Name: Genoom-brede analyse van aminoacylatie (Charging) niveaus van tRNA Met behulp van Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer een methode voor genoom-brede analyse van tRNA-charging in Saccharomyces cerevisiae met behulp van microarray-technologie. Deze aanpak helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitbiosynthese en stressreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De gist werk in de Pan lab werd gefinancierd door een subsidie ​​van Ajinomoto, Inc Japan en de National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Wij danken dr. Ronald Wek aan de Indiana University School of Medicine voor de lange termijn samenwerking op het gist projecten. We danken ook dr. Kimberly Dittmar voor het ontwikkelen van het tRNA opladen microarray methode.

Deel 1: Isolatie van totaal geladen tRNA <ol><li> Pellet cellen in een tafelblad centrifuge bij 2000 RFC gedurende 5 minuten. Het equivalent van een OD 600 van de cellen moet over ten minste 1μg totaal RNA en een minimum van 30 ug wordt aanbevolen voor de procedure. </li><li> Resuspendeer cellen in lysisbuffer oplossing die bestaat uit 0,3 M gebufferde Na +-acetaat (pH 4,5) en 10 mM EDTA. Vortex met een gelijk volume van Na +-acetaat-verzadigd fenol / chloroform (pH 4,5) drie keer per gedurende 30 s. Zorg ervoor dat u altijd steekproeven te houden op het ijs tussen vortexen. Gebufferde acetaat kunnen worden bereid uit NaOAc en HOAc terwijl acetaat verzadigd fenol / chloroform kunnen worden bereid door het mengen van 1 deel 5 M acetaat gebufferde (pH 4.5) met negen delen fenol / chloroform. Let op: in totaal RNA isolatie wordt uitgevoerd onder mild zure condities en op het ijs te deacylering van geladen tRNA te voorkomen. </li><li> Centrifugeer bij 18.600 RFC gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Verwijder de waterlaag en het uitvoeren van een acetaat-verzadigd fenol / chloroform extractie. </li><li> Na de tweede extractie neerslag van de RNA door het toevoegen van 2.7x volumes ethanol en centrifugeren bij 18.600 RFC gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer RNA pellets in lysisbuffer oplossing en vervolgens neerslaan met ethanol een tweede keer. </li><li> Ten slotte is resuspendeer de RNA in een oplossing van 10 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) en 1 mM EDTA voor verdere behandeling. Het monster kan stabiel bewaard worden bij -80 ° C gedurende ongeveer twee weken. Langere opslag is niet aan te raden aangezien sommige geladen tRNA zal beginnen te deacylate. </li></ol> Deel 2: Bereiding van tRNA Standards <ol><li> Warmte E. coli tRNA normen op 10,5 uM tot 85 ° C in 45 mM Tris-Cl pH 7,5 gedurende 2 minuten. Neem de buis uit en laat op kamertemperatuur gedurende 3 minuten. </li><li> Voeg MgCl 2 tot een uiteindelijke concentratie van 20 mM en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg de synthetase reactiemengsel zodat de uiteindelijke reactie bevat 5 uM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 3 mM dithiothreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM spermine, 1 mM van de respectieve aminozuur, en 4,2 eenheden / ul E. coli aminoacyl-tRNA synthetase mix. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg een gelijk volume van 0,5 M acetaat gebufferde (pH 4,5) en extract met een acetaat-verzadigde fenol / CHCl 3 bij pH 4,5. </li><li> Neerslaan van de tRNA-normen met 2.7x volumes ethanol en centrifugeren bij 18.600 RFC gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de normen in 50 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) met 1 mM EDTA en bewaar bij -80 ° C tot maximaal een maand. </li></ol> Deel 3: Cy3/Cy5 etikettering van tRNA <ol><li> Voor de geladen tRNA monster incubeer totaal RNA bij een concentratie van 0,1 pg / pl met 0,066 uM elk E. coli tRNA normen (dat wil zeggen 0,67 pmol elke standaard per microgram totaal RNA) en 100 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) in de aanwezigheid van 50 mM NaIO4 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor de controle totaal tRNA voorbeeld van het gebruik 50 mM NaCl in plaats van NaIO4. Vergeet niet om de RNA verdunnen alleen met gebufferde oplossingen voor behoud van het opladen. </li><li> Om doven de reactie toe te voegen glucose tot 100 mm en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Om alle resterende NaIO4 verwijderen uit de steekproef uitvoeren van een buffer uitwisseling met behulp van een G25 draaien kolom. Voor het beste resultaat equilibreren de kolom eerst door draaien 200 mM gebufferde acetaat buffer (pH 4.5) door het voorafgaand aan het toepassen van uw monster. </li><li> Neerslag het monster door het toevoegen van gebufferd acetaat (pH 4,5) tot een uiteindelijke concentratie van 133 mM NaCl en tot een uiteindelijke concentratie van 66 mM en 2.7x volumes ethanol. Af en toe een seconde neerslag kan nodig zijn voor de geoxideerde monsters. Dit is alleen noodzakelijk als de pellet ziet er aanzienlijk anders uit dan de controle pellet van hetzelfde monster. Bijvoorbeeld een aanzienlijk groter of meer diffuse pellet. Als er een tweede ethanol precipitatie is vereist hersuspenderen pellet in 50 mM acetaat buffer pH 4,5 en 200 mM NaCl vóór de toevoeging van ethanol. </li><li> Voor deacylering het tRNA monsters worden geresuspendeerd in 50 mM Tris-HCl (pH 9) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De reactie wordt geneutraliseerd door de toevoeging van een gelijk volume van 50 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) en 100 mM NaCl. Neerslag met een 2.7x volumes ethanol. Na precipitatie wordt RNA geresuspendeerd in water bij ~ 1 ug / ul. Zowel de controle en geoxideerde monsters moeten worden uitgevoerd op agarose gels om RNA-kwaliteit te controleren. </li><li> Te bevestigen tl-oligo labels op het tRNA 0,1 ug / ul gedeacyleerd RNA wordt geïncubeerd in 1x ligase buffer, 15% DMSO, 4 uM Cy3-of Cy5-bevattende oligonucleotiden, 0,5 eenheden / ul T4 DNA-ligase, en gist exo-fosfatase (5000 eenheden / ul) bij 16 ° C gedurende de nacht (meer dan 16 uur). De exo-fosfatase is alleen nodig voor monsters afkomstig van gist en kan worden omitted als dit protocol wordt gebruikt voor E. coli of menselijke monsters. </li><li> Na ligatie monsters worden gemengd met 4 delen van 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, en daarna geëxtraheerd met een gelijk volume fenol / chloroform. Na extractie van de waterige fase, zijn de voorbereidingen RNA geprecipiteerd met ethanol en opnieuw gesuspendeerd in water tot ongeveer 0,1 pg / pl. </li><li> Ligatie efficiëntie kan worden beoordeeld door het uitvoeren van 5-10% van de monsters die op 12% polyacrylamide gels die 7M ureum en gevisualiseerd met een fluorescerende gel scanner. Dit PAGE-analyse is ook nuttig om te bepalen van de hoeveelheid geoxideerde en controle de nodige monsters voor microarray hybridisatie. Een goede ligatie resultaat moet laten zien ~ 10% of meer van de Cy3/Cy5 met oligonucleotide wordt geligeerd aan het tRNA. Voor monsters met een goede etikettering efficiëntie, is 0.1-0.5 microgram totaal RNA per monster gebruikt voor array hybridisatie. </li></ol> Deel 4: Hybridisatie en analyse van de Microarray <ol><li> Voorafgaand aan hybridisatie microarray dia&#39;s worden gekookt in gedestilleerd water gedurende 1-2 minuten om ongebonden oligonucleotiden te verwijderen. </li><li> Cy3/Cy5 gelabelde monsters worden gecombineerd met 140 pi hybridisatiebuffer en zalm sperma DNA tot een uiteindelijke concentratie van 140 ug / ml en poly (A) tot een uiteindelijke concentratie van 70 ug / ml. </li><li> Een hybridisatie-programma (tabel 1), wordt uitgevoerd op een reeks automatische veredelaar. Voor tRNA werk, is het ten zeerste aanbevolen dat een automatische hybridisatie machine worden gebruikt, omdat handmatige hybridisatie produceert hoge achtergrond. </li><li> Nadat het programma is volledig handmatig te wassen de dia&#39;s met Wash 3-oplossing ten minste twee keer door zachtjes te schudden in een 50 ml conische buis gedurende 3-5 minuten. </li><li> Dia&#39;s kunnen gedroogd worden door centrifugeren bij een lage snelheid, minder dan 200 RFC, 5-10 minuten. Het is belangrijk om de dia&#39;s te houden van het licht, omdat blootstelling aan het licht zal het bleken van de fluoroforen. </li><li> Nadat de dia&#39;s worden gedroogd moeten ze onmiddellijk worden gescand voor optimale resultaten, indien nodig, ze kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen in een droge donkere plaats bij kamertemperatuur. Dia&#39;s kunnen worden gescand 2-3 keer zonder merkbare degradatie van de beeldkwaliteit. </li></ol> Deel 5: representatieve resultaten Wanneer behoorlijk geïsoleerd de totale RNA monster moet produceren een zeer schone spectrum met een OD 260: OD 280-verhouding in de buurt van 2. Er mag geen detecteerbare eiwit of fenol verontreiniging zijn. Bij het lopen op 1% agarose gels, moet een sterke tRNA band worden waargenomen met andere mogelijke nucleïnezuur bands variërend tussen organismen. Na oxidatie een schone tRNA band moet in acht worden genomen. Als een monster is merkbaar zwakker dan andere monsters of vegen wordt waargenomen, moeten de monsters niet worden gebruikt voor microarrays. Microarrays moeten hebben een zeer lage achtergrond, die is een orde van grootte lager is dan de zwakste tRNA sonde. Hoge achtergrond is meestal het gevolg van problemen tijdens het wassen stappen. Dit kan meestal worden vastgesteld door het bereiden van verse wasoplossingen en grondig wassen van alle apparatuur en leidingen voor rest-en neergeslagen SDS te verwijderen. <table border="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> Details </td></tr><tr><td> O-ring conditioning </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Introduceer monster </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Denatureren Sample </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Hybridisatie </td><td> 60 ° C, 16 uur </td></tr><tr><td> Was een </td><td> 50 ° C, debiet 10s 20s houden </td></tr><tr><td> Was 2 </td><td> 42 ° C, debiet 10s 20s houden </td></tr><tr><td> Was 3 </td><td> 42 ° C, debiet 10s 20s houden </td></tr></tbody></table> Tabel 1: hybridisatie protocol

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

We presenteren een methode om tegelijkertijd het bepalen van de relatieve opladen niveaus van alle tRNA&#39;s op de genomische schaal. Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor S. cerevisiae, en het heeft ook met succes gebruikt voor het tRNA laadprofielen te meten in E. coli en menselijke celculturen. Het kan worden aangepast aan ieder organisme met bekende genoom sequenties (waardoor annotatie van alle tRNA genen), zolang huisvesten als de totale rekening gebracht tRNA kan worden verkregen.

<table><tbody><tr><td>Microspin G-25 kolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; aminoacyl-tRNA synthetasen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-ligase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Hyb4 station</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B scanner</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genoom-brede analyse van aminoacylatie (charging) niveaus van trna met behulp van microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylatie, of het opladen, kan het niveau snel veranderen in een cel in reactie op het milieu [1]. Veranderingen in de tRNA opladen niveaus in zowel prokaryotische en eukaryotische cellen leiden tot translationeel regeling die is een belangrijke cellulaire mechanismen van stress respons. Bekende voorbeelden zijn de strenge reactie in<em&gt; E. coli</em&gt; En de Gcn2 reactie op stress weg in gist ([2-6]). Recent werk in<em&gt; E. coli</em&gt; En<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Hebben aangetoond dat tRNA laden patronen zijn zeer dynamisch en afhankelijk van het type van stress ervaren door cellen [1, 6, 7]. De zeer dynamische, variabele aard van tRNA lading maakt het essentieel om veranderingen in het tRNA opladen niveaus te bepalen op de genomische schaal, om volledig toe te lichten cellulaire respons op het milieu variaties. In deze review presenteren we een methode voor het gelijktijdig meten van de relatieve opladen niveaus van alle tRNA&#39;s in<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. Terwijl de hier gepresenteerde protocol is voor gist, is dit protocol met succes toegepast voor het bepalen van de relatieve laden niveaus in een breed scala aan organismen, met inbegrip<em&gt; E. coli</em&gt; En menselijke celculturen [7, 8].

We beschrijven een methode voor microarray analyse om de relatieve aminoacylatie niveaus van alle tRNA&#39;s te bepalen van de<em&gt; S. cerivisiae.</em

Genoom-brede analyse van aminoacylatie (Charging) niveaus van tRNA Met behulp van Microarrays

tRNA-aminoacylering, of charging, niveaus kunnen in een cel snel veranderen als reactie op de omgeving[1]. Veranderingen in tRNA-charging niveaus in zowel ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om relatieve veranderingen in de TRNA-ladingsniveaus te bepalen. Dit wordt bereikt door RNA te isoleren bij een lage pH voor en na de behandeling, om TRNA te isoleren met intacte ladingsniveaus. Als tweede stap wordt het RNA onderworpen aan een periodaatoxidatiebehandeling, waardoor de relatieve ladingsniveaus kunnen worden bepaald.Ligeer vervolgens de monsters aan een fluorescent oligonucleotide en hybridiseer deze op een microarray om veranderingen in de ligatieniveaus als gevolg van A-T-R-N-A-lading te meten; de resultaten worden verkregen. De veranderingen op CHO-genomisch niveau in TRNA-lading op basis van TRNA-microarraytechnologie. Hallo, ik ben John Zai van het laboratorium van DRT Pan van de afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie aan de Universiteit van Chicago.Vandaag laat ik u een procedure zien voor het isoleren en kwantificeren van geladen tRNA op genomisch niveau. We gebruiken deze methode in ons laboratorium om veranderingen in de tRNA-lading tijdens stressprikkels te meten. Laten we beginnen.Om totaal RNA te isoleren, begint u met het kweken van gistcellen tot een minimale equivalentie van 30 OD 600, wat ongeveer 30 microgram totaal RNA moet opleveren. Pelleteer de cellen in een tafelcentrifuge. Resuspendeer de cellen in een lysisbufferoplossing. Voeg een gelijk volume natriumacetaat en verzadigde fenol-chloroform toe en vortex 30 seconden, gevolgd door minimaal 30 seconden koelen op ijs.Herhaal het vortexen en homogeniseren nog twee keer. Centrifugeer het monster 15 minuten bij 18 600 RFC bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de waterige fase en voer na de tweede extractie nog een extractie uit met fenylchloroform verzadigd met acetaat.Precipiteer het RNA door 2,7 x volumes ethanol toe te voegen en centregeer gedurende 30 minuten bij 18.600 RFC bij vier graden Celsius. Resuspendeer de RNA-pellets in lysisbufferoplossing en precipiteer vervolgens voor een tweede maal met ethanol. Resuspendeer tot slot het RNA in een oplossing met 10 millimolair gebufferd acetaat en één millimolair EDTA voor verdere behandeling.Het monster kan gedurende ongeveer twee weken langer stabiel worden bewaard bij -80 °C. Bewaring wordt niet aanbevolen, aangezien een deel van het geladen tRNA zal beginnen te degraderen vóór de labeling met S3- of SCI-vijf fluorescente oligonucleotidetags. Het totale tRNA wordt onderworpen aan een periodaat-oxidatiebehandeling, waardoor de relatieve ladingsniveaus kunnen worden bepaald; meng het totale RNA met 0,066 µM van elke ecoli-tRNA-standaard en 100 mM gebufferd acetaat in de aanwezigheid van 50 mM natriumperiodaat. Gebruik voor het controle-tRNA-monster dat niet wordt geoxideerd 50 mM natriumchloride in plaats van het natriumperiodaat.Incubeer de reacties 30 minuten bij kamertemperatuur; stop na 30 minuten de reactie door glucose toe te voegen tot een concentratie van 100 millimolar en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zodra de reactie is gestopt, voer dan een bufferuitwisseling uit met een G 25 spincolumn om resterend natriumproraat uit de monsters te verwijderen. Precipiteer de monsters door gebufferd acetaat toe te voegen tot een eindconcentratie van 133 millimolar, natriumchloride tot een eindconcentratie van 66 millimolar en 2,7 x volumes ethanol.Isoleer vervolgens de tRNA-monsters via Resus door ze te suspenderen in 50 millimolair tris-HCL en 30 minuten te incuberen bij 37 °C. Neutraliseer de reactie na 30 minuten door een gelijk volume van 50 millimolair gebufferd acetaat en 100 millimolair natriumchloride toe te voegen en precipiteer met 2,7 x volumes ethanol. Resuspendeer het RNA-pellet in water bij ongeveer één µg per µL.Zodra de controle- en geoxideerde monsters zijn gecontroleerd op RNA-kwaliteit door middel van agarosegels, kunnen we overgaan tot de fluorescente labeling om fluorescente oligotags aan het TRNA te koppelen. Combineer 0,1 µg/µL RNA met 4 µM SI3 of SI5 met oligonucleotiden, ligasebuffer, 15% DMSO, 0,5 U/µL T4 DNA-ligase en gist-exofosfatase; incubeer dit bij 16 °C gedurende meer dan 16 uur. Meng na ligatie de monsters met vier volumes kaliumacetaat en kaliumchloride, en extraheer vervolgens met een gelijk volume fenylchloroform. Precipiteer na extractie van de waterige fase de RNA-preparaten met ethanol. Resuspendeer tot slot de RNA-pellets in water tot ongeveer 0,1 µg/µL voorafgaand aan hybridisatie; spoel de microarray-slides met gedestilleerd water gedurende één tot twee minuten om ongebonden oligonucleotiden te verwijderen.Combine vervolgens de vijf gelabelde S3- of SCI-monsters met 140 µL hybridisatiebuffer, zalm-sperm DNA tot een eindconcentratie van 140 µg/mL en poly A tot een eindconcentratie van 7 µg/mL; voer een hybridisatieprogramma uit op een automatische array-hybridisator. Wij raden het gebruik van een automatische hybridisatiemachine ten zeerste aan voor tRNA-werk, aangezien handmatige hybridisatie een hoge achtergrond veroorzaakt. Wanneer het hybridisatieprogramma is voltooid, worden de slides handmatig gewassen met wash 3-oplossing door ze drie tot vijf minuten voorzichtig te schudden in een 50 mL conische buis.Was de objectglazen ten minste tweemaal in buisjes die vooraf zijn omwikkeld met aluminiumfolie. Droog de objectglazen door ze voor optimale resultaten vijf tot 10 minuten bij een lage snelheid te centrifugeren. De objectglazen moeten onmiddellijk na het drogen worden gescand.Preparaten kunnen twee tot drie keer worden gescand zonder merkbare verslechtering van de beeldkwaliteit; representatieve resultaten van een correct geïsoleerd totaal RNA-monster en de analyse daarvan worden hier getoond. Dit monster heeft een zeer schoon spectrum met een OD 260/OD 280-ratio nabij 2, zonder detecteerbare eiwit- of fenolcontaminatie bij uitvoering op 1% agarosegels. Zowel geoxideerde als controlemonsters moeten een sterke tRNA-band vertonen, waarbij andere mogelijke banden van nucleïnezuren variëren per organisme.Als een monster merkbaar zwakker is dan andere monsters, of als er smearing wordt waargenomen, mogen de monsters niet worden gebruikt voor microarrays. Microarrays moeten een zeer lage achtergrond hebben, die een orde van grootte lager is dan de zwakste TRNA-probe. Ik heb zojuist gedemonstreerd hoe u TRNA kunt isoleren en de relatieve ladingsniveaus kunt bepalen bij het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om eraan te denken uw reagentia nucleasevrij te houden, vooral tijdens de oxidatie- en verdunningsstappen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

genome-wide-analysis-aminoacylation-charging-levels-trna-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Source: Stenum, T. S., et al. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the use of gel electrophoresis and northern blotting to detect and compare the charging levels of transfer RNAs in E. coli by separating aminoacylated and deacylated forms.

Gel Electrophoresis and Northern Blotting to Detect tRNA Charging Levels in E. coli

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

Hier presenteren we een methode voor het meten van direct transfer-RNA opladen niveaus van gezuiverde Escherichia coli RNA als een manier om te vergelijken van de relatieve niveaus van transfer-RNA, of elke andere korte RNA, over verschillende steekproeven gebaseerd op de toevoeging van spike-in cellen die een referentie-gen uitdrukt.

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

We beschrijven een originele transfer-RNA analyse platform genaamd SPOt (gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA). Ter plaatse gelijktijdig maatregelen cellulaire niveaus van alle tRNAs in biologische monsters, in slechts drie stappen en in minder dan 24 uur.

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Hier beschrijven we een protocol voor de Biochemische karakterisering van de gist RNA-aanpassen enzym, Mod5, en bespreken hoe dit protocol kan worden toegepast op andere RNA-aanpassen-enzymen.

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Leer een methode voor genoom-brede analyse van tRNA-charging in Saccharomyces cerevisiae met behulp van microarray-technologie. Deze aanpak helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitbiosynthese en stressreacties.

Genoom-brede analyse van aminoacylatie (Charging) niveaus van tRNA Met behulp van Microarrays

Meer video's verkennen