schaal (bij 50-70% confluentie) voorafgaand aan de spoelen met PBS. Na 2 uur incubatie wordt de gemengde BacMam reagens verwijderd en vervangen door een OPC-medium aangevuld met 1X enhancer. De versterker is de component B opgelost in DMSO (component C). Vervolgens na aanvullende 2-uur incubatie het medium met de versterker wordt verwijderd en vervangen door volledige OPC medium. De cellen zijn 24 uur later getest. </li></ol> Representatieve resultaten: Naar aanleiding van de differentiatie protocol getoond in Fig. 1A, G-Olig2 mESCs waren in eerste instantie gesuspendeerd in KSR medium en voor 4 dagen naar embryoid instanties (EBS) (Fig. 1B) te vormen. Dan hebben we achtereenvolgens behandeld de EBS met RA en Pur. De EBS heeft geen GFP fluorescentie niet zien op dag 4 en uitgedrukt sterke GFP fluorescentie bij D8 (Fig. 1B). Op dit tijdstip werden de EBS getrypsiniseerd en uitgeplaat in N2 medium aangevuld met groeifactoren FGF-2. Na een verdere cultuur voor 22 dagen (D30), het percentage van de GFP + cellen bereikt 80,3 ± 0,6% volgens onze flow cytometrie resultaten. Zoals getoond in Fig. 1C, GFP +-cellen overlapt met NG2 vlekken consequent (96,4 ± 1,3% van het GFP positieve cellen werden NG2 positief en 94,8 ± 1,5% van NG2 positieve cellen werden GFP positief). Zo, deze cellen te uiten GFP/Olig2 en NG2, ze te definiëren als OPCs. De Mesc afgeleide OPC's (76 cellen) niet actiepotentialen vuur op depolarisatie (Fig. 2A). Na transductie met een baculovirus het dragen van de Na v 1.2 subunit, zouden deze Mesc afgeleide OPC's (94,1%, 16 van de 17 cellen) worden aangemerkt als stekelige (Fig. 2B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Differentiatie van GOlig-Mesc in OPCs. (A) Regeling met het protocol van de embryoid lichaam (EB)-gebaseerde en kleine molecule-driven differentiatie. Op D8, werden de EBS opgesplitst en uitgeplaat. De cellen werden een keer per week gepasseerd toen zij werden confluent. (B) D8, maar niet D4 EBS, toonde GFP expressie. (C) Immunokleuring van NG2 (rood) in overeenstemming is met GFP (groen) expressie D30. DAPI (blauw) werd gebruikt om de kernen te identificeren. Schaalbalk: 20 mm. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Generatie van spiking OPC uit nonspiking Mesc-afgeleide OPCs door virus-gemedieerde Na v kanaal expressie. (A) De membraanpotentiaal werd gehouden bij -60 mV en Mesc-afgeleide OPCs niet actiepotentialen vuur, zelfs wanneer de cel werd gedepolariseerd op 0 mV. (B) Een voorbeeld van Mesc-afgeleide OPCvuren actie potentiaal (rood gemarkeerd) na de virale transductie.

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

Embryonale stamcellen (SER), geïsoleerd uit een blastocyst embryo, kunnen differentiëren in alle cellijnen van het organisme 3, 4, die een in vitro model systeem voor het bestuderen van vroege zoogdieren ontwikkeling, met inbegrip oligodendrocyt specificatie. mESCs is aangetoond dat ze in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC&#39;s) onderscheiden met de behandeling van sonic hedgehog (Shh) 5. Bovendien is de Shh-geïnduceerde OPC differentiatie van mESCs behoudt zich het juiste timing waargenomen in de embryonale ontwikkeling 6. Daarom is de aard van de in vitro OPC differentiatie van mESCs beschouwd worden in overeenstemming met wat er is geleerd van in vivo ontwikkeling. Hier, met behulp van de kleine moleculen RA en de Shh agonist Pur, hebben we met succes gedifferentieerde de G-Olig2 mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPC&#39;s met een hoge efficiëntie. OPCs, gekenmerkt door de uitdrukking van de proteoglycanen NG2 7 en de helix-loop-helix transcriptiefactor Olig2 8, het genereren van oligodendrocyten in de zich ontwikkelende en volwassen CNS, waar ze bestaan ​​uit een aanzienlijk percentage (~ 5%) van de totale cellen en zijn de prolifererende belangrijkste celtype 9. Al bijna twee decennia onderzoekers hebben aangetoond Na V-kanalen worden uitgedrukt in een subpopulatie van OPC&#39;s en kan worden geactiveerd bij de depolarisatie 10, 11. Bovendien, een recente opvallende vaststelling was dat in negen in situ rat CNS witte stof, OPC&#39;s (~ 50%) actiepotentialen gegenereerd wanneer gedepolariseerd, afhankelijk van de expressie van de voltage-gated natrium (Na V) kanalen, en dus kan worden onderverdeeld in pieken en nonspiking subpopulaties. Echter, de functies van deze spiking eigenschappen zijn nog grotendeels onbekend. Wij vonden dat, elektrofysiologische, de Mesc-afgeleide OPC&#39;s onderscheiden met de Shh-afhankelijke protocol, niet hetzelfde als de in situ hersenen OPCs. Na de introductie van subunit Na 1,2 V, deze stille Mesc afgeleide OPC&#39;s in staat waren spiking. Zo kan de stekelige / nonspiking Mesc-afgeleide OPC&#39;s en differentiatie protocol hier beschreven te vergemakkelijken (1) studie van de functionele verschillen tussen de pieken en nonspiking OPCs, (2) toetsing van nieuwe factoren die de natriumkanalen uitdrukking zou kunnen bevorderen in de Mesc afgeleide OPCs, ( 3) het ontwikkelen en optimaliseren van de differentiatie protocol van de OPC&#39;s van menselijke ESC of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs).

<table><tbody><tr><td>MEF's</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Retinoïnezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Purmorfamine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorlopers

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocyten zijn de myelinating cellen van het centrale zenuwstelsel. Voor regeneratieve celtherapie bij demyeliniserende ziekten, is er groot belang bij de afleiding van een zuivere populatie van de lijn-vastgelegde oligodendrocyt voorloper cellen (OPC&#39;s) voor transplantatie. OPC&#39;s worden gekenmerkt door de activiteit van de transcriptiefactor Olig2 en de oppervlakte-expressie van een proteoglycan NG2. Met behulp van de GFP-Olig2 (G-Olig2) muis embryonale stamcellen (Mesc) reporter lijn hebben we optimale condities voor de differentiatie van mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. In ons protocol, beschrijven we eerst de generatie van embryoid instanties (EBS) uit mESCs. Ten tweede, beschrijven we de behandeling van Mesc-afgeleide EBS met kleine moleculen: (1) retinoïnezuur (RA) en (2) een sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) onder bepaalde voorwaarden aan cultuur EB differentiatie direct in de oligodendroglia geslacht. Door deze aanpak kunnen OPC&#39;s worden verkregen met een hoge efficiëntie (&gt; 80%) in een periode van 30 dagen. Cellen, afkomstig van mESCs in dit protocol zijn fenotypisch gelijk aan OPC&#39;s ontleend aan het primaire weefselkweek. De Mesc afgeleide OPC&#39;s tonen niet de stekelige woning beschreven voor een subpopulatie van de hersenen OPCs in situ. Om dit te onderzoeken elektrofysiologische woning, beschrijven we de generatie van spiking Mesc-afgeleide OPCs door ectopisch uiten Na<sub&gt; V</sub&gt; 1,2 subunit. De pieken en nonspiking cellen verkregen van dit protocol zal helpen vooruit functionele studies op de twee subpopulaties van OPCs.

Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC&#39;s). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC&#39;s met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om &quot;spike&quot; OPC&#39;s die kunnen vuren actiepotentialen genereren.

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Oligodendrocyten zijn de myelinerende cellen van het centrale zenuwstelsel. Voor regeneratieve celtherapie bij demyeliniserende aandoeningen is er een aanzienlijke...

Het algemene doel van het volgende experiment is om oligodendrocyten-precursoren te genereren uit embryonale stamcellen via een reeks kweekstappen gedurende 30 dagen. Dit wordt bereikt door eerst embryolichaampjes te genereren uit muis-ES-cellen om de celdifferentiatie te initiëren. Als tweede stap worden de embryolichaampjes behandeld met de kleine moleculen retinoïnozuur en pure morfine, die de gestuurde differentiatie van de cellen tot een ligament induceren.Cyte-precursoren. Als derde stap worden de embryo-lichamen na nog eens 22 dagen gedisaggregeerd tot enkelvoudige cellen. In cultuur bestaat ongeveer 80% van de cellen uit OPC's.Vervolgens worden de uit MESC afgeleide OPC's getransduceerd met bao-virussen die de NAV 1.2-subeenheid dragen om spiking OPC's te genereren; de resultaten tonen de expressie van de OPC-marker en de spiking-eigenschappen van deze uit MESC afgeleide OPC's aan op basis van immunofluorescentiemicroscopie en elektrofysiologische registraties. Hallo, ik ben Pong Chiang van het laboratorium van Dr. Ing in de afdeling Celbiologie en Humane Anatomie aan de University of California Davis. We zijn ook verbonden aan het Shriners Hospital for Children of Northern California.Hallo, ik ben Vial Raj, ook van het Deng-lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor de differentiatie van muizen embryonale stamcellen naar oligodendrocyten-precursocellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eigenschappen van uit embryonale stamcellen afgeleide oligodendrocyten-precursoren te bestuderen, met als doel cellen te genereren met een beter therapeutisch potentieel.Laten we beginnen. Vandaag zullen oligodendrocyt-precursorcellen of OPC's worden gegenereerd uit de OG2-GFP muis embryonale stamcellijn. Deze embryonale stamcellen moeten elke drie dagen worden gepassaged om ze gezond te houden bij een optimale dichtheid en om spontane differentiatie te voorkomen. Passaging.De ESS-cellen wanneer ze een confluentie van 70% hebben bereikt onder een laminaire flowkast. Verwijder het medium boven de cultuur. Spoel met PBS en trypsiniseer met twee milliliters voorverwarmde.Incubeer één keer LE express gedurende vijf minuten bij 37 °C. Stop de reactie en resuspendeer de cellen in vier milliliter MES-celmedium. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter en pellet deze bij 1000 RP gedurende vijf minuten.Resuspendeer in een MESL-mediumplaat, waarbij een tiende van de cellen over een confluente laag bestraalde meth-feeders in MES-celmedium wordt geplaatst. Na drie dagen zijn de ES-cellen ongeveer 70% confluent en kunnen ze worden gepassageerd of gesuspendeerd om embryo-bodies te vormen. Om embryo-bodies te induceren en de differentiatie te starten, worden muizen-ES-celkolonies zoals voorheen met trypsine behandeld, waarna de cellen worden geresuspendeerd in knockout serum replacement of KSR-medium. Tel de cellen met een hemocytometer en verdun de suspensie in KSR.Plate een medium met 15 000 cellen per milliliter door drie milliliter in elke put van een six-well plate met ultralage hechting te gieten. Kweek de gesuspendeerde cellen vier dagen lang bij 37 °C. Vervang het medium elke twee dagen volledig.Vanaf dag vier wordt het medium dagelijks vervangen. Voeg op de vierde dag 0,2 µM retinoïnezuur toe aan het KSR. Voeg op de vijfde dag zowel retinoïnezuur als 1 µM primor famine toe. Voed de embryo-lichamen op de zesde en zevende dag met twee media, aangevuld met 0,2 µM retinoïnezuur en 1 µM primor famine. Na acht dagen in cultuur expresseren de meeste embryo-lichamen GFP en zijn ze klaar om te worden gedisaggregeerd; behandel met trypsine en tel de cellen zoals voorheen.Resuspendeer ze vervolgens tot een concentratie van 3,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Breng drie milliliter van de suspensie aan in OPC-medium. Gebruik hiervoor 60 millimeter schaaltjes die zijn gecoat met poly-ornithine. De cellen worden ongeveer elke week confluent en zullen er zo uitzien; pasgeageer de cellen vervolgens zoals voorheen met een trypsinisatie van drie minuten.30 dagen na de oorspronkelijke resuspensie. In KSR-medium vertonen de cellen kenmerken van oligodendrocyten-precursorcellen om spiking OPC's te genereren. Gebruik muis ESL-afgeleide OPC's die tussen de 50% en 70% confluent zijn.Vervang het medium door XPBS om de cellen te spoelen. Om het spanningsafhankelijke natriumkanaal 1.2 alfa-ondereenheid te introduceren.We gebruiken de back MAM natriumkanaal-kit. Meng één milliliter back MAM component A met vier milliliter 1X PBS. Verwijder de PBS-spoeling en voeg het verdunde component toe.Incubeer A gedurende twee uur bij 37 °C. Vervang het back memory-agens door OPC-medium dat is verrijkt met componenten B en C, zoals beschreven in de kit. Incubeer volgens de instructies nogmaals twee uur bij 37 °C.Vervang na de incubatie het verrijkte medium door vers OPC-medium. Na nog eens 24 uur cultiveren kunnen de uit ESL afgeleide OPC's op dit tijdstip worden geanalyseerd op spiking. De EBS vertonen geen GFP-fluorescentie.De EBS vertonen een sterke GFP-expressie en zijn ongeveer 30 dagen na de oorspronkelijke resuspensie klaar voor disaggregatiekweek. In KSR-medium zijn de meeste cellen immunopositief voor NG2-kleuring, wat consistent is met de GFP-expressie. In tegenstelling tot OPC's uit de hersenen slagen deze uit MES-cellen afgeleide OPC's er echter niet in om actiepotentialen te genereren, zelfs niet wanneer de cellen gedepolariseerd werden tot 0 mV.Na het introduceren van de NAV 1.2-subunit via virale transductie, raken deze uit mES-cellen afgeleide OPC's geëxciteerd en vuren ze actiepotentialen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe muizenembryonale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd tot OPC's en hoe spiking OPC's kunnen worden gegenereerd via virale transductie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat retinoïnezuur, morfine en FGF2 correct bewaard moeten worden en dat er altijd verse aliquoten moeten worden gebruikt; gooi alle overtollige retinoïnezuur na gebruik weg.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

differentiation-embryonic-stem-cells-into-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen...

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

This video demonstrates the process of generating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from human embryonic stem cells, followed by the maturation of OPCs to oligodendrocytes. This process of generating oligodendrocytes opens numerous avenues to improve research and treatment of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Oligodendrocytes

This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons' axons.

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Oligodendrocyten zijn de myeliniserende cellen van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en kweken van hun precursoren, oligodendrocyten-voorlopercellen, uit rattencortex, evenals een snelle en betrouwbare kwantitatieve methode om oligodendrogenese in vitro te evalueren als reactie op experimentele factoren.

Voorbereiding van de Rat Oligodendrocyte Progenitor culturen en kwantificering van Oligodendrogenesis gebruik van Dual-infrarood fluorescentie Scanning

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

We beschrijven de productie van gemengde culturen van astrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen afgeleid van foetale of volwassen neurale stamcellen die differentiëren in volwassen oligodendrocyten, en in vitro modellering van schadelijke stimuli. De koppeling met een celgebaseerde high-content screeningtechniek bouwt een betrouwbaar en robuust screeningsysteem voor geneesmiddelen op.

High-Content Screening Differentiatie en Rijpingsanalyse van foetale en volwassen neurale stamcel-afgeleide oligodendrocyten precursor celculturen

Leer hoe je embryonale stamcellen differentieert naar oligodendrocyt voorlopercellen met kleine moleculen in 30 dagen. Deze methode genereert Olig2+NG2+ OPC's met hoge efficiëntie voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Meer video's verkennen