Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles
3 november 2010
Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om nanosferen te laden op microtubuli, die glijden op een oppervlak dat is gecoat met kinesine-motoren. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van een glazen flowcel te coaten met een caseïnelosung. De tweede stap van de procedure is het absorberen van kinesine-motorproteïnen op het oppervlak van de flowcel.
De derde stap van de procedure is het toevoegen van de microtubuli. De laatste stap van de procedure is het toevoegen van de streptaveridine-moleculen, die zich aan de microtubuli zullen binden, gevolgd door het toevoegen van de nanosferen. De nanosferen binden aan het oppervlak van de flowcel, waar ze kunnen worden opgepikt door de microtubuli.
Uiteindelijk kan men met behulp van fluorescentiemicroscopie observeren hoe nanosferen worden opgepikt door microtubuli en over het oppervlak worden getransporteerd. Hallo, ik ben Elaine Jen Smith van het laboratorium van Dr. Henry Hess en de afdeling Material Science and Engineering aan de University of Florida. Vandaag laten we u een procedure zien voor de inverted motility assay.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het laden van vracht op microtubuli en de beweging van moleculaire shuttles te bestuderen. Laten we beginnen. Bereid vóór de start van deze procedure alle stamoplossingen vers voor, zoals beschreven in het geschreven gedeelte van deze video.
Zodra de stamoplossingen zijn bereid, start de preparatie van de microtubuli door 25 µL groeioplossing in een microcentrifugebuisje van 0,65 mL te pipetteren. Voeg vervolgens 6,25 µL van de groeioplossing toe aan 20 µg gelyofiliseerd gebiotinyleerd tubuline. Vortex de oplossing en plaats deze gedurende 30 minuten in een warmtebad op 37 °C om polymerisatie te induceren; verdun de oplossing na incubatie 100-voudig in Taxol-buffer en vortex voorzichtig.
Deze oplossing dient om de microtubuli te stabiliseren. Label de oplossing als MT 100 en bewaar deze bij kamertemperatuur. Maak vervolgens een tienvoudige verdunning van MT 100 in anti-fadebuffer en label deze oplossing als MT 1000.
Bereid vervolgens de kinesine-motoren voor door de kinesine-oplossing 20 keer te verdunnen in TP-buffer. Label de oplossing als kinesine 20 en bewaar deze op ijs. Maak tot slot de streptavidine- en nanosfeer-oplossingen.
Voeg eerst Alexa Fluor 568-gelabeld streptavidine toe tot een concentratie van 100 nM in Antifa Buffer. Label de oplossing als STV 100, verdun vervolgens de nanosferen 5.000 keer in Antifa Buffer en label dit mengsel als NS 5.000. Bewaar beide oplossingen op ijs.
Nadat de oplossingen voor de cargo-loadingsassay zijn bereid, wordt er een flowcel geconstrueerd met behulp van een dekglasplaat en een glazen dekglasplaatje, gescheiden door dubbelzijdige plakband. Plak eerst twee stroken dubbelzijdig plakband op de randen van een dekglasplaat, met een tussenruimte van ongeveer één centimeter tussen de stroken. Plaats vervolgens een dekglasplaatje over het plakband.
Oefen druk uit op het dekglas met de platte zijde van een pincet om een afdichting te maken. De geconstrueerde flowcel is ongeveer twee centimeter lang, één centimeter breed en 100 microns hoog, en heeft een volume van ongeveer 20 microliters. Om te beginnen met de assemblage van de geïnverteerde assay.
Plaats de punt van de pipet tussen het dekglas en het objectglas. Injecteer vervolgens 0,5 mg/mL caseïne-oplossing in de flowcell. Deze coating op de flowcell zorgt ervoor dat kinesine zijn functionaliteit behoudt na absorptie.
Wacht vijf minuten tot de caseïne-oplossing is gebonden. Absorbeer vervolgens Kinesine op de flowcel door de kinase in 20 oplossingen te introduceren; oplossingen worden in de flowcellen gebracht door de pipetpunt tussen het dekglas en het objectglas te plaatsen. Vervolgens wordt de oplossing aan één zijde in de flowcel geïnjecteerd, terwijl deze gelijktijdig aan de andere zijde wordt weggezogen.
Gebruik filterpapier en laat de kinesine-motoren vijf minuten lang absorberen. Voeg vervolgens de microtubuli toe aan de flowcell door de MT 1000-oplossing in de flowcell te pipetteren. Laat de microtubuli vijf minuten lang bezinken en zich hechten aan de kinesine-motoren nadat de microtubuli aan de kinesine-motoren zijn gebonden.
Coat de microtubuli met fluorescent strep TTR door de STV 100-oplossing in de flowcel te brengen. Laat de strep TTR-moleculen vijf minuten binden aan de microtubuli. Was het overtollige strep TTR weg door drie spoelingen van 30 µL Antifa-oplossing in de flowcel te brengen.
Voeg tot slot de gebiotinyleerde polystyreen fluoresceïne-nanosferen toe door de NS 5 000-oplossing in de flowcel te pipetteren. Het oppervlak absorbeert stationair. De nanosferen zullen botsen met de bewegende microtubuli en zich hieraan hechten.
In dit experiment wordt een eclipse TE 2000 U fluorescentiemicroscoop gebruikt, uitgerust met een 100 x olie-objectief en X site, een 20-lamp en een exon E-M-C-C-D camera. Breng eerst één druppel immersieolie aan op het objectief. Monteer vervolgens de flowcel op de microscooptafel met behulp van de trixy-filterkubus.
Stel de microtubuli scherp en schakel vervolgens over naar de fitzy-filterkubus om de nanosferen te bekijken. Open daarna het and of I exon-programma en stel de acquisitiemodus in op kinetisch. Gebruik een belichtingstijd van 0,5 seconden, een kinetische serielengte van 20 en een kinetische cyclusduur van zes seconden.
Schakel de microscoop om van oculair naar camera en begin met het vastleggen van beelden. Gebruik voor de eerste vier beelden de trixi-kubus om de microtubuli in beeld te brengen. Schakel voor de volgende 12 beelden over naar de Fitz-filterkubus om beelden van de nanosferen vast te leggen.
Schakel vervolgens terug naar de trixi-filterkubus. Voor de laatste vier beelden om de microtubuli vast te leggen, worden de microtubuli geobserveerd met behulp van de Trissy-filterkubus; de filterkubus wordt overgeschakeld naar fite. Om hier de nanosferen te visualiseren, worden nanosferen die door microtubuli worden getransporteerd, aangeduid met de pijlen. Niet alle nanosferen zijn door microtubuli opgepikt.
Nu wordt de locatie van de nanosferen 36 seconden later getoond, waaruit blijkt dat de nanosferen zijn verschoven. Wanneer de microtubuli opnieuw worden afgebeeld, wordt duidelijk dat de microtubuli eveneens door het gezichtsveld zijn bewogen. Deze beelden tonen aan dat de nanosferen zijn verplaatst als gevolg van microtubulair transport.
We hebben zojuist laten zien hoe de inverted motility assay moet worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de filterkubussen te wisselen tijdens het vastleggen van de beelden, zodat zowel de microtubuli als de nanosferen zichtbaar zijn. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de assemblage van een moleculair shuttlesysteem met behulp van gefunctionaliseerde microtubuli die glijden op kinesine-motorproteïnen. Het systeem dient als een transportmechanisme op nanoschaal, waarmee het laden van nanosferen op microtubuli wordt gefaciliteerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Transport-systemen op nanoschaal
Achtergrond
- Moleculaire shuttles zijn essentieel voor intracellulair transport.
- Microtubuli en kinesine-eiwitten spelen een cruciale rol bij cellulaire beweging.
- Het begrijpen van deze systemen kan leiden tot vooruitgang in de nanotechnologie.
- Gefunctionaliseerde microtubuli kunnen de transportefficiëntie verhogen.
Doel van de studie
- Om de assemblage van een op microtubuli gebaseerd shuttlesysteem aan te tonen.
- Om de interactie tussen nanosferen en microtubuli te onderzoeken.
- Om een protocol te bieden waarmee onderzoekers het systeem kunnen repliceren.
Gebruikte methoden
- Het coaten van een glazen flowcell met caseïne-oplossing.
- Het adsorberen van kinesine-motorproteïnen op het oppervlak van de flowcell.
- Het toevoegen van microtubuli aan het systeem.
- Het introduceren van streptavidine-moleculen om te binden aan de microtubuli en het toevoegen van nanosferen.
Belangrijkste resultaten
- Nanosferen binden succesvol aan het oppervlak van de flowcel.
- Microtubuli kunnen de gebonden nanosferen oppikken.
- Het assemblageproces is reproduceerbaar en efficiënt.
- Dit systeem kan worden gebruikt voor diverse toepassingen op het gebied van transport op nanoschaal.
Conclusies
- Het op microtubuli gebaseerde shuttlesysteem is effectief voor transport op nanoschaal.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende soorten vracht.
- Verder onderzoek kan de toepassingen van deze technologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Door kinesine aangedreven moleculaire shuttles maken programmeerbaar transport van lading op nanoschaal mogelijk, wat een platform biedt voor gecontroleerde aflevering en manipulatie van biomoleculen in synthetische en analytische omgevingen. Dit systeem ondersteunt biopharma R&D in een vroeg stadium door een modulaire, reproduceerbare assay te bieden voor het bestuderen van actieve transportmechanismen en het evalueren van moleculaire interacties. De aanpasbaarheid aan diverse soorten lading positioneert het als een herbruikbaar instrument voor workflows voor targetvalidatie en assayontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Faciliteert het onderzoek naar moleculaire transportpaden met behulp van gedefinieerde interacties tussen cargo en motorproteïnen.
- Maakt functionele validatie mogelijk van cargo-aanhechting aan microtubuli via biotinylering en streptavidine.
- Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in mechanistische studies naar intracellulaire transportprocessen.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd platform voor het laden en volgen van diverse gebiotinyleerde ladingen, waaronder DNA, antilichamen en nanomaterialen.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via fluorescentiemicroscopie voor de beweging en aanhechting van ladingen.
- Maakt opschaling van de assay en hergebruik van het platform mogelijk voor screening van verbindingen of biomoleculen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt aanpassing mogelijk voor ziekte-relevante ladingen, zoals antigenen of nucleïnezuren, om transport in synthetische systemen te modelleren.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanistische ontdekking naar de ontwikkeling van preklinische assays voor transportgebaseerde toepassingen.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor moleculaire afleveringsstrategieën in engineered omgevingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit moleculaire shuttlesysteem is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek als een modulaire assay voor transportstudies, targetvalidatie en screening van cargo-motorinteracties.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten van actieve transportmechanismen en padspecifiteit mogelijk.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het evalueren van de lading van cargo en de beweging ervan.
- Analytics: Levert fluorescentiegebaseerde metingen om de hechting van cargo en de transportefficiëntie te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt aanpassing aan ziekterelateerde of therapeutische cargo's voor preklinische modellering.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar assayplatform voor diverse moleculaire transportstudies.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij studies naar moleculair transport en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare assaycondities.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen voor de ontwikkeling van platforms en assays op basis van transport.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van strategieën voor moleculaire levering en transport mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in proteïnebiochemie, fluorescentiemicroscopie en microfabricage.
- Toegang tot fluorescentie-beeldvormingssystemen en gereedschappen voor de assemblage van microfluïdische flowcellen is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van de functionalisering van cargo en de assay-condities.
- Ondersteunt aanpassing aan verschillende gebiotinyleerde cargo's en modelsystemen.
- Beperkt tot in vitro synthetische omgevingen; niet direct vertaalbaar naar in vivo systemen zonder verdere validatie.
