Name: Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer hoe nanodeeltjes worden geladen op microtubuli die glijden over kinesine-eiwitmotoren. Deze methode toont nanoschaaltransport voor biotechnologische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn een zware schuldenlast aan Jonathon Howard, wiens groep ontwikkelde de basis-protocol voor een glijdende motiliteit assay, die vervolgens werd aangepast door ons. Financiële steun van NSF te verlenen DMR0645023 is dankbaar erkend.

1.) Buffers en reagentia Deze oplossingen moeten worden voorbereid en opgeslagen in gemakkelijk grote porties. Een hoeveelheid moeten bevatten voldoende oplossing voor een typisch experiment en een frisse hoeveelheid moet worden gebruikt voor elke beweeglijkheid test. De voorwaarden voor opslag en typische aliquot maten zijn ook vermeld in de volgende protocollen. 1. BRB80 buffer, (80 mm buizen, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA in gedeïoniseerd gedistilleerd (dd) water, pH ingesteld op 6,9 door KOH) <ul><li> Verzin een 100 ml voorraad oplossing van 0,5 M EGTA dd water. Breng de pH op 7,0 met behulp van 2 M NaOH-oplossing. </li><li> Verzin een 100 ml voorraad oplossing van 1 M MgCl 2 dd water. Autoclave de oplossing. </li><li> Voeg 24,2 g van leidingen en 3,1 g KOH pellets in ongeveer 800 ml water en roer dd op te lossen. Breng de pH tot 6,9 met behulp van 1 M KOH-oplossing. Voeg 2 ml van 0,5 M EGTA stockoplossing aanwezig zijn en een mL van 1 M MgCl 2 stamoplossing. Breng het volume tot 1000 ml met water dd. </li><li> Aliquot in 50 ml Falcon buizen en invriezen bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. De BRB80 buis momenteel gebruikt kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C of bij kamertemperatuur. </li></ul> 2. Magnesium Chloride, MgCl 2 (100 mM dd water) <ul><li> Verdunnen dd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM te bereiken. </li><li> Hoeveelheid (10 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik </li></ul> 3. Guanosine-5'-trifosfaat, dinatriumzout, GTP (25 mM dd water, pH ingesteld op 7 met NaOH) <ul><li> Weeg uit en los op in dd water en breng de pH op 7 met 2 M NaOH-oplossing. </li><li> Controleer of de concentratie door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. (Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 11,7 x 103 M -1 cm -1). </li><li> Hoeveelheid (10 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 4. Dimethylsulfoxide, DMSO <ul><li> Hoeveelheid (10 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 5. Taxol (1 mM in DMSO) <ul><li> Afwegen en oplossen in DMSO onder zuurkast tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM te bereiken. </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 6. D-(+)-Glucose, (2 M dd water) <ul><li> Weeg uit en los op in water dd tot een uiteindelijke concentratie van 2 M. te bereiken </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 7. Glucose-oxidase, (2 mg / ml in BRB80) <ul><li> Los op in BRB80 tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml te bereiken. </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (1 M dd water) <ul><li> Los op in water onder dd zuurkast tot een uiteindelijke concentratie van 1 M. te bereiken </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 9. Catalase, (0,8 mg / ml in BRB80) <ul><li> Oplossen in BRB80 in ten minste twee fasen tot een uiteindelijke concentratie van 0,8 mg / ml te bereiken. Bepaal de concentratie in ieder stadium door het meten van UV-absorptie bij 276 nm en 406 nm (gebruik een extinctiecoëfficiënt van 3,1 x 10 5 m -1 cm -1 bij 276 nm en 2,2 x 10 5 M -1 cm -1 bij 406 nm en de vergelijking A = CL). </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 10. Adenosine-5'-trifosfaat, ATP (100 mM in 100mm MgCl 2) <ul><li> Bereid een voorraad oplossing van 100 mM MgCl 2 dd water. Afwegen droog poeder en los op in dit bestand oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 100 mm te bereiken. </li><li> Controleer of de concentratie door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. (Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 15,4 x 10 3 M -1 cm -1). </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 11. Caseïne-oplossing (20 mg / ml caseïne in BRB80) <ul><li> Voeg ongeveer 3 g caseïne tot 30 ml water in een dd 50 ml Falcon buis. Vortex voor ongeveer 1 uur tot oplossing ontwikkelt dikke consistentie. </li><li> Centrifugeer bij ongeveer 15.000 g gedurende 30 minuten. De bovendrijvende vloeistof filteren door middel van 0,5 micrometer en 0,2 um spuit filters. </li><li> Bepaal de concentratie van de bovenstaande vloeistof door het meten van UV-absorptie bij 280 nm (Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 0,67 mL mg -1 cm -1). Verdund tot 20 mg / ml in BRB80. </li><li> Hoeveelheid (20 pi volume) intot 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ul> 2.) Standaard oplossingen Deze worden bereid op de dag van het experiment en dient te worden weggegooid na het experiment voorbij is. Bereid 1 ml van elk. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> Verdunnen caseïne oplossing in BRB80 tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 mg / ml en op te slaan over ijs. Deze oplossing is geïntroduceerd in de stroom cel voorafgaand aan de kinesine en het behoud van kinesine activiteit na oppervlak van adsorptie. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> Bereid 0,2 mg / ml caseïne en 1 mM ATP in BRB80 en op te slaan over ijs. Kinesine verder verdund met behulp van deze oplossing vóór de invoering in de stroom cel. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> Verdunnen taxol oplossing in BRB80 tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing wordt gebruikt om de microtubuli stabiliseren. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> Bereid 10 uM taxol en 0,2 mg / ml caseïne in BRB80 en bewaar bij kamertemperatuur. Dit wordt gebruikt voor de verdere voorbereiding van de antifade en microtubule oplossingen. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> Bereid 20 mM D-glucose, 20 ug / ml glucose-oxidase, 8 ug / ml catalase, 10 mM DTT en 20 uM ATP in BRB80CT en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing wordt gebruikt voor het streptavidine en nanosferen verdunnen en "verdrinken" de overtollige streptavidine in de stroom cel. De kinesine snelheid kan worden geregeld door het aanpassen van de ATP-concentratie in deze oplossing. </li></ul> 3.) Kinesine Voorbereiding <ul><li> Express een kinesine constructie bestaande uit de wild-type, full-length Drosophila melanogaster kinesine zware keten en een C-terminale His-tag in Escherichia coli en zuiveren met behulp van een Ni-NTA column, zoals beschreven in zes. </li><li> Maak monsters (10 pi elk) in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. De concentratie van de actieve kinesine in deze porties is ongeveer 200 nM. 7 </li><li> Voor een typisch experiment, verdun de oplossing kinesine 20 vouwen in BRB80CA. Label de oplossing KIN20 en op te slaan over ijs. </li></ul> 4.) Microtubuli Voorbereiding <ul><li> In een 0,5 ml microcentrifugebuis, bereiden 25 pi van de groei oplossing: 4 mM MgCl2, 1 mM GTP en 5% DMSO (v / v) in BRB80 buffer. </li><li> Voeg 6,25 pi van deze oplossing voor een 20 ug aliquot van gevriesdroogde gebiotinyleerd tubuline. </li><li> Vortex, vervolgens plaats in een warmte-bad op 37 ° C gedurende 30 minuten te polymeriseren. Verdun 100-voudig in BRB80T en vortex voorzichtig. Label de oplossing MT100 en bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Maak een 10-voudige verdunning van MT100 in BRB80AF. Label de oplossing MT1000. </li></ul> 5.) Streptavidine en NanoSphere Solution Bereid AlexaFluor568-gelabeld streptavidine bij een concentratie van 100 nM in BRB80AF. Labelen STV100 en op te slaan over ijs. Ook verdunnen nanosferen 5000 vouw in BRB80AF oplossing. Labelen NS5000 en op te slaan over ijs. 6.) Flow Cell Bouw Construeer een doorstroomcel met behulp van twee glazen dekglaasjes van elkaar gescheiden door dubbelzijdig tape. Deze stroom cel is ongeveer 2 cm lang, 1 cm breed en 100 micrometer hoog en heeft een volume van ongeveer 20 pi. Oplossingen worden ingevoerd in de flow cel van de ene kant met een pipet en slecht uit de andere met behulp van filter papier. 7.) Omgekeerde Assay Vergadering Glazen oppervlak wordt eerst bekleed met caseïne die het mogelijk maakt kinesine om de functionaliteit te behouden bij adsorptie. Nadat kinesine is geadsorbeerd, zijn microtubuli geïntroduceerd, die worden gehouden door kinesine. Microtubuli worden vervolgens bedekt met fluorescerende streptavidine. Na het wassen van de overtollige streptavidine, zijn gebiotinyleerde polystyreen fluoresceïne nanosferen (40 nm diameter) geïntroduceerd. Oppervlak geadsorbeerd stationaire nanosferen botsen met de bewegende microtubuli en krijg geladen hen (figuur 1). De volgorde van de stroom van oplossingen en toegestane tijd vóór de invoering van de volgende oplossing zijn hieronder vermeld. <ul><li> BRB80CS0.5, 5 minuten </li><li> KIN20, 5 minuten </li><li> MT1000, 5 minuten </li><li> STV100, 5 minuten </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8.) Microscopie Monteer de flow cel op de microscoop podium direct na NanoSphere introductie. In dit experiment, een Eclipse TE2000-U fluorescentie microscoop (Nikon, Melville, NY) is uitgerust met een 100X olie doelstelling (NA 1,45), een X-cite 120 lamp (Exfo, Ontario, Canada) en een IXON EMCCD camera (ANDOR, South Windsor, CT) werd gebruikt. Een FITC filter kubus (# 48001) en een TRITC filter kubus (# 48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT) werden gebruikt om beeld nanosferen en microtubuli respectiVely aan de onderkant van flow cellen. De belichtingstijd was 0,2 s, terwijl de tijd tussen blootstelling werd 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische tekening van de moleculaire shuttles.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

Met kleine aanpassingen, is dit protocol met succes toegepast door een verscheidenheid van groepen om kinesine-microtubule op basis van de beweeglijkheid testen monteren. 10 mM DTT in de uiteindelijke beweeglijkheid oplossing kan worden vervangen door 0,5% β-mercapto-ethanol. Standaardoplossingen (BRB80AF, KIN20 en MT1000) meer dan 2 uur oud is mag niet gebruikt. Elke oplossing die taxol en vooral microtubuli mag nooit geplaatst worden op het ijs. Overmatige blootstelling van de stroom cel aan UV-excitatie licht resulte...

<table><tbody><tr><td>Adenosine-5&amp;rsquo;-trifosfaat (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-tubuline</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>Caseïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreïtol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-amin&amp;#8211;ethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres gebiotinyleerde microsferen, 40 nm, geel-groen fluorescent (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine-5&amp;rsquo;-trifosfaat (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>1,4-piperazinediethansulfonzuur, piperazine-1,4-bis(2-ethansulfonzuur), piperazine-N,N&amp;#8242;-bis(2-ethansulfonzuur) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Alexa Fluor 568 conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

cargo laden op kinesine powered moleculaire shuttles

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cellen zijn geëvolueerd geavanceerde moleculaire machines, zoals kinesine motor eiwitten en microtubuli filamenten, actief intracellulair transport van de lading te ondersteunen. Terwijl kinesins staart domein bindt aan een verscheidenheid van ladingen, kinesins hoofd domeinen maken gebruik van de chemische energie opgeslagen in ATP-moleculen te stappen langs de microtubuli rooster. De lange, stijve microtubules dienen als tracks voor de lange afstand intracellulair transport. Deze motoren en filamenten kunnen ook worden gebruikt in microfabricated synthetische omgevingen als onderdeel van de moleculaire shuttles 1. In een vaak gebruikte design, zijn kinesine-motortjes verankerd aan het wegdek door middel van hun staart, en gefunctionaliseerde microtubules dienen als bagageruimte elementen, die worden aangedreven door deze motoren. Deze shuttles kunnen worden geladen met een lading door gebruik te maken van de sterke en selectieve binding tussen biotine en streptavidine. De belangrijkste componenten (gebiotinyleerd tubuline, streptavidine, en gebiotinyleerde lading) zijn commercieel beschikbaar. Voortbouwend op de klassieke omgekeerde beweeglijkheid test 2, is de bouw van moleculaire shuttles hier gedetailleerd. Kinesine motor eiwitten geadsorbeerd aan een oppervlak voorgelakt met caseïne; microtubules gepolymeriseerd uit gebiotinyleerd tubuline, gehandeld op grond van de kinesine en vervolgens bedekt met rhodamine-gelabeld streptavidine. De ATP-concentratie is gehandhaafd op subsaturating concentratie om een microtubule zweefvliegen snelheid optimaal te bereiken voor het vervoer van lading 3. Tot slot, gebiotinyleerde fluoresceïne-gelabelde nanosferen worden toegevoegd als lading. Nanosferen hechten aan microtubuli als gevolg van botsingen tussen glijden microtubuli en nanosferen zich te houden aan de oppervlakte. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om een verscheidenheid aan ladingen zoals gebiotinyleerd DNA-4, 5 of quantum dots een breed scala aan antigenen via gebiotinyleerde antilichamen 4-6 te laden.

Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.

Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles

Cellen hebben geavanceerde moleculaire mechanismen ontwikkeld, zoals kinesine-motorproteïnen en microtubulifilamenten, om actief intracellulair transport te ondersteunen ...

Het algemene doel van deze procedure is om nanosferen te laden op microtubuli, die glijden op een oppervlak dat is gecoat met kinesine-motoren. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van een glazen flowcel te coaten met een caseïnelosung. De tweede stap van de procedure is het absorberen van kinesine-motorproteïnen op het oppervlak van de flowcel.De derde stap van de procedure is het toevoegen van de microtubuli. De laatste stap van de procedure is het toevoegen van de streptaveridine-moleculen, die zich aan de microtubuli zullen binden, gevolgd door het toevoegen van de nanosferen. De nanosferen binden aan het oppervlak van de flowcel, waar ze kunnen worden opgepikt door de microtubuli.Uiteindelijk kan men met behulp van fluorescentiemicroscopie observeren hoe nanosferen worden opgepikt door microtubuli en over het oppervlak worden getransporteerd. Hallo, ik ben Elaine Jen Smith van het laboratorium van Dr. Henry Hess en de afdeling Material Science and Engineering aan de University of Florida. Vandaag laten we u een procedure zien voor de inverted motility assay.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het laden van vracht op microtubuli en de beweging van moleculai

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Intracellulair transport van ladingen, zoals blaasjes of organellen, wordt uitgevoerd door moleculaire motoreiwitten die op gepolariseerde microtubuli volgen. Dit protocol beschrijft de correlatie van de directionele richting van transport van individuele vrachtdeeltjes die zich binnen neuronen bewegen, naar de relatieve hoeveelheid en het type van geassocieerde motoreiwitten.

Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Hier wordt een protocol voorgelegd aan Kinesin-1 ladingen te identificeren. Een motorloze mutant van de kinesine-1 zware keten (KIF5B) aggregaten in het cytoplasma en induceert aggregatie van de ladingen. Beide aggregaten gedetecteerd onder fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om ladingen van andere auto eiwitten te identificeren.

Identificatie van kinesine-1 Cargos Met behulp van fluorescentiemicroscopie

We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.

Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

Het doel van dit protocol is het vormen van ensembles van moleculaire motoren op DNA origami nanostructuren en observeren het ensemble motiliteit met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie.

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Een nieuwe in vitro systeem voor het gelijktijdig laden van vier pezen in de cultuur wordt beschreven.

Ex vivo mechanische belasting van Tendon

Calcium is een alomtegenwoordige boodschapper in het zenuwstelsel, essentieel voor het activeren van vrijkomen van neurotransmitters en veranderingen in de synaptische sterkte. Hier laten we zien een techniek voor het laden van Ca 2 +-indicatoren in Drosophila zenuwuiteinden. We tonen ook aan de fabricage van de benodigde apparatuur en benadrukken punten van cruciaal belang voor het succes van de techniek is.

Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen. Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zal dienen als instrument van de moleculaire chirurgie en...

Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Leer hoe nanodeeltjes worden geladen op microtubuli die glijden over kinesine-eiwitmotoren. Deze methode toont nanoschaaltransport voor biotechnologische toepassingen.

Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles

Meer video's verkennen