Name: Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer intracraniële xenotransplantatie van menselijke hersentumoren in muizen met bioluminescentiebeeldvorming. Deze methode maakt real-time monitoring van tumorgroei en therapierespons mogelijk voor preklinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NINDS beurzen NS49720 en NS65819, en NCI verlenen CA97257

1. Tumorcel Voorbereiding. Cellen bij de mens hersentumor xenotransplantaten kan afkomstig zijn uit de tumoren gepropageerd als subcutane gezwellen in athymische muizen, of van celkweek. Gebruik van beide cel bronnen is hieronder besproken, samen met demonstratie van een methode voor cel implantatie. Voor te bereiden cellen van subcutane tumoren voor overdracht aan de intracraniële compartiment, worden weggesneden flank tumoren geplaatst in de cultuur gerechten, waarbij het ​​weefsel wordt in eerste instantie gehakt met een scalpel en dan mechanisch verstoord door repetitieve pipetteren naar een cel aggregaat suspensie maken 1. De cel aggregaat suspensie wordt vervolgens door een 70 uM nylon mesh filter om een ​​enkele celsuspensie geschikt voor intracraniële injectie te produceren. De celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C en het supernatant afgezogen voordat resuspenderen de cel pellet in een geschikt volume van het serum-vrije media tot een uiteindelijke concentratie van werk (zie hieronder) te verkrijgen. Voor het bereiden van gevestigde cellijnen voor intracraniële implantatie, worden de cellen geoogst door trypsinizing monolagen, of door het verzamelen van neurosphere schorsing culturen, dan centrifugeren en resuspenderen de cellen zoals hierboven aangegeven 2. Het aantal van de geïnjecteerde cellen is variabel afhankelijk van de neuroanatomische locatie van de injectie. Voor supratentoriële injecties hebben we regelmatig inspuiten 3-5 x 10 5 cellen in 3 ul serum-vrij medium (DMEM), terwijl voor hersenstam injecties 3, zo weinig als 5 x 10 4 cellen zijn geïnjecteerd in 0,5 pi. Het injecteren van grotere hoeveelheden dan aanbevolen kan leiden tot een tumorcel reflux door de naald-darmkanaal, met als resultaat exophytic (Figuur 1), in plaats van intracraniale groei van de tumor. Na de intrekking van steekproef voor intracraniële injectie moet de resterende celsuspensie geplaatst worden in ijs, met inhoud vaak gemengd om de juiste concentratie te behouden bij het invullen van intracraniale tumor oprichting tussen de leden van een injectie-serie. 2. Tumorcel Implantatie Let op, zijn alle procedures die hieronder worden beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Gebruik en onderhoud Comite aan de Universiteit van Californië in San Francisco. <ol><li> De chirurgische gebied moet worden opgesteld door alle oppervlakken spuiten met een ontsmettingsmiddel, zoals 2% chloorhexidine-oplossing. Na het gebruik van het desinfectiemiddel, moeten de volgende benodigdheden worden geplaatst in de chirurgische gebied: <ul><li> Verwarming pad om de muis lichaamstemperatuur te handhaven </li><li> Twee kleine Petrischalen, een met 3% waterstofperoxide, en een met 2% chloorhexidine </li><li> Steriel gaas en wattenstaafjes </li><li> Steriele disposable scalpels </li><li> Geautoclaveerd chirurgische nietmachine </li></ul></li><li> Voor anesthesie een geïnjecteerd verdoving moet worden gebruikt, meestal een ketamine-xylazine mengsel. </li><li> Zodra een muis is verdoofd, wordt de hoofdhuid voorbereid door zwabberen meerdere malen met een stuk steriel gaasje gedoopt in de chloorhexidine oplossing. Oogzalf moet worden toegepast om voldoende vocht vast te houden tijdens de procedure. Met behulp van een steriel scalpel, compleet een sagittale snede over de parietooccipitalis bot, ongeveer 1 cm lang. De blootgestelde schedel oppervlak wordt vervolgens gereinigd met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in een 3% waterstofperoxide-oplossing. De bregma moet duidelijk zijn op dit punt (zie video). </li><li> De coördinaten voor injectie van tumorcellen is afhankelijk van de gewenste site voor tumor vestiging. De volgende staat voor de procedure die wij gebruiken voor intracerebrale tumor oprichting 2 in een neuroanatomische locatie waar veel hersentumor patiënten ervaren de ontwikkeling van tumoren. Andere locaties van belang in hersentumor onderzoek zijn de pons, voor anatomische modellering van hersenstam tumoren 3, en subdurale injecties voor het modelleren van de locatie van meningeale tumoren 4. Voorafgaand aan de tumorcel injectie, gebruik van een steriele 25 gauge scherpe naald om het doorprikken van de schedel bij 2 mm aan de rechterkant van de bregma en 1 mm juist voor de coronale hechtingen, waardoor een opening voor de injectie van tumorcellen (zie video). Deze procedure werkt goed voor zowel de muizen en ratten (22 gauge naald voor ratten). </li><li> Voorafgaand aan de tekening cellen in de injectiespuit, meng de inhoud van de celsuspensie door te tikken met je vinger. Plaats de spuit met de gewenste hoeveelheid celsuspensie, zorg ervoor om te voorkomen dat het creëren van luchtbellen. De buitenkant van de spuit moet dan worden gereinigd met een alcoholdoekje om de buitenkant vrij van hechtende cellen, die zal helpen bij het voorkomen extracraniële tumor totstandkoming en groei (Figuur 1A) af te vegen. Om ervoor te zorgen dat de juiste injectie diepte is bereikt, gebruik een scalpel tot 3 mm uit de puntige uiteinde van een P20 pipetteman tip snijden. Dit gedeelte van de tip kan worden gemonteerd op de spuit en zal handelen om de injectie diepte te beperken, en zal bovendien ervoor zorgen dat de tip van de naald is 3 mm van de onderkant van de schedel. Plaats de spuit loodrecht op de schedel en in het gat eerder gemaakte, en injecteer langzaam de celsuspensie (een 3μL schorsing moet geïnjecteerd worden over een periode van 1 minuut). Een ongepaste hoek van de spuit inbrengen kan resulteren in intraventriculaire injectie van cellen en de daarop volgende spinale verspreiding (Fig. 1B: rechts) Op de voltooiing van injectie de naald weg in de plaats nog een minuut, dan langzaam terug te trekken (zie video): deze stappen zullen bijdragen tot het verminderen tumorcel reflux. </li><li> Als alternatief voor het zonder hulp of vrije hand benadering van de intracraniale tumor cel implantatie 5, kan men gebruik maken van een klein dier stereotactische frame (panel F van schematisch overzicht), die over het algemeen bevordert meer consistente injectie locatie, maar ten koste van aanzienlijke hoeveelheden procedurele tijd. In onze ervaring, kunnen twee chirurgische medewerkers injecteren zoveel als 60 muizen / uur bij gebruik van de vrije hand benadering, terwijl de maximale injectiesnelheid met een klein dier stereotactische frame is ongeveer 15 muizen / uur. Procedurele eigenbelang is een belangrijke overweging bij het injecteren grote series van muizen, en het verminderen van de tijd waarin tumorcellen, te worden geïnjecteerd, worden achtergelaten op het ijs. </li><li> Reinig de schedel met 3% waterstofperoxide en droog met een steriel droog wattenstaafje. Breng een steriel bot was om het gat. Met behulp van een tang, bij elkaar trekken van de hoofdhuid over de schedel en nieten te sluiten. Voor een optimale genezing, moet de hoofdhuid worden geniet met de dermis van elke zijde van de hoofdhuid tegen elkaar (onderkant tegen de onderzijde). Het geniet hoofdhuid moet worden gereinigd met Chloorhexidine-oplossing, en buprenorfine vervolgens toegediend door subcutane injectie voor post-operatieve pijn. </li><li> Monitor alle muizen post-operatief totdat ze ambulant en behouden van normale activiteit. Typisch, herstel tijd is ongeveer 30 minuten. </li></ol> 3. Bioluminescentie Monitoring van de tumorgroei <ol><li> Achtergrond. Bioluminescentie imaging (BLI) is gebaseerd op de oxidatie van luciferine [d-(-) -2 - (60-hydroxy-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carbonzuur] in de aanwezigheid van zuurstof en adenosine trifosfaat (ATP). Deze reactie wordt gekatalyseerd door het enzym luciferase, die chemische energie omzet in fotonen met de daaruit voortvloeiende emissie van licht. Menselijke cellen kunnen worden aangepast om luciferase te drukken (zie hieronder), met alleen luciferase expressie cellen die in staat van de uitstoot van licht in de aanwezigheid van de luciferine substraat. Er is een minimale achtergrond luminescentie van dieren hosts behandeld met luciferine, zodanig dat er een zeer gunstige signaal-ruisverhouding voor het detecteren van luminescentie emissies van luciferase-gemodificeerde tumorcellen, waardoor zeer gevoelige controle van de tumorgroei en de respons op de therapie in vivo. Bovendien hebben luciferase en haar substraat, luciferine, is aangetoond dat niet-giftig voor cellen van zoogdieren, en we hebben gezien geen functionele verschillen tussen de cellen die luciferase ten opzichte van de overeenkomstige niet-gemodificeerde cellen. Luciferine passeert gemakkelijk celmembranen en de bloed-hersen barrière na intraperitoneale (ip) of intraveneuze (iv) injectie bij muizen, waardoor beeldvorming van elk compartiment dat luciferase-gemodificeerde cellen bevat. Het niveau van de foton-emissie en het spectrum van het uitgestraalde licht van de luciferase-gemodificeerde cellen voldoende is om weefsels van kleine proefdieren, zoals muizen en ratten binnen te dringen, en kan extern worden gedetecteerd met weinig licht camera's. De niet-invasieve aard van de bioluminescentie beeldvorming laat herhaaldelijke controle van de tumorgroei en de respons op de therapie in individuele dier vakken. </li><li> Geïmplanteerd cel bronnen moeten stabiel worden aangepast voor vuurvlieg luciferase expressie. Een dergelijke cel bronnen kunnen worden gekocht, of geproduceerd in individuele laboratoria met behulp van lentivirus die zijn gebouwd voor constitutieve expressie van luciferase. Wij raden het gebruik van cellen gemodificeerd met luciferase-codering lentivirus, in plaats van plasmide, om een ​​stabiele cellulaire expressie van luciferase in vivo, die nodig is voor de kwantitatieve luminescentie imaging ervoor te zorgen dat nauwkeurige indicatie van de wijzigingen voorzien in tumorbelasting voor individuele dieren onderwerpen die herhaaldelijk worden afgebeeld in de loop van een experiment. </li><li> BLI monitoring. We raden aan het uitvoeren van kwantitatief bioluminescentie imaging (qBLI) 1x-2x per week, vanaf een week na de tumorcel injectie. Onze qBLI is uitgevoerd met behulp van de IVIS Lumina imaging station (Remklauw Life Sciences), en onze resultaten geven aan soortgelijke gegevens zijn verkregen in het gebruik van de IVIS Lumina, de IVIS 150, of de IVIS 200 imaging station. Ter voorbereiding voor imaging, muizen tegelijkertijd verdoofd met ketamine / xylazine en toegediend luciferine (D-Luciferine kaliumzout, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) via intraperitoneale injectie, met muizen afgebeeld 12 minuten na de injectie. De farmacokinetiek van luciferine geven aan dat de tijd tussen de administratieveconcentratie van luciferine en de bepaling van cel-luminescentie moet worden tussen de 10-15 minuten na de injectie van luciferine, om maximale luminescentie emissie en de grootste gevoeligheid van de detectie te verkrijgen. De lengte van de tijd die u selecteert in de 10-15 minuten tijdsinterval moet worden gehandhaafd als constant onder de dieren die worden afgebeeld. Het is uiterst belangrijk om de samenhang in de lengte van de tijd tussen de injectie van luciferine en het verkrijgen van BLI lezingen. Regio's van belang omvat de intracraniale gebied van signaal worden gedefinieerd met behulp van Living Image software (figuur 2), en de totale photons/s/sr/cm2 (fotonen per seconde per steradiaal per vierkante cm) zijn opgenomen (zie video). </li><li> Data-analyse. Overwegende dat de groei van de tumor en de reactie op de therapie worden gecontroleerd bij individuele dieren, raden we de behandeling groepen van minimaal 8 voor het vergroten van de statistische zekerheid van de conclusies ten aanzien van tumorrespons, of het ontbreken daarvan, op de behandeling. Met betrekking tot het presenteren qBLI resultaten worden luminescentie metingen omgezet in genormaliseerde waarden door te delen elke muis en luminescentie, verkregen tijdens en na voltooiing van de therapeutische behandeling, met de bijbehorende maximale voorbehandeling luminescentie het lezen van 6,7. Om te overleven analyse, is de Kaplan-Meier schatter 8 gebruikt, en van waaruit overlevingscurven worden gegenereerd, en de mediane overleving waarden bepaald. Verschillen tussen de overlevingscurven worden vergeleken met behulp van een log-rank test 9. </li><li> Ophalen van de hersenen voor de daaropvolgende analyse van de behandelde en onbehandelde tumor. Bij het dier euthanasie, moet de hersenen van de muis snel worden weggesneden (zie video), en ofwel geplaatst in formaline voor de verdere analyse van de tumor morfologie en immunohistochemie, of moet worden gemonteerd in oktober voor het monster het vriespunt. </li></ol> 4. Representatieve resultaten In het voorbeeld in figuur 3A, werden muizen die intracraniale tumor cel injectie gecontroleerd op intracraniële luminescentie totdat opeenvolgende betekenen luminescentie aangegeven waarden progressieve groei van de tumor, en op welk moment dat de therapie werd geïnitieerd (grijze pijl vanaf dag 34: erlotinib dagelijks toegediend aan 150 mg / kg tot gewenste euthanasie). Luminescentie waarden voor elke muis zijn ingesteld op een genormaliseerde waarde van 1 op het moment van starten van de behandeling, met latere luminescentie metingen voor elke muis genormaliseerd zijn uiteindelijke voorbehandeling imaging waarde. Als voorbeeld, een muis met een laatste voorbehandeling luminescentie lezing van 2,0 x 10 7 fotonen / sec bij 34 dagen, waarvan luminescentie was gestegen tot 6,0 x 10 7 fotonen / sec op dag 38, zou een dag 38 genormaliseerde luminescentie waarde van 3,0. De gemiddelde genormaliseerde bioluminescentie en de bijbehorende standaardfout voor controle en behandeling groepen zijn weergegeven voor elk beeldvorming tijdstip. In dit voorbeeld, een significant verschil in gemiddelde genormaliseerde luminescentie is duidelijk op het eerste imaging tijdstip na de start van de behandeling (dag 38), met het verschil in de gemiddelde groep luminescentie waaruit blijkt dat verdere verhoging van op latere tijdstippen. In de meeste gevallen is het anti-tumor activiteit van de therapie, zoals aangegeven door qBLI, vergezeld van een overeenkomstige significant verschil in overleving (dat wil zeggen, p &lt;0,05), zoals hier het geval is (Figuur 3B). Panelen 3C en 3D-tonen aangrenzende hematoxyline &amp; eosine en anti-EGFR gekleurde coupes van de hersenen van muizen verkregen op het moment van euthanasie, na plaatsing van gereseceerd de hersenen in formaline en de daaropvolgende paraffine-inbedding voor het snijden. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Indicaties van intracraniale injectie fouten. A) Exophytic (extracraniale) groei van de tumor (rode cirkel) kan worden veroorzaakt door een te groot injectievolume, de resterende celsuspensie aan de spuit, of van intrekking van de injectiespuit te snel na het inspuiten van de tumorcellen. B) Het injecteren van tumorcellen in de hartkamers kan leiden tot spinale de verspreiding van de tumor (muis naar rechts), in tegenstelling tot de juiste ingespoten tumorcellen, het signaal voor die blijft gelokaliseerd op de injectieplaats (muis naar links). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Verhit kaartbeeld representaties van bioluminescentie intensiteit voor representatieve muizen van de controle (links) en behandeling (rechts) groepen van een reactie op de therapie experiment. The Living Image software kan worden ingesteld op de regio's van belang (rode cirkels) te definiëren, of instrument operators kunnen handmatig definiëren de regio's van belang. Voor het gebruik van beelden, zoals deze voor figuur bouw, raden wij aan dat het instrument exploitant Heat Map foto's met behulp van dezelfde bioluminescentie Heat Map bereik (bovenste deel van de figuur), een visuele weergave van de omvang van bioluminescentie verschil tussen dierlijke onderwerpen laat zien. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Bioluminescentie, overleving, en tumorweefsel analyse van een experiment waarin de therapeutische respons is duidelijk. A) Plot van de gemiddelde bioluminescentie metingen voor controle en behandeling groep muizen, met standaardfout voor ieder beeldvorming punt. B) Survival plot voor dezelfde muizen; p-waarde bepaald door het gebruik van log-rank test 7. C) H &amp; E gekleurde gedeelte van de hersenen van muizen met een tumor. D) EGFR gekleurde sectie. E en F) Vergrotingen van de aangegeven gebieden van panelen C en D, respectievelijk met paneel E met negatieve kleuring voor tumor suppressor eiwit PTEN.

<ol><li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li>
<li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+T+%22CNS+Cancer%3A+Models%2C+Markers%2C+Prognostic+Factors%2C+Targets%2C+and+Therapeutic+Approaches%22">CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches</a>. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).</li>
<li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li>
<li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li>
<li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression%3A+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li>
</ol>

Orthotope (intracraniale) hersentumor xenograft-instelling biedt een passend micro-omgeving voor het modelleren van 10 CNS kanker te worden getest therapeutische respons. Dit type van modellering geeft bovendien informatie over de therapeutische toegang tot de hersenen en hersentumor, dat is van cruciaal belang om te bepalen of een experimenteel middel zou moeten worden voortgezet om de klinische trial evaluatie bij patiënten. Omdat de hoeveelheid van intracraniële xenograft tumor kan niet direct worden gemeten, zoals door remklauwen, longitudinale monitoring van intracraniale tumorgroei en de respons op de therapie vereist niet-invasieve beeldvorming, met onze ervaring leert bioluminescentie beeldvorming als de meest praktische aanpak voor experimenten die als hoofddoel is het beoordelen van de omvang van de tumor respons op therapie. Wanneer de resultaten van bioluminescentie beeldvorming worden gecombineerd met dier te onderwerpen survival analyse, de twee data sets zorgen voor een krachtige en betrouwbare aanpak voor het evalueren van experimentele therapeutische werkzaamheid. Ten slotte is het uitermate belangrijk dat de intracraniale hersentumor xenotransplantaten worden geoogst geëuthanaseerd dier onderwerpen, ten einde morfologische en moleculaire effecten van de therapie te beoordelen, en voor dit geven wij de voorkeur hele brein resectie op het moment van euthanasie, met behoud van gereseceerd hersenen voor verdere analyse. Overwegende dat de voorgaande presentatie is gemaakt die specifiek zijn voor hersentumor onderzoek, de concepten zijn zeker generalizeable aan andere menselijke kankers die vatbaar zijn voor orthotope modellen in knaagdieren.

<table><tbody><tr><td>Wegwerpscalpels</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>Warmtepit</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>2% Chloorhexidine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>3% Waterstofperoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>25g Naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10ul Hamilton Sharp Microspuit</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Huidnietapparaat en nietjes</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxisch frame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferine</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>Kaliumzout</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tot vaststelling van intracraniële hersentumor xenotransplantaten met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie imaging

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantatie-modellen met menselijke hersentumor cellen hebben gediend een essentiële functie in de neuro-oncologie onderzoek voor vele jaren. In het verleden, de meest gebruikte procedure voor menselijke tumor xenograft oprichting bestond uit de verzameling van cellen van cultuur flessen, gevolgd door de onderhuidse injectie van de verzamelde cellen in immuungecompromitteerde muizen. Overwegende dat deze aanpak nog steeds ziet frequent gebruik in veel laboratoria, is er een belangrijke verschuiving in accent de afgelopen tien jaar naar orthotope xenograft vestiging, die in het geval van hersentumoren, tumorcel injectie nodig naar geschikte neuroanatomische structuren. Omdat intracraniële xenograft oprichting elimineert de mogelijkheid om de groei van tumoren door middel van directe meting, zoals het controleren door het gebruik van remklauwen, de accentverschuiving naar orthotope hersentumor xenotransplantaatmodellen is noodzakelijk het gebruik van niet-invasieve beeldvorming voor de beoordeling van tumorlast in host dieren. Van de momenteel beschikbare beeldvormende technieken, is bioluminescentie de controle over het algemeen beschouwd als de beste combinatie van gevoeligheid, opportunisme, en de kosten te bieden. Hier zullen we demonstreren procedures voor orthotope hersentumor vestiging, en voor het toezicht tumorgroei en de respons op de behandeling bij het testen van experimentele therapieën.

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Transplantatiemodellen met menselijke hersentumorcellen vervullen al vele jaren een essentiële functie in het neuro-oncologisch onderzoek. In het verleden waren de meest ...

Gedurende vele jaren bestonden transplantatiemodellen met menselijke hersentumorcellen voornamelijk uit subcutane injectie in immuungecompromitteerde muizen. Onlangs is er een verschuiving opgetreden naar injectie in de passende anatomische structuur: de hersenen.In dit video-artikel worden intracraniële tumoren bij muizen geïnduceerd met een injectiemethode waarbij een gat in de schedel wordt gemaakt en een naald wordt gebruikt om tumorcellen te injecteren die zijn gemodificeerd voor bioluminescentie-imaging. Na de operatie worden de tumorgroeisnelheid en de respons op de behandeling gemonitord. Met behulp van een bioluminescentie-imagingstation, overlevingsanalyse en histopathologische en eiwitexpressieanalyse kunnen de resulterende gegevens vervolgens worden gebruikt om de effectiviteit van experimentele therapieën voor hersentumoren te evalueren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neuro-oncologie, zoals de vraag of het antitumorale middel de hersenen kan bereiken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van hersentumoren bij patiënten, omdat we menselijke hersentumoren behandelen die zijn gekweekt in een dierlijke gastheer. Werk onder een weefselkweekkap. Bereid subcutane tumorcellen voor voor overdracht naar het intracraniële compartiment.Begin met het plaatsen van de uitgesneden flanktumoren in weefselkweekschalen. Maal het weefsel fijn met een scalpel. Gebruik vervolgens een pipetteerder om het weefsel mechanisch te disrupteren en zo een suspensie van celaggregaten te creëren.Filter vervolgens de suspensie van celaggregaten door een zeef met een nylon mesh-filter van 70 micrometer en vang deze op in een ronde bodembuis. Herhaal dit proces in totaal drie keer om een enkelcel-suspensie te verkrijgen die geschikt is voor intracraniële injectie. Centrifugeer de suspensie bij 1000 RPM gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Aspireer na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de celpellets in een geschikt volume serumvrij medium om een uiteindelijke werkconcentratie te verkrijgen als alternatief voor de disaggregatie van subcutane tumoren.Tumorcellen kunnen worden geoogst uit celculturen met gevestigde hersentumorcellijnen. Oogst de cellen met trypsine gevolgd door centrifugatie.Resuspendeer de cellen na de centrifugatie in het juiste volume serumvrij DMEM voor supertentoriale injecties met de hand. Bereid drie tot vijf keer 10⁵ cellen voor in 3 µL. Desinfecteer het operatieve gebied door alle oppervlakken te besproeien met 2% chloorhexidine.Plaats vervolgens de volgende benodigdheden in het operatiegebied. Een warmtemat om de lichaamstemperatuur van de muis te handhaven. Twee kleine petrischalen, waarvan één 3% waterstofperoxide bevat en één 2% chloorhexidine, steriele gaasjes en wattenstaafjes, steriele wegwerpscalpels en een geautoclaveerde chirurgische nietmachine.Zodra de muis is geanestheseerd met een mengsel van ketamine en xylazine, wordt het operatiegebied meerdere keren gereinigd met steriele gazen gedrenkt in chloorhexidine. Breng een zalf aan om tijdens de procedure voldoende vochtigheid te behouden. Maak met een steriel scalpel een sagittale incisie over het pariëtale occipitale bot, ter lengte van ongeveer één centimeter.Reinig het blootgestelde oppervlak van de schedel met een wattenstaafje gedrenkt in een 3% waterstofperoxideoplossing. De bgma moet op dit punt zichtbaar zijn om een opening te creëren voor de injectie van tumorcellen. Gebruik een steriele 25 gauge scherpe naald om de schedel te ponceren.Twee millimeter rechts van bgma en één millimeter anterieur van de coronale sutuur. Meng de inhoud van de celsuspensie door te tikken. Vul de spuit met de gewenste hoeveelheid celsuspensie.Voorkom de vorming van luchtbellen. Maak de buitenkant van de spuit schoon met een alcoholgaasje om eventuele aanhechtende cellen te verwijderen. Zoals hier wordt getoond, helpt dit om de vestiging en groei van extra craniële tumoren te voorkomen en om ervoor te zorgen dat de juiste injectiediepte wordt bereikt.Wanneer er geen stereotactisch apparaat voor kleine dieren wordt gebruikt, gebruik dan een scalpel om drie millimeter van het gepunte uiteinde van een P 20 pipetpunt af te snijden. Plaats het puntsegment over de spuit om de injectiediepte te beperken, zodat de punt van de spuitnaald zich drie millimeter onder de onderkant van de schedel bevindt. De volgende stap in de procedure is waarschijnlijk het moeilijkste aspect van de gehele methode bij het uitvoeren van de volgende injectie; het bereiken van de juiste diepte en de toediening zijn van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de tumor wordt gevestigd en groeit op de juiste locatie in de hersenen.Plaats vervolgens een spuit loodrecht op de schedel in het gat en injecteer langzaam de cel-suspensie. Het injecteren van grotere volumes dan aanbevolen kan leiden tot reflux van tumorcellen via het naaldenkanaal, wat resulteert in fytische in plaats van intracraniale tumorgroei. Zoals hier getoond, kan een onjuiste hoek van de spuitinbrenging leiden tot intraventriculaire injectie van cellen en daaropvolgende spinale verspreiding, zoals hier te zien is na voltooiing van de injectie.Laat de naald nog een minuut op zijn plaats staan en trek deze vervolgens langzaam terug. Deze stappen helpen om reflux van de tumor te voorkomen. Reinig de schedel met 3% waterstofperoxide en droog deze af.Gebruik een steriel wattenstaafje. Breng met een pincet steriel botwas aan in het gat. Trek de hoofdhuid over de schedel samen waarbij de dermis van beide zijden tegen elkaar wordt gedrukt, onderzijde tegen onderzijde, en zet deze vast met nietjes.Reinig vervolgens de hoofdhuid met chlohexidine. Dien buprenorfine toe via een subcutane injectie voor postoperatieve pijnstilling. Hoewel hier niet getoond, wordt de buprenorfine snel geabsorbeerd.Ga verder met het injecteren van extra muizen. Zorg ervoor dat de cellen tussen de injecties door worden gemengd om een passende concentratie tussen de leden van een injectieserie te behouden. Behandelingsgroepen van ten minste acht dieren worden aanbevolen om te helpen statistisch betekenisvolle resultaten te garanderen.Houd alle muizen postoperatief in de gaten totdat ze weer kunnen lopen en hun normale activiteit hervatten. Gewoonlijk is de hersteltijd ongeveer 30 minuten, beginnend één week na de injectie van de tumorcellen. Kwantitatieve bioluminescentie-imaging of QBLI moet één of twee keer per week worden uitgevoerd. Hier.QBLI wordt uitgevoerd met het IVIS Lumina Imaging-station en de living image software versie 3.2. Selecteer het living image softwareprogramma vanuit het Windows-startmenu. Zodra het programma is geopend, klikt u op de knop 'initialized IVIS system' in het camera-bedieningspaneel.Na de initialisatie moet het vak voor de temperatuurstatus groen zijn, wat aangeeft dat de CCD-camera adequaat is gekoeld. Plaats de geanestheseerde, met luciferine geïnjecteerde muis op de tafel van de beeldkamer. Open een van de opgeslagen bestanden uit uw beeldsessie en wijzig de weergave van de beeldgegevens van counts naar fotonen. Om het aantal fotonen per seconde van het doelsignaal te bepalen, selecteert u het cirkelicoon in het ROI-vervolgkeuzemenu.Een regio van belang, aangeduid als ROI, moet rond het doelsignaal verschijnen. Het signaal moet worden ingevoerd in een Excel-bestand waarin het diernummer en de dag van beeldvorming zijn aangegeven. Herhaal deze reeks voor alle dieren die tijdens uw beeldvormingssessie zijn geanalyseerd.Zodra de fotonantallen voor elke gefotografeerde muis zijn bepaald en de fotonwaarden naar een Excel-bestand zijn overgebracht, worden de luminescentiewaarden omgezet in genormaliseerde waarden. Dit gebeurt door de luminescentie van elke muis, gemeten tijdens en na voltooiing van het therapeutische regime, te delen door de overeenkomstige maximale luminescentie vóór de behandeling. Om overlevingsanalyses uit te voeren met Prism-software, wordt de Kaplan-Meier-schatter gebruikt om overlevingscurves te genereren en de mediane overlevingstijden te schatten.Verschillen tussen overlevingscurves worden vergeleken met behulp van een log-ranktoets. Euthanasie van het dier dient te worden uitgevoerd als het dier een significante achteruitgang in gezondheid vertoont, in het bijzonder bij een gewichtsverlies van meer dan 20% van het maximale gewicht. Verwijder snel de hersenen van de geëuthanaseerde muis en plaats de hersenen in formaline voor de daaropvolgende analyse van de tumormorfologie en immunohistochemie.Dit voorbeeld toont de gemiddelde genormaliseerde luminescentiewaarden voor muizen die een intracraniële injectie van tumorcellen ontvingen, waarbij de therapie met erlotinib werd gestart op dag 34. De foutenbalken geven de standaardfout aan. Een significant verschil in de gemiddelde genormaliseerde luminescentie is duidelijk zichtbaar op het eerste beeldvormingstijdstip na de start van de therapie. Het verschil in de gemiddelde groepsluminescentie vertoont in de meeste gevallen een verdere toename op opeenvolgende tijdstippen.Therapie-geïnduceerde antitumoractiviteit, zoals aangetoond door QBLI, gaat gepaard met een overeenkomstig significant verschil in overleving. Zoals hier het geval is, tonen hemfloxine- en eosinekleuringen van coupes van het in paraffine ingebedde muizenbrein het patroon van de tumorceldistributie. P10 is een marker die vaak geassocieerd wordt met de tumorrespons op EGFR-remming. Hier.Er is te zien dat de behandelde tumorcellen geen P 10-expressie vertonen, zoals blijkt uit de afwezigheid van bruine kleuring. Hier wordt een sectie van het in paraffine ingebedde muizenbrein getoond. EGFR-remmer-gevoelige hersentumorcellen kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van de bruine EGFR-kleuring.Zoals u heeft gezien, is het meest uitdagende aspect van deze procedure de correcte injectie van de tumorcellen. Welk vervolgexperiment kan met deze benadering worden uitgevoerd, zoals het onderzoeken van de effecten van genetische modificaties van tumorcellen op de groei? Dat is alles.Ik hoop dat u deze presentatie nuttig vond. Veel succes met uw experimenten.

establishing-intracranial-brain-tumor-xenografts-with-subsequent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode voor het betrouwbaar enten van luciferase-gemerkte menselijke maligne perifere zenuwschede tumorcellen in de heupzenuw van immunodeficiënte muizen wordt beschreven. Het gebruik van bioluminescentie imaging om een ​​goede invoering van de tumor enten en criteria voor willekeurige scheiding van dieren in studiegroepen aan te tonen worden ook besproken.

Orthotope Xenografting van de Mens Luciferase-label maligne perifere zenuwschede tumorcellen voor In vivo Het testen van de kandidaat-therapeutische middelen

Bioluminescentie beeldvorming van hypoxie induceerbare factor-1α-activiteit wordt toegepast op intracraniale tumor hypoxie ontwikkeling in een borstkanker hersenmetastasen muismodel te controleren.

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

Source: Ciraku, L., et. al. An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the imaging of luciferase-expressing tumor cells in an organotypic mouse brain slice. Luciferin is added to the medium, and the plate is placed inside the chamber of the in vivo imaging system. Parameters for image capture are adjusted, and the tumor's shape and size are defined. The bioluminescent signals emitted by the tumor...

Bioluminescence Imaging to Assess Tumor Growth in an Organotypic Mouse Brain Slice

Source: Clark, A.J., et al. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates bioluminescence imaging to track glioblastoma progression in an immunocompetent mouse model, using luciferase-expressing tumor cells and luciferin to quantify tumor growth non-invasively.

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Mouse Model for Glioblastoma

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer intracraniële xenotransplantatie van menselijke hersentumoren in muizen met bioluminescentiebeeldvorming. Deze methode maakt real-time monitoring van tumorgroei en therapierespons mogelijk voor preklinisch onderzoek.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging (Video) | JoVE Journal

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Meer video's verkennen