Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles
3 november 2010
Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om nanosferen te laden op microtubuli, die glijden op een oppervlak dat is gecoat met kinesine-motoren. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van een glazen flowcel te coaten met een caseïneloopting. De tweede stap van de procedure is het adsorberen van kinesine-motorproteïnen op het oppervlak van de flowcel.
De derde stap van de procedure is het toevoegen van de microtubuli. De laatste stap van de procedure is het toevoegen van de streptavidine-moleculen, die zich aan de microtubuli zullen binden, gevolgd door het toevoegen van de nanosferen. De nanosferen binden aan het oppervlak van de flowcel, waar ze kunnen worden opgepikt door de microtubuli.
Uiteindelijk kan men met fluorescentiemicroscopie observeren hoe nanosferen worden opgepikt door microtubuli en over het oppervlak worden getransporteerd. Hallo, ik ben Elaine Jen Smith van het laboratorium van Dr. Henry Hess en de afdeling Material Science and Engineering aan de University of Florida. Vandaag laten we u een procedure zien voor de inverted motility assay.
Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het laden van vracht op microtubuli en de beweging van moleculaire shuttles te bestuderen. Laten we beginnen. Bereid vóór de start van deze procedure alle stamoplossingen vers voor, zoals beschreven in het schriftelijke gedeelte van deze video.
Zodra de stamoplossingen zijn bereid, begint de preparatie van de microtubuli door 25 µL groeioplossing in een microcentrifugebuisje van 0,65 mL te pipetteren. Voeg vervolgens 6,25 µL van de groeioplossing toe aan 20 µg gelyofiliseerd gebiotinylleerd tubuline. Vortex de oplossing en plaats deze gedurende 30 minuten in een warmtebad op 37 °C om polymerisatie te induceren; verdun de oplossing na incubatie 100-voudig in Taxol-buffer en vortex voorzichtig.
Deze oplossing dient om de microtubuli te stabiliseren. Label de oplossing als MT 100 en bewaar deze bij kamertemperatuur. Maak vervolgens een tienvoudige verdunning van MT 100 in anti-fade buffer en label deze oplossing als MT 1000.
Bereid vervolgens de kinesine-motoren voor door de kinesine-oplossing 20-voudig te verdunnen in TP-buffer. Label de oplossing als kinesine 20 en bewaar deze op ijs. Maak tot slot de streptavidine- en nanosfeer-oplossingen.
Voeg eerst Alexa Fluor 5 6 8 gelabeld streptavidine toe tot een concentratie van 100 nano molars in Antifa Buffer. Label de oplossing als STV 100, verdun vervolgens de nanosferen 5 000 maal in Antifa Buffer en label dit mengsel als NS 5 000. Bewaar beide oplossingen op ijs.
Nadat de oplossingen voor de cargo-ladingsassay zijn bereid, wordt er een flowcel geconstrueerd met een dekglasplaatje en een glazen dekglas die van elkaar worden gescheiden door dubbelzijdige tape. Plak eerst twee stroken dubbelzijdige tape op de randen van een dekglasplaatje, waarbij een tussenruimte van ongeveer één centimeter tussen de stroken wordt gelaten. Leg vervolgens een dekglas over de tape.
Oefen druk uit op het dekglas met de platte zijde van een pincet om een afdichting te maken. De geconstrueerde flowcel is ongeveer twee centimeter lang, één centimeter breed en 100 microns hoog, en heeft een volume van ongeveer 20 µL. Om te beginnen met de assemblage van de omgekeerde assay.
Plaats de tip van de pipet tussen het dekglas en het objectglas. Injecteer vervolgens 0,5 mg/mL caseïne-oplossing in de flowcel. Deze coating op de flowcel zorgt ervoor dat kinesine zijn functionaliteit behoudt na absorptie.
Wacht vijf minuten tot de caseïneloping is afgezet. Absorbeer vervolgens kinesine op de flowcel door de kinasedoplossing in 20 oplossingen te introduceren; oplossingen worden in de flowcellen gebracht door de pipetpunt tussen het dekglas en het objectglas te plaatsen. Vervolgens wordt de oplossing aan één zijde in de flowcel geïnjecteerd, terwijl deze gelijktijdig aan de andere zijde wordt weggezogen.
Laat het filterpapier vijf minuten inwerken zodat de kinase-inmotoren worden geabsorbeerd. Voeg vervolgens de microtubuli toe aan de flowcel door de MT 1000-oplossing in de flowcel te pipetteren. Laat de microtubuli vijf minuten bezinken zodat ze kunnen hechten aan de kinase-inmotoren na de binding van de microtubuli aan de kinase-inmotoren.
Coat de microtubuli met fluorescent strep TTR door de STV 100-oplossing in de flowcel te introduceren. Laat de strep TTR-moleculen vijf minuten binden aan de microtubuli. Was het overschot aan strep TTR weg door drie spoelingen van 30 µL Antifa-oplossing in de flowcel te introduceren.
Voeg tot slot de gebiotinyleerde polystyreen fluoresceïne-nanosferen toe door de NS 5.000-oplossing in de flowcel te pipetteren. Het oppervlak absorbeert stationair. Nanosferen zullen botsen met de bewegende microtubuli en zich hierop hechten.
In dit experiment wordt een eclipse TE 2000 U fluorescentiemicroscoop gebruikt, uitgerust met een 100 x olie-objectief en X site, één 20 lamp en een exon E-M-C-C-D camera. Breng eerst één druppel immersieolie aan op het objectief. Monteer vervolgens de flowcel op de objecttafel van de microscoop met behulp van de trixy filterkubus.
Stel de microtubuli scherp, schakel vervolgens over naar de fitzy-filterkubus om de nanosferen te bekijken. Open daarna het and or I exon-programma en stel de acquisitiemodus in op kinetisch. Gebruik een belichtingstijd van 0,5 seconden, een kinetische serielengte van 20 en een kinetische cyclusduur van zes seconden.
Schakel de microscoop om van oculair naar camera en begin met het verkrijgen van beelden. Gebruik voor de eerste vier beelden de trixi-kubus om de microtubuli in beeld te brengen. Schakel voor de volgende 12 beelden over naar de Fitz-filterkubus om beelden van de nanosferen te verkrijgen.
Schakel vervolgens terug naar de trixi-filterkubus. Voor de laatste vier beelden om de microtubuli vast te leggen, worden de microtubuli waargenomen met behulp van de Trissy-filterkubus; de filterkubus wordt omgeschakeld naar fite. Om de nanosferen hier te visualiseren, worden de nanosferen die door microtubuli worden getransporteerd aangeduid met de pijlen. Niet alle nanosferen zijn door microtubuli worden opgepikt.
Nu wordt de locatie van de nanosferen 36 seconden later getoond, waaruit blijkt dat de nanosferen zijn verschoven. Wanneer de microtubuli opnieuw worden afgebeeld, wordt duidelijk dat ook de microtubuli door het gezichtsveld zijn bewogen. Deze beelden tonen aan dat de nanosferen zijn verplaatst als gevolg van transport via microtubuli.
We hebben zojuist aangetoond hoe de inverted motility assay wordt uitgevoerd. Bij deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de filterkubussen moeten worden gewisseld tijdens het maken van de beelden, zodat zowel de microtubuli als de nanosferen zichtbaar zijn. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de assemblage van een moleculair shuttlesysteem met behulp van gefunctionaliseerde microtubuli die glijden op kinesine-motorproteïnen. Het systeem dient als een transportmechanisme op nanoschaal, waarmee het laden van nanosferen op microtubuli wordt gefaciliteerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Transport-systemen op nanoschaal
Achtergrond
- Moleculaire shuttles zijn essentieel voor intracellulair transport.
- Microtubuli en kinesine-eiwitten spelen een cruciale rol bij cellulaire beweging.
- Het begrijpen van deze systemen kan leiden tot vooruitgang in de nanotechnologie.
- Gefunctionaliseerde microtubuli kunnen de transportefficiëntie verhogen.
Doel van de studie
- Om de assemblage van een op microtubuli gebaseerd shuttlesysteem aan te tonen.
- Om de interactie tussen nanosferen en microtubuli te onderzoeken.
- Om een protocol te bieden waarmee onderzoekers het systeem kunnen repliceren.
Gebruikte methoden
- Het coaten van een glazen flowcell met caseïne-oplossing.
- Het adsorberen van kinesine-motorproteïnen op het oppervlak van de flowcell.
- Het toevoegen van microtubuli aan het systeem.
- Het introduceren van streptavidine-moleculen om te binden aan de microtubuli en het toevoegen van nanosferen.
Belangrijkste resultaten
- Nanosferen binden succesvol aan het oppervlak van de flowcel.
- Microtubuli kunnen de gebonden nanosferen oppikken.
- Het assemblageproces is reproduceerbaar en efficiënt.
- Dit systeem kan worden gebruikt voor diverse toepassingen op het gebied van transport op nanoschaal.
Conclusies
- Het op microtubuli gebaseerde shuttlesysteem is effectief voor transport op nanoschaal.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende soorten vracht.
- Verder onderzoek kan de toepassingen van deze technologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Door kinesine aangedreven moleculaire shuttles maken programmeerbaar transport van lading op nanoschaal mogelijk, wat een platform biedt voor gecontroleerde aflevering en manipulatie van biomoleculen in synthetische en analytische omgevingen. Dit systeem ondersteunt biopharma R&D in een vroeg stadium door een modulaire, reproduceerbare assay te bieden voor het bestuderen van actieve transportmechanismen en het evalueren van moleculaire interacties. De aanpasbaarheid aan diverse soorten lading positioneert het als een herbruikbaar instrument voor workflows voor targetvalidatie en assayontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Faciliteert het onderzoek naar moleculaire transportpaden met behulp van gedefinieerde interacties tussen cargo en motorproteïnen.
- Maakt functionele validatie mogelijk van cargo-aanhechting aan microtubuli via biotinylering en streptavidine.
- Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in mechanistische studies naar intracellulaire transportprocessen.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd platform voor het laden en volgen van diverse gebiotinyleerde ladingen, waaronder DNA, antilichamen en nanomaterialen.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via fluorescentiemicroscopie voor de beweging en aanhechting van ladingen.
- Maakt opschaling van de assay en hergebruik van het platform mogelijk voor screening van verbindingen of biomoleculen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt aanpassing mogelijk voor ziekte-relevante ladingen, zoals antigenen of nucleïnezuren, om transport in synthetische systemen te modelleren.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanistische ontdekking naar de ontwikkeling van preklinische assays voor transportgebaseerde toepassingen.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor moleculaire afleveringsstrategieën in engineered omgevingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit moleculaire shuttlesysteem is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek als een modulaire assay voor transportstudies, targetvalidatie en screening van cargo-motorinteracties.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten van actieve transportmechanismen en padspecifiteit mogelijk.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het evalueren van de lading van cargo en de beweging ervan.
- Analytics: Levert fluorescentiegebaseerde metingen om de hechting van cargo en de transportefficiëntie te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt aanpassing aan ziekterelateerde of therapeutische cargo's voor preklinische modellering.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar assayplatform voor diverse moleculaire transportstudies.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij studies naar moleculair transport en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare assaycondities.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen voor de ontwikkeling van platforms en assays op basis van transport.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van strategieën voor moleculaire levering en transport mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in proteïnebiochemie, fluorescentiemicroscopie en microfabricage.
- Toegang tot fluorescentie-beeldvormingssystemen en gereedschappen voor de assemblage van microfluïdische flowcellen is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van de functionalisering van cargo en de assay-condities.
- Ondersteunt aanpassing aan verschillende gebiotinyleerde cargo's en modelsystemen.
- Beperkt tot in vitro synthetische omgevingen; niet direct vertaalbaar naar in vivo systemen zonder verdere validatie.
