Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers
19 mei 2010
Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om oligodendrocyte-precursoren te genereren uit embryonale stamcellen via een reeks kweekstappen over een periode van 30 dagen. Dit wordt bereikt door eerst embryolichamen te genereren uit muis-ES-cellen om celdifferentiatie te initiëren. Als tweede stap worden de embryolichamen behandeld met de kleine moleculen, retinoïnezuur en pure morfine, die de gerichte differentiatie van de cellen in een liga den induceren.
Cyte precursoren. Als derde stap worden embryolichamen na nog eens 22 dagen ontdaan van aggregaten in enkele cellen. In cultuur is ongeveer 80% van de cellen OPC's.
Vervolgens worden de MESC-afgeleide OPC's getransduceerd met bao-virussen die de NAV 1.2-subeenheid dragen om spikerende OPC's te genereren. De resultaten tonen de expressie van OPC-marker en de spikerende eigenschappen van deze MESC-afgeleide OBC's, gebaseerd op immunofluorescentiemicroscopie en elektrofysiologische opnames. Hallo, ik ben Pong Chiang van het laboratorium van Dr.Ing in de afdeling Celbiologie en Menselijke Anatomie aan de Universiteit van Californië Davis. We zijn ook aangesloten bij het Shriners Hospital for Children in Noord-Californië.
Hallo, ik ben Vial Raj, ook van het Deng-lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor de differentiatie van muis-emron-stamcellen in genocide-precursorcellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eigenschappen van embryonale stamcel-derd-oligodendrocyte-precursoren te bestuderen om cellen te genereren met een beter therapeutisch potentieel.
Dus laten we beginnen. Vandaag zullen oligodendrocyte-precursorcellen of OPC's worden gegenereerd uit de OG twee GFP-muis-embryonale stamcellijn. Deze embryonale stamcellen moeten om de drie dagen worden gepasseerd om ze gezond te houden bij een optimale dichtheid en om spontane differentiatie te voorkomen. Passage.
De ESS-cellen wanneer ze 70%confluent zijn onder een laminaire stromingskast. Verwijder het medium over de cultuur. Spoel met PBS en trypsiniseer ogen met twee milliliter voorverwarmd.
Eén keer trip LE express gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Stop de reactie en suspendeer de cellen in vier milliliter MES-celmedium. Breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis en pellet ze bij 1000 RP gedurende vijf minuten.
Suspendeer in MESL-medium, plaat een tiende van de cellen over een confluente laag van bestraalde meth-feeders in MES-celmedium. Na drie dagen zijn ES-cellen ongeveer 70%confluent en zijn ze klaar om gepasseerd of gesuspendeerd te worden om embryolichamen te vormen om embryolichamen te initiëren en differentiatie te beginnen. Trypsiniseer muis-ES-celkolonies zoals eerder en suspendeer vervolgens de cellen in knock-out serumvervanger of KSR-medium. Tel de cellen op een hemo TER, verdun de suspensie in KSR.
Medium tot 15.000 cellen per milliliter, bespreid drie milliliter in elke put van een ultralage aanhechtingszes-puts-cultuurplaat. De gesuspendeerde cellen bij 37 graden Celsius gedurende vier dagen. Ververs het medium volledig om de twee dagen.
Beginnend op dag vier, vervang het medium dagelijks op de vierde dag. Supplementeer de KSR met 0,2 micromolair retinoïnezuur op de vijfde dag, supplementeer met zowel retinoïnezuur als één micromolair primor-honger op de zesde en zevende dagen. Voed de embryolichamen binnen twee media, gesupplementeerd met 0,2 micromolair retinoïnezuur en één micromolair primor-honger. Na acht dagen in cultuur, drukken de meeste embryolichamen GFP uit en zijn klaar om te worden gedisaggregeerd, trypsiniseer ogen en tel de cellen zoals eerder.
Dan suspendeer ze opnieuw bij 3,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. In OPC-medium, vul drie milliliter van de suspensie opnieuw in OPC-medium. Met behulp van poly-ornithine gecoate 60 millimeter schalen, ongeveer elke week, zullen de cellen confluent worden en er zo uitzien, passage naar de cellen zoals eerder met een drie minuten durende trypsinisatie.
30 dagen na de oorspronkelijke suspensie. In KSR-medium vertonen de cellen kenmerken van oligodendrocyte-precursorcellen om spikerende OPC's te genereren. Gebruik muis ESL-afgeleide OPC's die tussen 50 en 70%confluent zijn.
Verwissel het medium voor een XPBS om de cellen te spoelen. Om voltage-afhankelijke natrium te introduceren. Kanaal 1.2 alfa-subeenheid.
We gebruiken de back MAM-natriumkanaalkit. Meng één milliliter van back MAM component A met vier milliliter van één XPBS. Verwijder de PBS-spoeling en voeg het verdunde component toe.
A incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Vervang de back-memory-agent met OPC-medium dat is verrijkt met componenten B en C zoals beschreven in de kit. Instructies incuberen voor een extra twee uur bij 37 graden Celsius.
Na de incubatie, vervang het verrijkte medium met vers OPC-medium. Na nog eens 24 uur van cultuur kunnen de ESL-afgeleide OPC's op dit tijdstip worden getest op spiking. De EBS vertonen geen GFP-fluorescentie.
De EBS vertonen sterke GFP-expressie en zijn klaar voor disaggregatie en cultuur gedurende ongeveer 30 dagen na de oorspronkelijke suspensie. In KSR-medium is de meerderheid van de cellen immuunpositief voor NG twee-kleuring, wat consistent is met GFP-expressie. Echter, in tegenstelling tot hersen-OPC's, mislukken deze MES-cel-afgeleide OPC's om actiepotentiaal te ontsteken, zelfs wanneer de cellen gedepolariseerd worden tot nul millivolt.
Na introductie van NAV 1.2-subeenheid door virale transductie, worden deze MES-cel-afgeleide OPC's opgewonden en ontsteken actiepotentiaal. We hebben u net laten zien hoe muis-embryonale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd in OPC's en spikerende OPC's kunnen genereren door virale transductie. Wanneer u deze procedure uitvoert, is het belangrijk om te onthouden om het retinoïdzuur per morfine en FGF twee goed te bewaren en altijd verse aliquotten te gebruiken, gooi eventuele extra t retinoïdzuur weg na gebruik.
Dat was het. Bedankt voor het bekijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het differentiëren van embryonale stamcellen van muizen tot oligodendrocyte-precursorcellen (OPCs) met behulp van kleine moleculen. De methode behaalt een hoge efficiëntie bij het genereren van Olig2+NG2+ OPCs binnen 30 dagen en bevat een techniek voor het produceren van spiking OPCs die in staat zijn actiepotentialen te genereren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- Oligodendrocyten-precursorcellen (OPC's) zijn essentieel voor de myelinisatie in het centrale zenuwstelsel.
- embryonale stamcellen van muizen (ES-cellen) kunnen worden gedifferentieerd tot OPC's voor onderzoeks- en therapeutische doeleinden.
- Kleine moleculen kunnen het differentiatieproces effectief sturen.
- Inzicht in de eigenschappen van OPC's kan het therapeutische potentieel bij neurologische aandoeningen vergroten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor het genereren van OPC's uit muis-ES-cellen.
- Het onderzoeken van de elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde OPC's.
- Het verkennen van het potentieel van spiking OPC's in therapeutische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Embryonale lichamen worden gevormd uit muis-ES-cellen om differentiatie te initiëren.
- Kleine moleculen, waaronder retinoïnezuur en pure morfine, worden gebruikt om differentiatie te induceren.
- Cellen worden gedisaggregeerd en gekweekt om OPC's te verrijken.
- Virale transductie wordt aangewend om voltage-gevoelige natriumkanalen in OPC's te introduceren.
Belangrijkste resultaten
- Ongeveer 80% van de gekweekte cellen wordt na 30 dagen geïdentificeerd als OPC's.
- Immunofluorescentiemicroscopie bevestigt de expressie van OPC-markers.
- Elektrofysiologische opnames tonen de spiking-eigenschappen van getransduceerde OPC's aan.
- Niet-getransduceerde OPC's vertonen geen actiepotentialen, wat de effectiviteit van de virale transductiemethode benadrukt.
Conclusies
- Het protocol genereert effectief OPC's uit embryonale stamcellen van muizen.
- Virale transductie zet OPC's succesvol om in spiking cells.
- Deze methode biedt een basis voor het bestuderen van OPC's in de context van neurologisch onderzoek en therapie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen tot oligodendrocyten-precursorcellen (OPC's) voorziet in een kritieke behoefte aan schaalbare, lijngebonden celbronnen voor regeneratief onderzoek naar het centrale zenuwstelsel (CZS). Dit protocol maakt een hoge opbrengst mogelijk van fenotypisch gedefinieerde OPC's, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege targetvalidatie en functionele studies. De aanpak faciliteert mechanistische risicoreductie en portfolio-triage voor celgebaseerde therapeutische strategieën gericht op demyeliniserende ziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de commitment van de oligodendrogliale lijn en padspecifieke eigenschappen mogelijk met behulp van gedefinieerde moleculaire markers.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door OPC's te genereren met consistente expressieprofielen van Olig2 en NG2.
- Vergemakkelijkt voorspellende zekerheid bij de functionele validatie van targets door middel van elektrofysiologische karakterisering van OPC-subpopulaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare bron van gevalideerde OPC's voor downstream compound screening en fenotypische assays.
- Standaardiseert differentiatie-outputs, wat zorgt voor een kwantitatieve en schaalbare ontwikkeling van assays.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van kandidaatmoleculen in ziektgerelevante oligodendrocyt-lijnsystemen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro OPC-modellen uit met fenotypen afgeleid van primair weefsel voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door functionele studies naar spiking en nonspiking OPC's mogelijk te maken.
- Faciliteert mechanische risicovermindering voor kandidaten in de celtherapie-pipeline die gericht zijn op demyelinisatie.
Integratie van Pipeline en Workflow
Dit differentiatieprotocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor vroege targetvalidatie, assayontwikkeling en translationeel onderzoek naar de biologie van OPC's mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over lineage-committering en functionele OPC-eigenschappen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare OPC-populaties voor kwantitatieve assay-platformen.
- Analytics: Biedt immunofluorescentie- en elektrofysiologische readouts voor vergelijkende analyse van OPC-subtypes.
- Translational Research: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en primaire weefselmodellen voor preklinische afstemming.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor het genereren van OPC's over meerdere onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in OPC-gericht onderzoek.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare OPC-generatie voor cross-team workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie in portfolio's voor celtherapie en neuroregeneratie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van OPC-gebaseerde therapeutische kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, differentiatie en virale transductietechnieken.
- Vereist toegang tot immunofluorescentiemicroscopie en infrastructuur voor elektrofysiologische registratie.
- Noodzaak van strikte standaardisatie van differentiatie- en assayprotocollen tussen teams.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende embryonale stamcellijnen of soortspecifieke modellen.
- Afhankelijk van een consistente reagentia-kwaliteit en nauwkeurige timing van de differentiatiestappen.
