Genoom-brede analyse van aminoacylatie (Charging) niveaus van tRNA Met behulp van Microarrays

Het algemene doel van het volgende experiment is om relatieve veranderingen in de TRNA-ladingsniveaus te bepalen. Dit wordt bereikt door RNA te isoleren bij een lage pH voor en na de behandeling, om TRNA te isoleren met intacte ladingsniveaus. Als tweede stap wordt het RNA onderworpen aan een periodaatoxidatiebehandeling, waardoor de relatieve ladingsniveaus kunnen worden bepaald.

Ligeer vervolgens de monsters aan een fluorescent oligonucleotide en hybridiseer deze op een microarray om veranderingen in de ligatieniveaus als gevolg van A-T-R-N-A-lading te meten; de resultaten worden verkregen. De veranderingen op CHO-genomisch niveau in TRNA-lading op basis van TRNA-microarraytechnologie. Hallo, ik ben John Zai van het laboratorium van DRT Pan van de afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie aan de Universiteit van Chicago.

Vandaag laat ik u een procedure zien voor het isoleren en kwantificeren van geladen tRNA op genomisch niveau. We gebruiken deze methode in ons laboratorium om veranderingen in de tRNA-lading tijdens stressprikkels te meten. Laten we beginnen.

Om totaal RNA te isoleren, begint u met het kweken van gistcellen tot een minimale equivalentie van 30 OD 600, wat ongeveer 30 microgram totaal RNA moet opleveren. Pelleteer de cellen in een tafelcentrifuge. Resuspendeer de cellen in een lysisbufferoplossing. Voeg een gelijk volume natriumacetaat en verzadigde fenol-chloroform toe en vortex 30 seconden, gevolgd door minimaal 30 seconden koelen op ijs.

Herhaal het vortexen en homogeniseren nog twee keer. Centrifugeer het monster 15 minuten bij 18 600 RFC bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de waterige fase en voer na de tweede extractie nog een extractie uit met fenylchloroform verzadigd met acetaat.

Precipiteer het RNA door 2,7 x volumes ethanol toe te voegen en centregeer gedurende 30 minuten bij 18.600 RFC bij vier graden Celsius. Resuspendeer de RNA-pellets in lysisbufferoplossing en precipiteer vervolgens voor een tweede maal met ethanol. Resuspendeer tot slot het RNA in een oplossing met 10 millimolair gebufferd acetaat en één millimolair EDTA voor verdere behandeling.

Het monster kan gedurende ongeveer twee weken langer stabiel worden bewaard bij -80 °C. Bewaring wordt niet aanbevolen, aangezien een deel van het geladen tRNA zal beginnen te degraderen vóór de labeling met S3- of SCI-vijf fluorescente oligonucleotidetags. Het totale tRNA wordt onderworpen aan een periodaat-oxidatiebehandeling, waardoor de relatieve ladingsniveaus kunnen worden bepaald; meng het totale RNA met 0,066 µM van elke ecoli-tRNA-standaard en 100 mM gebufferd acetaat in de aanwezigheid van 50 mM natriumperiodaat. Gebruik voor het controle-tRNA-monster dat niet wordt geoxideerd 50 mM natriumchloride in plaats van het natriumperiodaat.

Incubeer de reacties 30 minuten bij kamertemperatuur; stop na 30 minuten de reactie door glucose toe te voegen tot een concentratie van 100 millimolar en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zodra de reactie is gestopt, voer dan een bufferuitwisseling uit met een G 25 spincolumn om resterend natriumproraat uit de monsters te verwijderen. Precipiteer de monsters door gebufferd acetaat toe te voegen tot een eindconcentratie van 133 millimolar, natriumchloride tot een eindconcentratie van 66 millimolar en 2,7 x volumes ethanol.

Isoleer vervolgens de tRNA-monsters via Resus door ze te suspenderen in 50 millimolair tris-HCL en 30 minuten te incuberen bij 37 °C. Neutraliseer de reactie na 30 minuten door een gelijk volume van 50 millimolair gebufferd acetaat en 100 millimolair natriumchloride toe te voegen en precipiteer met 2,7 x volumes ethanol. Resuspendeer het RNA-pellet in water bij ongeveer één µg per µL.

Zodra de controle- en geoxideerde monsters zijn gecontroleerd op RNA-kwaliteit door middel van agarosegels, kunnen we overgaan tot de fluorescente labeling om fluorescente oligotags aan het TRNA te koppelen. Combineer 0,1 µg/µL RNA met 4 µM SI3 of SI5 met oligonucleotiden, ligasebuffer, 15% DMSO, 0,5 U/µL T4 DNA-ligase en gist-exofosfatase; incubeer dit bij 16 °C gedurende meer dan 16 uur. Meng na ligatie de monsters met vier volumes kaliumacetaat en kaliumchloride, en extraheer vervolgens met een gelijk volume fenylchloroform. Precipiteer na extractie van de waterige fase de RNA-preparaten met ethanol. Resuspendeer tot slot de RNA-pellets in water tot ongeveer 0,1 µg/µL voorafgaand aan hybridisatie; spoel de microarray-slides met gedestilleerd water gedurende één tot twee minuten om ongebonden oligonucleotiden te verwijderen.

Combine vervolgens de vijf gelabelde S3- of SCI-monsters met 140 µL hybridisatiebuffer, zalm-sperm DNA tot een eindconcentratie van 140 µg/mL en poly A tot een eindconcentratie van 7 µg/mL; voer een hybridisatieprogramma uit op een automatische array-hybridisator. Wij raden het gebruik van een automatische hybridisatiemachine ten zeerste aan voor tRNA-werk, aangezien handmatige hybridisatie een hoge achtergrond veroorzaakt. Wanneer het hybridisatieprogramma is voltooid, worden de slides handmatig gewassen met wash 3-oplossing door ze drie tot vijf minuten voorzichtig te schudden in een 50 mL conische buis.

Was de objectglazen ten minste tweemaal in buisjes die vooraf zijn omwikkeld met aluminiumfolie. Droog de objectglazen door ze voor optimale resultaten vijf tot 10 minuten bij een lage snelheid te centrifugeren. De objectglazen moeten onmiddellijk na het drogen worden gescand.

Preparaten kunnen twee tot drie keer worden gescand zonder merkbare verslechtering van de beeldkwaliteit; representatieve resultaten van een correct geïsoleerd totaal RNA-monster en de analyse daarvan worden hier getoond. Dit monster heeft een zeer schoon spectrum met een OD 260/OD 280-ratio nabij 2, zonder detecteerbare eiwit- of fenolcontaminatie bij uitvoering op 1% agarosegels. Zowel geoxideerde als controlemonsters moeten een sterke tRNA-band vertonen, waarbij andere mogelijke banden van nucleïnezuren variëren per organisme.

Als een monster merkbaar zwakker is dan andere monsters, of als er smearing wordt waargenomen, mogen de monsters niet worden gebruikt voor microarrays. Microarrays moeten een zeer lage achtergrond hebben, die een orde van grootte lager is dan de zwakste TRNA-probe. Ik heb zojuist gedemonstreerd hoe u TRNA kunt isoleren en de relatieve ladingsniveaus kunt bepalen bij het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om eraan te denken uw reagentia nucleasevrij te houden, vooral tijdens de oxidatie- en verdunningsstappen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.