Patroon fotostimulering met Digital Micromirror Apparaten voor het Dendritische Integratie Onderzoek Across Branch Punten

Het algemene doel van deze procedure is om complexe lichtpatronen in tijd en ruimte te beheersen zodat ze kunnen worden gebruikt om neuronen te stimuleren. Dit wordt bereikt door eerst een DMD-chip op een geschikte geconjugeerde beeldvlak in het optische pad van de microscoop te plaatsen. De tweede stap van de procedure is om de DMD goed te belichten met een intense lichtbron zoals een laser.

De derde stap van de procedure is om het stipeffect van coherente verlichting te elimineren. De laatste stap van de procedure is om een grafische gebruikersinterface te integreren om de DMD-chip te manipuleren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die experimenten tonen die voorheen moeilijk uit te voeren waren, maar nu relatief eenvoudig kunnen worden voltooid door middel van multi-site lysis van kooi-neurotransmitter met behulp van het DMD-systeem.

Hallo, ik ben Michael Mohammed en het laboratorium van Dr. Chaman Tang aan de University of Maryland Department of Neurology. Vandaag laten we je een procedure zien voor het genereren van complexe eliminatiepatronen in een optische microscoop. We gebruiken deze procedure in ons lab om dendritische integratie te bestuderen.

Dus laten we beginnen. Dit protocol zal de werking van een digitaal microspiegelapparaat of DMD-verlichtingssysteem voor experimentele neurowetenschap demonstreren. Een DMD is een optische halfgeleiderchip met enkele honderdduizend microscopische beweegbare spiegels gerangschikt in een rechthoekige matrix. Op zijn oppervlak komt de positie van elke spiegel overeen met het pixel van een afbeelding.

Elke spiegel kan afzonderlijk worden bestuurd om tussen twee oriëntaties te kantelen. In de uit-oriëntatie wordt het licht weggeleid van de optische as van specimenverlichting. In de aan-oriëntatie wordt het licht langs de optische as geleid.

DMD is goed geschikt voor lysis omdat het zeer intense UV-licht verdraagt, hoge contrastverhoudingen genereert tussen de aan- en uit-pixels en kan schakelen tussen de twee toestanden in tientallen microseconden. De toepassing van DMD's voor biomedisch onderzoek wordt geholpen door het brede gebruik van software en hardware voor beeldmanipulatie, en door commercieel belang in het beeldweergaveveld. Modulaire componenten worden op de markt gebracht door Texas Instruments als DLP-ontdekkingskits die de ondersteunende elektronische stuurprogramma's bieden om de DMD aan te passen aan een microscopisch systeem.

Basisconcepten met betrekking tot de optica van microscopie moeten worden begrepen. De basismoderne fluorescentiemicroscoop bestaat uit een beeldvormingspad en een verlichtingspad. Het bestaat uit een objectief, een filterkubus en twee verschillende buislenzen voor het beeldvormings- en verlichtingspad.

De microscoop is ontworpen om posities te hebben die geconjugeerd zijn aan het specimenbeeldvlak, waar objecten in focus op het specimenvlak ook in focus zullen verschijnen op deze geconjugeerde beeldvlakken. Een gevolg van dit concept is dat elk helder beeld dat op het geconjugeerde beeldvlak wordt gecreëerd, ook scherp zou worden geprojecteerd op het specimenbeeldvlak. Deze strategie wordt gebruikt om een computergegenereerd verlichtingspatroon op het specimen te projecteren.

De laserstraal dient als een zeer heldere lichtbron die het patroon zal verlichten dat wordt geïmplementeerd door de microspiegels op de DMD-chips die op een geconjugeerd beeldvlak zijn gepositioneerd. De ontwerp van een DMD-verlichtingssysteem hangt af van de excitatielichten die worden gebruikt voor optogenetische experimenten, die licht in de zichtbare golflengte gebruiken. Het verlichte patroon kan door het camerapad worden gebracht.

Daarom kan de DMD-chip eenvoudig worden gemonteerd op een van de twee camerapoort van een module met dubbele camerapoort. Omgekeerd, voor experimenten die licht in het UV-bereik gebruiken, zoals lysis van gekooide verbindingen, moet het licht door het epi-verlichtingspad worden gebracht en moet een meer toegankelijke geconjugeerde beeldvlak worden gecreëerd. Dit komt omdat de beeldvormingsbuislens niet is ontworpen voor UV-overdracht.

In plaats daarvan wordt de verlichtingsbuislens gebruikt voor UV-overdracht en doet een adequaat werk bij beeldvorming. Elke microspiegel op de DMD kan schakelen tussen een positieve en een negatieve 12 graden kantelen ten opzichte van het vlak van de chip. Afhankelijk van de digitale invoer die het ontvangt van de computer, is de rotatieas langs de diagonale hoeken van elke spiegel, 45 graden ten opzichte van de rechthoekige zijden van de chip.

De oriëntatie van de spiegelkantelen wordt aangeduid door een goudkleurig driehoekje op een hoek aan de voorkant van de chip. De kantelen van de microspiegel dicteert de uitlijning van de pitch en azimuth van de binnenkomende verlichtingsstraal. Om de DMD te verlichten, configureer eerst de pitch van de verlichtingsstraal om 24 graden te zijn van de loodrechte as van de DMD-chip en configureer de azimuth om loodrecht te zijn op de as van spiegelrotatie.

Precieze straaluitlijning is cruciaal voor efficiënte werking. Voor lysisexperimenten. Gebruik een laserbron om de hoog-intensiteits focusbare straal te genereren die nodig is voor snelle ontmanteling.

Hier wordt een quasi-continue diode-gepompte vastestaatfrequentie verdrievoudigd ND-laser ingezet, gebruik een relatief krachtige laser omdat slechts een klein deel van de laseruitvoer daadwerkelijk wordt afgegeven aan het specimen. Bij gebruik van een DMD-systeem, lanceer dan de uitvoer van de laser in een multi-modusvezel zodat deze gemakkelijk kan worden gepositioneerd en georiënteerd langs de juiste as voor het verlichten van de DMD om een oplossing te bieden voor de speckle. Probleem gegenereerd door coherente verlichting, zend het licht door de optische vezel.

De vezel wordt rond een pazo-elektrische vezelstretcher gewikkeld die wordt aangedreven om het rond 40 kilohertz te doen oscilleren. De microscopische rek van de vezel is voldoende om het specklepatroon vele malen tijdens de milliseconde duur van elke fotostimulatiepuls te verplaatsen, waardoor het specklen effectief wordt geëlimineerd. Ten slotte wordt de uitvoer van de optische vezel gecolleerd met een UV-microscoopobjectief om de DMD's te verlichten om de CCD-pixel met het DMD-beeldsoftware te co-registreren. Er werd software geschreven die individuele DMD-spiegels correleert met specifieke pixels van de beeldvormende CCD-camera.

De grafische gebruikers