Name: In-vivo Centrifugeren van Drosophila embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Leer organellen scheiden door dichtheid in levende Drosophila-embryo's met in-vivo centrifugatie. Deze methode vermijdt celdisruptie-artefacten en vergemakkelijkt colocalisatie-experimenten en biochemische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Susan Gerbi, Heidi Smith en David Lambert voor het leveren van materiaal om in-vivo test op centrifugeren Sciara coprophila en Ilyanassa obsoleta, respectievelijk. Wij danken de leden van de Welte lab voor commentaar op de techniek en manuscript. Ontwikkeling en verfijning van de in-vivo centrifugatie test werd gesteund door NIGMS verlenen GM64687 aan MAW. De beelden getoond in Fig. 1 en Fig. 5E, werden F eerder gepubliceerde 2 en worden hier met toestemming overgenomen.

<ol><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 2nd Edition, University Press. Oxford. 179-214 (1998).</li>
<li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A. Quantitative microinjection of Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 345-359 (2000).</li>
<li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li>
<li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+Drosophila+CID%2FCENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li>
<li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((unpublished+observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">unpublished observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 141-157 (2000).</li>
<li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport%3A+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li>
<li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+XXII%3A+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Embryology%22%5BJournal%5D)">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , Columbia University Press. New York. (1927).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li>
</ol>

Kritische stappen Zorg ervoor dat de agar concentratie hoog genoeg is. Als het te laag is, zal de agar uiteen tijdens het centrifugeren, en de embryo&#39;s zullen barsten of worden willekeurig georiënteerd zijn. Als de agar concentratie is net iets te laag is of als de agar nat is (onvoldoende gedroogd of onvoldoende verwijdering van overtollig TSS in stap 4.3), zal de embryo&#39;s uit hun holen drijven tijdens het centrifugeren en worden niet goed georiënteerd. Als de agar is te dun gegoten, zal het ook instorten of barsten tijdens het centrifugeren. Zorg ervoor dat de embryo&#39;s niet zijn gevorderd dan cellularization stadia. Anders zal de scheiding van organellen niet werken (Fig. 5C) sinds organellen zal worden afgezonderd in duizenden individuele cellen. Bij jongere embryo&#39;s aan de ene cel stadium, organellen zijn vrij om grote afstanden migreren en accumuleren volgens hun karakteristieke dichtheid. Om te voorkomen dat het analyseren van embryo&#39;s die te oud zijn, zorg ervoor dat (i) een pre-collectie om vrouwtjes aan oude eieren (stap 2.4), (ii) embryo&#39;s te verzamelen voor 3 uur of minder (stap 2.5), (iii) te leggen visuele wijze te selecteren embryo&#39;s voor cellularization podia voor inbedding in agar (stap 4.2), (iv) houdt inbedding de tijd kort is om ontwikkeling te voorkomen tot het einde van cellularization (stap 4.6), en (v) op de juiste gooi embryo&#39;s die niet laag (stap 5.6) . Niet beknibbelen op de centrifugeertijd. Hoewel sommige van de embryo&#39;s mooie gelaagdheid vertonen zelfs na slechts 10 minuten van centrifugeren, de scheiding is inconsistent van embryo tot embryo. 30 min spins geven zeer consistente resultaten. Ook, hoe langer de centrifugeertijd, des te langer de lagen zijn stabiel na het centrifugeren is beëindigd. Dit is belangrijk voor toepassingen waar het kost tijd om de embryo&#39;s proces verder voor gebruik (bijv. als ze moeten worden verwerkt voor transplantatie-experimenten of gemonteerd voor confocale analyse). Eventuele wijzigingen Ei-inzameling en verwijdering van chorion veel verschillende protocollen bestaan ​​voor de stappen 2 en 3 1, 3, 9, en zal evenals het werk van de die hier beschreven, zolang de gebruikte embryo&#39;s zijn jong, ei-opbrengst is hoog, en de fractie van mis- geënsceneerde embryo&#39;s wordt geminimaliseerd. Anterior-posterior uitlijning Het protocol richt alle embryo&#39;s zodanig dat het achterste uiteinde is begraven in de agar en het voorste einde is omhoog (afb. 3). Deze oriëntatie is goed voor de consistentie, zodat het mogelijk is om de micropyle te gebruiken als een mijlpaal, die uiteindelijk wees tijdens het centrifugeren (afb. 1, 5). Echter, met de praktijk, is het gemakkelijk te halen uit de oriëntatie van de gecentrifugeerd embryo&#39;s door het aparte verschijning van de lipide-druppel en eigeel lagen door helder-veld microscopie. Dan wordt het mogelijk om embryo&#39;s te monteren met de uiteinden omhoog; deze flexibiliteit versnelt de montage proces. Unoriented centrifugeren De meest tijdrovende en technisch uitdagende aspect van het protocol is het monteren van de embryo&#39;s in agar (stap 4). Het vereist het aanraken van elk embryo twee keer (een keer om te plaatsen in het gat en een keer om het te herstellen na centrifugeren). Als alternatief, kan een overdracht van embryo&#39;s bij stap 4.1 in microcentrifugebuizen gevuld met TSS. Wanneer deze buizen worden gecentrifugeerd in een microcentrifuge (13.000 rpm, 10-30 min), embryo&#39;s zullen ook meestal goed laag 10-13. Deze variatie maakt het mogelijk om honderden embryo&#39;s verwerken op hetzelfde moment heel snel. Echter, gelaagdheid is niet zo consistent, een fractie van de embryo&#39;s niet verschillende lagen te ontwikkelen, ondanks een veel hogere centrifugeren krachten (~ 16.000 g) dan toegepast in het protocol hierboven. Grotere uitdaging is het feit dat de oriëntatie van de embryo&#39;s variabele is, en men kan scheiden waarnemen in verschillende hoeken naar de grote embryo-as. Deze variabiliteit vereist dat de onderzoeker uit te sorteren na het centrifugeren hoe een bepaald embryo was geregeld in de centrifugebuis. Met het gebruik van de dooier autofluorescentie als een marker voor de meest dichte deel van het embryo, dat is het vaak mogelijk, maar het vereist veel oefening en meer betrouwbaar oordeel te doen. Als er voldoende embryo&#39;s in de steekproef, kan men in staat zijn om uit te zoeken die gevallen waarin embryo&#39;s gebeurd geregeld worden zoals in Fig. 1. Centrifugeren van embryo&#39;s in hun eischaal Het is mogelijk om embryo&#39;s te verankeren in agar voor stap 4, zonder het verwijderen van het chorion eerste 2. In deze benadering worden embryo&#39;s op de collectie plaat bedekt met halogene olie in plaats van 50% bleekmiddel in stap 3.2 (halogene draait het chorion doorschijnend). Embryo&#39;s van passende stadia worden geselecteerd en overgebracht naar een nieuwe agarplaat met een pincet, door het pakken alleen het ei filamenten met het pincet, schade aanhet embryo juiste is vermeden. Embryo&#39;s worden ingebed als in stap 4.4 door middel van 4,8, met de voorste ei filamenten steken omhoog uit het gat in de agar. De eierschaal wordt verwijderd door 50% bleekmiddel behandeling na de embryo&#39;s zijn gecentrifugeerd en gegraven uit de agar zoals in stap 5.4. Centrifugatie in aanwezigheid van de eierschaal kan het verbeteren van de snelheid van devitellinization na fixatie (stap 6.2), maar de selectie van de juiste podia voor centrifugeren (stap 4.2) is een grotere uitdaging. Toepassingen Embryo centrifugeren is vooral nuttig voor colocalization experimenten, dat wil zeggen, om te testen of een bepaald eiwit lokaliseert om een ​​bepaalde grote organel. Bijvoorbeeld, de Klar eiwit aanwezig is op de vroege embryonale lipide druppels, is maar deze lokalisatie uitdagend om aan te tonen in intacte embryo&#39;s. Voor een deel komt dit doordat zowel Klar puncta en lipide druppels zijn er in overvloed in het embryo periferie 10, het maken van valse colocalization moeilijk uit te sluiten. Echter, centrifugeren concentreert lipide druppels in een aparte laag, en dus, colocalization met Klar signaal duidelijk wordt 10. Soortgelijke analyse heeft ondubbelzinnig aangetoond dat de lokalisatie van andere eiwitten aan lipide druppels 8, 13-15, met inbegrip van verrassende voorbeelden zoals bepaalde histonen 2 en in gevallen waarin een eiwit aanwezig is alomtegenwoordig, maar verrijkt op lipide druppels 8. Omdat embryo&#39;s kunnen visueel worden geselecteerd door de ontwikkelingsfase (stap 4.2), is het zelfs mogelijk om op ontwikkelingsgebied geregeld werving van eiwitten te detecteren om lipide druppels 8, 15. Testen op colocalization met lipide druppels is bijzonder eenvoudig omdat lipide druppels hopen zich op in een visueel duidelijke &quot;cap&quot;, dus geen verdere marker of vlek is vereist om deze laag te identificeren. In feite, omwille van het gemak en mogelijk opvallende visuele resultaten (fig. 1, Fig. 5 D, E), ons laboratorium maakt gebruik van deze techniek nu routinematig als een eerste test of een kandidaat-eiwit is gelokaliseerd aan lipide druppels. In principe moeten dergelijke studies colocalization werk voor de andere organellen in Fig. 1, en waarschijnlijk voor anderen (waaronder intracellulaire parasieten), waarvan de distributie in gecentrifugeerd embryo&#39;s moet nog worden gedocumenteerd. Sinds centrifugeren concentreert zich organellen in strakke bands, vergemakkelijkt de isolatie van een fractie verrijkt met deze organellen. Deze aanpak is al gebruikt om lipide druppels te herstellen voor transplantatie in donor embryo&#39;s 2. Het kan ook mogelijk zijn om biochemisch te analyseren de verrijkte fractie (bijvoorbeeld door te snijden lagen uit embryo&#39;s na fixatie 15). De hier beschreven methode heeft toepassingen buiten Drosophila embryo&#39;s, zoals centrifugering kan worden gebruikt om de eieren van vele verschillende soorten (waaronder kikkers, nematoden, manteldieren, ringwormen, zee-egels, weekdieren, en Neteldieren) 16 stratificeren. In ons eigen laboratorium, hebben we het gebruikte protocol hierboven voor embryo&#39;s van de huisvlieg Musca domestica 2 en werkzaam unoriented centrifugeren in de analyse van embryo&#39;s uit de schimmel mug Sciara coprophila 17 en de slak Ilyanassa obsoleta 17. Tot slot, is deze methode niet beperkt tot embryo&#39;s: Centrifugeren kan ook nuttig zijn om andere grote cellen, zoals eicellen (bijvoorbeeld in Drosophila 2, 18 en de kroontjeskruid bug Oncopeltus fasciatus 17) stratificeren. Voor verschillende specimen, de exacte centrifugeren voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd: bijvoorbeeld 10 minuten bij 3000 g is voldoende om efficiënt te stratificeren embryo&#39;s van Musca domestica 2, en zo veel langer gecentrifugeerd, de embryo&#39;s hebben de neiging om uit elkaar te breken tijdens de fixatie en immunokleuring.

<table><tbody><tr><td>Petrischalen van 60x15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>Van Falcon</td></tr><tr><td>Metaalgaas</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>roestvrij staal type 304; maaswijdte #150 x150, draaddiameter: 0.0026 inches</td></tr><tr><td>Wolfraamnaalden</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>Moria vernikkelde pin/naaldhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Vliegkooien</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 of 59-101</td><td>Respectievelijk voor Petrischalen met een diameter van 65 mm of 100 mm</td></tr><tr><td>Halocarbon Oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo centrifugeren van drosophila embryo&#39;s

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Een belangrijke strategie voor het zuiveren en het isoleren van verschillende types van intracellulaire organellen is om ze van elkaar te scheiden op basis van verschillen in de opwaartse dichtheid. Echter, wanneer de cellen worden verstoord voorafgaand aan centrifugeren, eiwitten en organellen in deze non-native omgeving vaak ten onrechte aan elkaar plakken. Hier beschrijven we een methode om aparte organellen door de dichtheid in intacte, levende Drosophila embryo&#39;s. Vroege embryo&#39;s voordat cellularization worden geoogst van de bevolking kooien, en hun uiterlijke eierschalen worden verwijderd door behandeling met 50% bleekmiddel. Embryo&#39;s worden vervolgens overgebracht naar een kleine agar plaat en geplaatst, posterior eind eerste, in kleine verticale gaten in de agar. De platen met ingesloten embryo&#39;s worden gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 3000g. De agar ondersteunt de embryo&#39;s en houdt ze in een bepaalde oriëntatie. Daarna worden de embryo&#39;s gegraven uit de agar met een stompe naald. Centrifugeren scheidt grote organellen in verschillende lagen, een stratificatie goed zichtbaar door de heldere-veld microscopie. Een aantal van fluorescente markers zijn beschikbaar voor een succesvolle stratificatie te bevestigen in levende embryo&#39;s. Eiwitten in verband met bepaalde organellen zal worden verrijkt met een bijzonder laag, waaruit blijkt colocalization. Afzonderlijke lagen kunnen worden teruggewonnen voor biochemische analyse of transplantatie in donoreicellen. Deze techniek is van toepassing op organel scheiding in andere grote cellen, inclusief de eieren en eicellen van diverse soorten.

We beschrijven een methode om aparte organellen door de dichtheid in het leven<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s. Embryo&#39;s worden ingebed in agar en gecentrifugeerd. Deze techniek levert reproduceerbare scheiding van de belangrijkste organellen langs de anterior-posterior embryo as. Deze methode maakt colocalization experimenten en de opbrengst organel fracties voor biochemische analyse-en transplantatie-experimenten.

In-vivo Centrifugeren van Drosophila embryo&#39;s

Een belangrijke strategie voor het zuiveren en isoleren van verschillende typen intracellulaire organellen is om ze van elkaar te scheiden op basis van verschillen in ...

Het scheiden van de belangrijkste organellen in fruitvliegeieren op basis van dichtheid begint met het oogsten van embryo's die minder dan drie uur oud zijn. De eierschalen worden vervolgens verwijderd door na decoratie te incuberen in 50% bleekmiddel. Embryo's in gedefinieerde stadia worden gemonteerd in agar.Als laatste stap worden de embryo's gecentrifugeerd en teruggewonnen, waarna de teruggewonnen embryo's met witlicht- en fluorescentiemicroscopie worden onderzocht. Microscopie laat de lokalisatie van specifieke eiwitten in bepaalde organellen zien. Een belangrijke strategie voor het zuiveren en isoleren van intracellulaire organellen is om deze op basis van dichtheid te scheiden van alle andere celcomponenten, maar er is een uitdaging: cellen worden vóór centrifugatie opengebroken, waardoor eiwitten en organellen die normaal gesproken gescheiden zijn, nu gemengd raken.Moleculen klonteren aan elkaar onder deze niet-natuurlijke in vitro condities. Omgekeerd kunnen sommige eiwitten loslaten van structuren waaraan ze normaal gesproken binden. Het belangrijkste voordeel van de techniek die we zullen beschrijven, is dat deze scheiding op basis van dichtheid in vivo mogelijk maakt.Hierdoor wordt voorkomen dat cellen openbreken en ontstaan de daarmee gepaard gaande artefacten niet. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke celbiologische vragen. Het maakt colokalisatie-experimenten zeer eenvoudig en maakt de isolatie van specifieke organelfracties mogelijk voor transplantatie-experimenten en biochemische analyse.In deze procedure wordt agarmedium met een hoog agarpercentage dat appelsap bevat bereid en in petrischalen gegoten, zoals gedetailleerd in het bijbehorende geschreven protocol. De platen worden zowel bij de stap van de eiaflegging als bij de daaropvolgende embedding en centrifugatie van de embryo's gebruikt. Deze procedure begint met het initiëren van de eiverzameling.Bereid eerst een gistpasta door droge gist met water te mengen tot een consistentie van pindakaas; bedek vervolgens een gedeelte van een verse appelsap-agarplaat met de gistpasta. Volwassen vliegen worden gehouden in kooien waaraan aan de onderzijde agarplaten zijn bevestigd.Om de huidige plaat te verwijderen, keert u de vliegenkooi om en tikt u deze tegen het werkblad. Na een paar keer vallen de vliegen naar de bodem en zijn ze gedurende deze zeer korte periode kortstondig gedesoriënteerd. Vervang snel de oude agarplaat door de nieuwe plaat die is voorzien van een laag gistpasta.De gist dient als voeding voor de eiproductie en induceert, samen met het appelsap in de agar, het leggen van eieren. Gooi de eerste 30 tot 60 minuten van de eiercollectie weg. Deze bevat een groot aandeel embryo's in een onjuist stadium, omdat deze na de bevruchting door de vrouwtjes werden vastgehouden.Latere eiercollecties worden doorgaans gedomineerd door eieren die kort na de bevruchting zijn afgezet. Verzamel de eieren gedurende maximaal drie uur, aangezien de meest consistente layering wordt bereikt bij jonge embryo's. Kortere collectietijden van één uur of minder hebben de voorkeur.Gebruik bij routinexperimenten een pincet om vliegen te verwijderen die aan de gist of aan het oppervlak van de agarplaat kleven. Nadat de eieren zijn verzameld, dient het ei en de schaal te worden verwijderd; plaats de agarplaat onder een dissectiemicroscoop en observeer de embryo's via transilluminatie. Zorg ervoor dat de eifilamenten worden geïdentificeerd om de eischaal van de embryo's te verwijderen.Spuit 50% bleekmiddel onder de agarplaat, zodat de embryo's bedekt zijn, en laat dit enkele minuten incuberen. Schud de agarplaat af en toe om de embryo's in het bleekmiddel te laten ronddraaien. Inspecteer de eitjes opnieuw onder de microscoop.Zodra de eifilamenten niet meer zichtbaar zijn, is het chorion succesvol verwijderd. Dit vereist doorgaans drie tot vijf minuten incubatie met de bleekoplossing. Gebruik vervolgens een zeef van gaas om de embryo's van de bleekoplossing te scheiden.Het mandje wordt bereid uit een vierkant gaasplaatje van twee centimeter bij twee centimeter dat in het midden is ingedrukt. Pak het gaasmandje met een pincet en houd het boven de omgekeerde deksel van de agarplaat. Giet het bleekmiddel en het embryosuspensie van de agarplaat door het gaas, zodat het in het deksel van de agarplaat afloopt.Indien er embryo's op de agarplaat achterblijven, spuit dan gedestilleerd water op de plaat om ze los te maken en giet het gedestilleerde water en het embryo-mengsel door het gaas. Tik de onderkant van het gaas tegen een papieren handdoek om overtollig vloeistof te verwijderen. Spuit vervolgens gedestilleerd water langs de rand van de gaasmand om het resterende bleekmiddel af te spoelen, terwijl embryo-verlies tot een minimum wordt beperkt.Dep overtollig vloeistof regelmatig af. Herhaal de wasstap vijf tot 10 keer totdat alle bleek is verwijderd. Als de draadmand nog naar bleek ruikt, was de embryo's dan verder.Zodra de embryo's voldoende zijn gewassen, kunnen ze in agar worden ingebed. Was de embryo's uit het draadmandje. Wanneer TSS in een lege petrischaal wordt gegoten, moeten de embryo's naar de bodem zinken.Observe de embryo's met behulp van doorlichtingsverlichting onder een dissectiescoop. Specifieke stadia kunnen eenvoudig visueel worden herkend. Selecteer embryo's in de gewenste stadia met een P 200-pipet en breng deze over naar een kleine agarplaat.Werk snel aangezien de embryo's verouderen en een verlengde onderdompeling van langer dan 30 minuten in TSS de ontwikkeling kan beïnvloeden. Gebruik een pipet onder een Kim wipe om het grootste deel van de TSS te verwijderen.Het oppervlak van de agar moet licht vochtig zijn, wat het verplaatsen van de embryo's vergemakkelijkt. Er mogen echter nergens plassen vloeistof op de plaat achterblijven, aangezien overtollige vloeistof tijdens het centrifugeren ertoe zal leiden dat de embryo's uit de gaatjes glijden. Het allermoeilijkste aspect van deze procedure is het monteren van de embryo's en de boor.Dit is bijzonder uitdagend omdat de embryo's fragiel zijn en gemakkelijk kunnen worden vernietigd bij een te ruwe behandeling. Om dit te voorkomen, moet de naald langzaam, doelbewust en in kleine stapjes worden bewogen. Oefening is de beste manier om te leren hoeveel aanraking en druk het embryo precies kan verdragen. Bevestig een pincet en naald achterstevoren in een naaldhouder, zodat het stompe uiteinde uitsteekt tijdens de observatie.Maak onder de microscoop met de naald verticale gaatjes in de agar nabij elk embryo. Om tijdens het maken van het gaatje in de agar gelijktijdig door de microscoop te kunnen kijken, wordt de naald onder een hoek vastgehouden. Hierdoor is het moeilijk om perfect verticale gaatjes te maken. Echter zorgt de geringe helling van de naald voor een kleine inkeping of groef aan één zijde van het gaatje, waardoor het embryo gemakkelijk langs deze groef in het gaatje glijdt.Identificeer vervolgens de anterieure en posterieure uiteinden van de langwerpige embryo's, aangezien het embryo in een consistente oriëntatie in de gaatjes moet worden geduwd. Meestal, met het anterieure uiteinde naar boven, wordt het vlies aan het anterieure uiteinde gekenmerkt door een gespecialiseerde structuur. Gebruik met de stompe kant van de naald de micropipet om het embryo over de agar te verschuiven en het posterieure uiteinde te oriënteren en te manoeuvreren naar een geperforeerd gaatje.Duw vervolgens het anterieure uiteinde richting het gat. Het embryo zou gemakkelijk in het gat moeten glijden langs de lichte verdieping die tijdens het doorprikken is ontstaan. Terwijl het embryo schuin omhoog komt te staan, duwt u het dieper in het gat.De agar is zacht genoeg zodat een embryo, zodra het gedeeltelijk in een voorgeprikt gaatje is geplaatst, verder kan worden ingeduwd zonder beschadiging. Wanneer het volledig is ingeduwd, staat het embryo meestal al vrij verticaal. Indien dit niet het geval is, moet het ingevoegde embryo verticaler worden uitgelijnd door er zijwaarts tegenaan te duwen.Als het gat niet te groot is, blijft de positie van het embryo gedurende de centrifugatie stabiel vastgehouden door de agar. Met enige oefening is het mogelijk om 100 tot 250 embryo's per plaat in te bedden. Het benodigde aantal embryo's hangt af van de daaropvolgende toepassing.Houd de montagetijd kort. Aangezien de embryo's tijdens het monteren blijven ontwikkelen, dient u overgebleven ongebruikte embryo's met een vochtige vliegenpenseel te verwijderen als een specifiek, kortstondig ontwikkelingsstadium gewenst is. Plaats vervolgens de in agar gemonteerde embryo's in een centrifuge.Plaats de platen met de vliegenembryo's met de agarzijde naar beneden in de zwaaibekkers van de centrifuge. Zorg ervoor dat de centrifuge gelijkmatig is gebalanceerd en centrifugeer de platen 30 minuten lang bij 4.000 rotaties per minuut bij een temperatuur van 4 tot 10 °C. Plaats de agaarplaat na centrifugatie onder de dissectiemicroscoop en bedek deze met een laag TSS met behulp van het stompe uiteinde van de naald.Graaf de embryo's uit hun gaatjes. De embryo's drijven in de TSS maar blijven ondergedompeld. De embryo's vertonen een duidelijke gelaagdheid met een bruine kap aan het anterieure uiteinde, een helder middengebied en een donkergrijs gebied aan het posterieure uiteinde.Verwerp embryo's die geen duidelijke gelaagdheid vertonen bij directe observatie via brightfield- of epi-fluorescentiemicroscopie. Gebruik een P 200-pipet om goed gelaagde embryo's in TSS over te brengen naar een microcentrifugebuisje. Breng de embryo's in buffer vervolgens over naar een glazen objectglas en monteer deze zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol.Als de embryo's gefixeerd moeten worden, gebruik dan een P 200 pipette om de in TSS gelaagde embryo's over te brengen naar een scintillatiebuisje. Fixeer de embryo's met behulp van standaard fixatietechnieken. Aangezien voor gecentrifugeerde embryo's de efficiëntie van de devitalisatiestap laag is.Begin met zoveel mogelijk embryo's als praktisch haalbaar is. Indien de embryo's worden gebruikt in transplantatie-experimenten, moeten deze worden overgebracht naar agarplaten en worden gemonteerd op dekglasjes. Maak hierbij gebruik van standaardprocedures voor de hantering van embryo's; verwijzingen naar dergelijke procedures zijn te vinden in het geschreven protocol.De gelaagdheid die door centrifugatie wordt veroorzaakt, is tientallen minuten stabiel. Hier zijn beelden onder helder licht van levende oph-embryo's vóór centrifugatie, waarbij het anterieure uiteinde links en het posterieure uiteinde rechts op de dorsale zijde wordt getoond. Embryo's in het splitsingsstadium verschijnen uniform met de bovenkant boven en de ventrale zijde beneden.Bruine stadia zoals deze zijn ideaal voor in vivo centrifugatie. Blastoderm-embryo's hebben een heldere rand die aan alle zijden vergelijkbaar is. Deze heldere periferie breidt zich uit tot bijna het einde van de gastrulatie.Embryo's kunnen tot het einde van de blastulatie nog succesvol worden gestratificeerd door centrifugatie. De gelaagdheid van dooier en kernen is minder consistent dan in de klievingsstadia. Nadat cellulaire embryo's asymmetrisch worden, worden de dorsale en ventrale zijden duidelijk en ontwikkelen zich diverse plooien.Het getoonde embryo bevindt zich in een vroege fase van de verlenging van de kiemband. In deze stadia is centrifugatie niet langer effectief voor het stratificeren van de belangrijkste organellen. Embryogenese is een continuüm.Daarom zijn deze stadia geen afzonderlijke entiteiten, maar gaan ze in elkaar over naarmate de ontwikkeling vordert. Deze time-lapsefilm legt vier uur van de embryogenese vast, beginnend bij de klievingsstadia. De extensie van de kiemband is 720 keer versneld.Hier zijn afbeeldingen van gecentrifugeerde embryo's, vastgelegd met behulp van transilluminatie. Het embryo links is goed gestratificeerd. De lipidedruppels met een lage dichtheid vormen een lipidekap aan de uiterste anterieure punt.De hoog-densiteitsdooiers accumuleren als een donkergrijze zone aan het posterieure uiteinde. Deze twee lagen worden gescheiden door een brede heldere zone die andere organellen en cytoplasma vertegenwoordigt. Het embryo aan de rechterkant werd gecentrifugeerd na de fixatie.Laagvorming is minimaal indien een epifluorescentiemicroscoop beschikbaar is. Deze levende, gecentrifugeerde embryo's kunnen worden onderzocht onder UV-excitatie, waarbij de dooier een intense blauwe waterfluorescentie vertoont. Een compacte laag autofluorescerend materiaal bij de posterior pole duidt op een succesvolle centrifugatie en dient als marker voor het posterieure uiteinde.Het uiterlijk van de lagen verandert drastisch wanneer de embryo's worden gefixeerd. Lipiddruppels worden doorschijnend en de lipidlaag verschijnt onder lichtmicroscopie als witachtig en pluizig in plaats van donkerbruin. Yo corso fluorescentie wordt gedeeltelijk of volledig vernietigd door fixatie, waardoor deze veel minder intens of zelfs ondetecteerbaar wordt.Op deze afbeelding zijn organellen gelabeld met fluorescerende markers en hopen deze markers zich op karakteristieke posities langs de anterieur-posterieure as. Bepaalde histon-fusie-eiwitten lokaliseren zich zowel in lipidedruppels als in kernen, waardoor ze gebruikt kunnen worden om deze cellulaire compartimenten te markeren en om de fase van het embryo te monitoren aan de hand van het aantal gelabelde kernen. Zoals u zojuist heeft gezien, is het inbedden van de embryo's in de boor een van de meest uitdagende aspecten van deze procedure.Maar met wat oefening zult u dit snel en efficiënt kunnen uitvoeren. Zodra deze techniek beheerst is, worden colocalisatie-experimenten, die anders zeer tijdrovend zijn, zeer eenvoudig.Ons laboratorium gebruikt deze techniek bijvoorbeeld routinematig om via fluorescentiemicroscopie te testen of een eiwit van belang gelokaliseerd is in een specifiek hoofdorganel. Bovendien kunnen individuele lagen uit de gecentrifugeerde embryo's worden teruggewonnen voor biochemische analyse of transplantatie-experimenten. Deze techniek is niet alleen nuttig voor vruchtenvliegembryo's.Centrifugatie scheidt organellen op basis van dichtheid ook in de eieren van andere soorten en in andere grote celtypen, zoals cytes.

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los...

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo&#39;s

Dit is een protocol om actief volle lengte Kinesine isoleren...

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Multi-component eiwitcomplexen spelen een cruciale rol tijdens de cellulaire functie en ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt voor de inheemse eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's na in vivo verknoping gevolgd door zuivering van het verknoopte complexen voor de volgende structuur-functie analyse.

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo&#39;s

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Leer organellen scheiden door dichtheid in levende Drosophila-embryo's met in-vivo centrifugatie. Deze methode vermijdt celdisruptie-artefacten en vergemakkelijkt colocalisatie-experimenten en biochemische analyse.

In-vivo Centrifugeren van Drosophila embryo's

Meer video's verkennen