Name: De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer transgene Xenopus laevis produceren door restrictie-enzym gemedieerde integratie en nucleaire transplantatie. Deze methode maakt stabiele genexpressie tijdens embryonale ontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor ons werk wordt geleverd door de NIH, de March of Dimes, en de American Cancer Society.

Gewijzigde versies van deze transgenese aanpak werden in eerste instantie beschreven in 1 en 2. A. spermakernen voorbereiding Deze kernen bereidingsmethode is een bewerking van Murray 3, maar de proteaseremmers zijn weggelaten omdat ze interfereren met verdere ontwikkeling van eieren getransplanteerd met sperma kernen. Porties worden ingevroren bij -80 ° C en kan gebruikt worden voor transplantaties voor ongeveer 6 maanden. Alle oplossingen moeten worden voorbereid en op ijs geplaatst voorafgaand aan het begin van de voorbereiding. <ol><li> Verdoven 1-2 volwassen mannelijke X. laevis door onderdompeling in tricaïne ten minste 20 minuten gevolgd door een pithing, verwijder de testikels. </li><li> Rol de testes op een papieren handdoek om het bloed, de bloedvaten en vet lichaam te verwijderen, kort was ze in een 60 mm petrischaal met 1XMMR, en eventuele aanvullende stukken vet lichaam te verwijderen. Zorg ervoor dat u doorboren van de testes, omdat dit releases het sperma. </li><li> Overdracht testes een droge 60-mm petrischaal en maceraat testikels met een pincet totdat er geen zichtbare stukjes. Maceratie dient zo goed mogelijk gedaan worden om hoge opbrengsten van de kernen te verkrijgen. </li><li> Voeg 2mLs koude nucleaire voorbereiding buffer (NPB, 1X uit voorraad) om het maceraat en voorzichtig pipet op en neer. </li><li> Squirt maceraat door ongeveer 4 diktes van kaasdoek op een trechter, het verzamelen van in een 15 ml buis (bijv. Falcon 2059); Spoel schotel met 8mLs van de NPB en zet deze spoel door de kaasdoek, het verzamelen van het in de buis. Met handschoenen aan knijp de kaasdoek om de resterende vloeistof op te vangen in de buis. </li><li> Pellet het sperma bij 3000 rpm gedurende 10 minuten. bij 4 ° C in een swingende emmer rotor (bijv. 1480g in een Sorvall HB-4 rotor of equivalent) met de juiste buis adapters. Decanteer supernatant, voeg 8 ml NPB aan deze buis en pipet op en neer met een 10 ml pipet op hersuspenderen pellet; weer spin down zoals hierboven en decanteer supernatant. Equilibreren 1 ml NPB op kamertemperatuur gedurende de spin. </li><li> Resuspendeer pellet in 1 ml kamertemperatuur NPB met behulp van een 1 ml pipetteman tip, voeg 50μl van 10mg/mL vers gemaakte lysolecithin, meng voorzichtig, en incubeer gedurende 5 minuten. bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 10 ml koud 1XNPB +3% BSA op de buis om de lysolecithin reactie te stoppen, meng, en naar beneden draaien gedurende 10 min bij 3000 rpm in een swingende emmer rotor. Decanteren supernatant. De lysolecithin behandelde pellet eruit moet zien iets meer doorschijnend (minder ondoorzichtig wit) dan wel voorafgaand aan de lysolecithin behandeling. </li><li> Decanteer supernatans en resuspendeer pellet in 5 ml koud NPB +0.3% BSA, meng voorzichtig met een pipet van 10 ml en spin down gedurende 10 min bij 3000rpm, zoals hierboven. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 500μl van sperma opslagbuffer en over te dragen aan een 1,5 mL buis. Dit is nu uw kernen voorraad. Op te slaan op het ijs, terwijl u de opbrengst van de kernen. </li><li> Om de opbrengst van de kernen controleren, plaats 98 ul van sperma verdunningsbuffer (SDB), 1 ui van de nucleaire voorraad en 1μl van 1:100 verdunning van de Hoechst voorraad in een 1,5 ml Eppendorf buis. Meng de nucleaire voorraad heel goed met behulp van een scheermes-afgekapt (of grote opening) pipetpunt net voor het verwijderen van de 1 pl. Meng de verdunde SDB / Hoechst / kernen zeer goed en laat een klein bedrag aan stroom in de kamer van een verbeterde Neubauer hemacytometer door capillaire werking. Count kernen in een vierkant van de hemacytometer onder een samengestelde microscoop. Van een man is, moet u verkrijgen telt van ten minste 100 tot 200 (X10 4 cellen / ml) voor deze 1:100 verdunning van de voorraad voor een onverdunde voorraad concentratie van 1-2x10 5 cellen / ul. Als uw voorraad is minder geconcentreerd, laat de kernen regelen voor enkele uren, verwijdert u een aantal van de bovenstaande vloeistof, en vertellen. Laat de kernen bij 4 ° C gedurende de nacht om de glycerol te dringen voor een betere cryopreservatie, daarna goed mengen van de nucleaire voorraad met een grote opening pipetpunt, voor te bereiden 20μl aliquots, en vries in vloeibare stikstof. </li></ol> B. Bereiding van High Speed ​​Extract Deze methode is een bewerking van Murray 3 en produceert een interfase cytosolische extract dat zwelling en gedeeltelijke chromatine decondensation van toegevoegde spermakernen zal bevorderen. Extract kan worden ingevroren in kleine porties bij -80 ° C en ontdooid voor gebruik. <ol><li> 3-5 dagen voorafgaand aan de HCG injectie, eerste 8-12 volwassen vrouwtje X. laevis door het injecteren van 50 U van PMSG in het dorsale lymfe zak. De avond voor extract voorbereiding, injecteer elke kikker met 500 eenheden HCG en plaats twee kikkers / container in 2 liter 1XMMR. Aangezien een kikker met lyseren of het activeren van eieren in gevaar kunnen brengen het uittreksel voorbereiding, is het raadzaam om kikkers scheiden in paren voor de ovulatie. </li><li> De volgende ochtend, voor te bereiden en chillen alle oplossingen voor het begin van de voorbereiding. Voorzichtig, met de hand te verdrijven eieren van elke kikker in grote beakers met 1X MMR. Het scherm van de eieren van elke container en laten alle partijen eieren met tekenen van vlekken, lyseren of activering (gevisualiseerd door contractie van pigmentatie in het dier halfrond) van de procedure. Verzamel ongebroken eieren met nog pigmentatie. Goede eieren kunnen ook worden afgehaald bij de 1X MMR in de kikker emmers. Het totale volume van de eieren&gt; 100 ml vanaf de 8-12 vrouwtjes. </li><li> De-gelei de eieren. Om dit te doen, verwijder zo veel mogelijk te MMR, voeg dan een kleine hoeveelheid cysteïne-oplossing, en schud de eieren. Vervangen met verse cysteine ​​oplossing meerdere malen tijdens de-Gelerende. De-gelei elke partij van de eieren los en gooi deze weg batches met een breuk of ei activering. Combineer de rest van de eieren. </li><li> Was de eieren vier keer in ~ 35 ml van het extract buffer (XB), en vervolgens twee keer in 25 ml van de KVP-XB met proteaseremmers. </li><li> Om de eieren pakket: de overdracht van de eieren in Beckman UltraClear buizen. Laat de eieren om zich te vestigen. Verwijder zo veel CSF-XB mogelijk te maken. Centrifugeer de eieren met behulp van een Beekman SW 40 Ti rotor (of soortgelijke rotor) bij 1000 tpm (150 g) voor ~ 60 sec bij 4 ° C. Verwijder overtollige oplossing uit de top van de verpakte eieren. </li><li> Om de eieren te verpletteren en het genereren van cytoplasmatisch extract: centrifuge de eieren bij 10.000 toeren per minuut (16.000 g) gedurende 10 min bij 4 ° C. De eieren moeten afzonderlijke in drie lagen: lipide (boven), cytoplasma (midden), en de dooier (onder). Verzamel de cytoplasmatisch laag van elk buisje met een 18-gauge naald door het inbrengen van de naald door de buis aan de voet van de cytoplasmatische laag. Overdracht van het cytoplasma naar een nieuwe UltraClear Beekman buis op ijs. </li><li> Voeg protease remmers aan de geïsoleerde cytoplasma naar een uiteindelijke concentratie van 1X. Recentrifuge het cytoplasma bij 16.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de verduidelijkt cytoplasma zoals hierboven beschreven. Verwachten 0,75-1 ml cytoplasma / kikker te verkrijgen. </li><li> Voeg 1 / 20 van het extract volume van de energiemix voor het monster. Breng de cytoplasma in dikwandige polycarbonaat buizen voor de Beckman TL-100 ultracentrifuge. Buizen houden ongeveer 3 ml per stuk en moet ten minste de helft vol. </li><li> Voeg een M CaCl 2 aan elke buis tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 mM. Incubeer de buizen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Dit inactiveert CSF en duwt het extract in de interfase. </li><li> Balans van de buizen en centrifuge ze in een Beekman TL-100 ultracentrifuge met behulp van een TLA-100.3 rotor bij 70.000 toeren per minuut (200.000 g) gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Het cytoplasma wordt fractioneren in vier lagen, boven naar beneden: lipide, cytosol, membraan / mitochondria, en glycogeen / ribosomen. </li><li> Haal de cytosolische laag van elk buisje (~ 1 ml of 2-3 ml werd geladen in de buis) door het invoegen van een injectiespuit in de bovenkant van de buis door de lipide laag. Breng de cytosolische fractie in de frisse buizen en recentrifuge de monsters bij 70.000 toeren per minuut (200.000 g) gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Aliquot het supernatant in 25-ul monsters in 0,5 ml-buizen. Quick-bevriezing van de monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Om te bepalen of het extract effectief is, kunnen zaadcellen kernen worden geïncubeerd in het extract en gekleurd met Hoechst om te bepalen of de kernen zichtbaar zwellen (dikker en langer) binnen 10 minuten van de toevoeging bij kamertemperatuur. </li></ol> C. Transgenese reactie en celkerntransplantatie Belangrijk: Controleer of de oplossingen, de uitrusting en de kikkers allemaal klaar zijn voordat u een reactie. Als je eenmaal begint, moet u verdergaan met de reactie van het gebruik van de indicatief tijdschema hieronder beschreven, omdat veel onderdelen niet stabiel blijven voor&gt; 30 minuten. Terwijl de spermakernen voorraad wordt gehouden op ijs, moet transgenese reacties (zowel verdund en geconcentreerd) worden bewaard bij kamertemperatuur. <ol><li> Prime vrouwelijke kikkers. De avond voor transgenese, injecteren meerdere (3-5) volwassen vrouwtjes kikker met 800 eenheden HCG in de dorsale lymfe zak met vers gelegde eieren het begin van de volgende dag te verkrijgen. </li><li> De dag van de transgenese procedure, voor te bereiden of te brengen om de temperatuur van de oplossingen die nodig zijn voor de transgenese: <ol class="lalpha"><li> Vers gemaakte cysteïne (2,5% in 1XMMR, pH8.0). U moet enkele honderden milliliters om gebruikt te worden die dag. </li><li> 0.2XMMR +6% Ficoll voor transplantatie gerechten en het herstel van transgene embryo's en 0.2XMMR +100 ug / ml gentamicine (zonder Ficoll) voor het verhogen van embryo's. Oplossingen mogen niet warmer dan 18-21 ° C en transgene embryo's moeten worden verhoogd door vroege breuklijnen bij temperaturen tussen 16 en 21 ° C, omdat hogere temperaturen negatief zowel de frequentie van transgenese en de embryonale ontwikkeling beïnvloeden. </li><li> Ontdooien en op kamertemperatuur bevroren monsters van SDB (sperma verdunning buffer) voor transplantaties van de dag, dooi de hoge snelheid toe en plaats het op ijs, en bereiden een 100mm MgCl 2-oplossing. </li><li> Stap uit ee agarose injectie gerechten en vullen met MMR / Ficoll-oplossing, en het opzetten en pre-run de infusiepomp om de stroom te stabiliseren. </li><li> Controleer of de vrouwelijke kikkers zijn leggen en de eieren zijn van hoge kwaliteit. Optimaal, moeten de eieren hebben een stevige cortex (houd vorm na de-Gelerende). </li></ol></li><li> Het opzetten van een transgenese reactie: <ol class="lalpha"><li> Heel voorzichtig (met behulp van een afgesneden pipettip) meng de kernen voorraad en combineren in een 1,5 ml Eppendorf buis: 4μl kernen (~ 4-8X10 vijf kernen) 2μl gelineariseerd plasmide (100ng/μl) Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> terwijl de incubatie verloopt, verdunnen 0.5μl van restrictie-enzym in 4.5μl H 2 O en voeg 1μl van verdunde enzym om 18μl van SDB, 2μl van MgCl 2 en 2μl van hoge snelheid te halen. Voeg dit mengsel bij de kernen-plasmide reactie. Incubeer 10 minuten naar de kernen zwellen. </li><li> Tijdens deze incubatie, knijp eieren 2-3 kikkers en de-gelei in cysteïne oplossing. Was ze goed (5x) met 1XMMR, en gebruik een wijde boring pipet 400-500 dejellied eieren over te dragen aan elke agarose goed schotel met 0,2 x BMR +4% Ficoll. Dit duurt meestal ongeveer 10 minuten, eens zo ei-gerechten zijn bereid reactie is meestal klaar om te verdunnen. </li><li> Ongeveer 15-20 minuten na het starten van een stap, voorzichtig de reactie (kernen / extract / DNA) te mengen met een geschoren tip en ongeveer 5μl tot 150 ul SDB bij kamertemperatuur toe te voegen. Kernen in deze verdunde mengsel stabiel zijn voor ongeveer 1 uur., Terwijl ze transplantatie capaciteit niet behouden zo lang als links in de geconcentreerde mengsel. </li></ol></li><li> Laad de naald: Mix de verdunde reactie bereid hiervoor heel voorzichtig met een brede opening pipetpunt, dan is meteen last van de naald, als kern snel zal vestigen in de buis. Lijken de de naald, een stukje van fijne Tygon slang op het einde van een geschoren 200μl pipetpunt. Zuig de oplossing in de pipetpunt, dan bevestig de slang aan op de naald en laat de oplossing van de naald in te voeren door de zwaartekracht of voorzichtig indrukken van de pipet zuiger. </li><li> Bevestig de naald aan de pomp en slang transplantaties van de kernen te beginnen. Injecties moeten worden snelle, oppervlakkige en ongeveer loodrecht op het plasma van de eicel van de membraan om te voorkomen dat schade aanricht. Aan de snelheid van stroming voorgesteld (10nl/sec), houd de naald in het ei voor ~ 0.5 seconden. Je moet compleet 1-2 gerechten van transplantaties binnen 20-30 minuten. </li></ol> Na de injecties, laat de gerechten bij 16-20 ° C tot embryo's hebben bereikt de 4-8 cellig stadium. Sorteer de splijten embryo's uit de buurt van hun niet-splitsen van de buren door de overdracht van (met een glas Pasteur pipet met een tip ongeveer dezelfde diameter als een ei) om een ​​nieuwe grote schotel 0.2XMMR +4% Ficoll. Onderverdelen van de embryo's splijten in kleinere groepen (10-15 embryo's / putje van een 6-wells plaat) en cultuur in 0.2XMMR (geen Ficoll) +100 ug / ml gentamicine via de vroege ontwikkeling. Embryo's moet worden gecontroleerd tijdens de gastrulatie met een stervende embryo's onmiddellijk verwijderd en veranderde de media als dat nodig is. Problemen oplossen: <ol><li> Naald is geblokkeerd: oplossing vloeien voort uit de naald moet blijken tijdens de transplantaties. Als de naald verstopt raakt door zichtbare deeltjes, wijzigen naalden of proberen om het puin te verwijderen door het knippen van de tip met een tang en duwen oplossing door de naald. </li><li> Geen klieven eieren zijn verkregen: controleer of verdunningen van sperma kernen en injectievolume geschikt is en dat de naald was niet geblokkeerd tijdens de transplantatie. Als injectie volume te hoog is, kunnen eieren ook niet hechten en in plaats daarvan tonen verkleurd pigmentatie of schade. </li><li> Veel embryo's sterven tijdens de gastrulatie. Verschillende factoren kunnen verbeteren embryo's overleven: <ol><li> Wees voorzichtig met de kernen tijdens de voorbereiding en de enzymatische reactie. Decondensed kernen zijn kwetsbaar en moeten worden getransplanteerd met behulp van het tijdschema hierboven. Plaats ze niet op ijs. </li><li> De chromosomale schade die het sperma kernen tijdens de enzym reactie en nucleaire transfer van invloed op zowel de frequentie van transgenese en de normale ontwikkeling van embryo's. Chromosomale beschadiging van de kernen verbetert de efficiëntie van transgenese, maar een negatieve invloed op overleving / normale ontwikkeling. Verminderen of weglaten van restrictie-enzym tijdens het enzym incubatie kan de snelheid van een normale ontwikkeling, maar kan de frequentie van transgenese of plasmide copy number ingebracht in de embryo genoom te verlagen. </li><li> Als late blastula door gastrula embryo's vertonen tekenen van verkleuring of celdood is het ook mogelijk dat een reagens dat wordt gebruikt voor de transplantaties was toxisch voor de eieren. Bovendien, als eis niet een vaste cortex hebben, kunnen ze ondergaan exogastrulation en niet om de normale post-gastrula embryo's te genereren. </li></ol></li><li> Het aantal embryo's de uiting van de transgen is laag. Verhoog de hoeveelheid restrictie-enzym. </li></ol> Vertegenwoordiger Transgene Embryo resultaten <img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Transgene embryo's als gevolg van nucleaire transfers moet worden verhoogd tot expressie van de promoter van belang is te zien. In figuur 1 hierboven, een spier actine-promotor rijdt de expressie van groen fluorescent eiwit in de somieten van deze transgene kikkervisje.

<ol><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li>
<li>Karaulanov, E., Knöchel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li>
<li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling%3A+a+mechanism+for+lens+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li>
<li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li>
<li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li>
<li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Animal Care set en gebruik Comite aan de Washington University School of Medicine.

Voor elke transgene construct te testen, hebben we over het algemeen transplantatie kernen in 500-1000 eieren, op deze schaal, kunnen we het genereren van transgene embryo&#39;s uitdrukken tot 10 verschillende constructen per dag, afhankelijk van het aantal vrouwtjes worden aangezet om eieren te leggen. Van deze transplantaties, ongeveer een derde van de eieren aankleven en 60-80% van deze embryo&#39;s splitsen normaal verder door gastrulatie. Afhankelijk van de gebruikte reactie-omstandigheden, tussen de 10-50% van dez...

A. spermakernen voorbereiding Reagentia: <ol><li> 1X MMR (2mm CaCl2, 5mM HEPES, pH 7,5, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 100mm NaCl). </li><li> 0,1% tricaïne methaansulfonaat (MS222, aminobenzoëzuur ethyl ester, Sigma A-5040), 0,1% natriumbicarbonaat. Los op in water. </li><li> 2X Nuclear Voorbereiding Butter (NPB). Op de dag van het sperma kernen voorbereiding, make-up 30 ml 2X NPB uit hoeveelheden van de voorraad oplossingen in bevroren toestand bewaard: 500 mM sucrose (1,5 M stock), 30 mM HEPES (1M voorraad; titreer met KOH, zodat de pH 7,7 is op 15 mm), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501, 10 mM voorraad), 0,4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141, 10 mM voorraad), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632, 100 mM voorraad), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Gebruik de 2XNPB om a. te maken 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB +3% BSA (fractie V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB +0,3% BSA. </li><li> Lysolecithin: 100 pi van 10 mg / ml L-α-lyso-lecithine, eigeel (Calbiochem, 440154); te ontbinden bij kamertemperatuur vlak voor gebruik. Bewaar stevige voorraad bij 20 ° C. Gooi de bouillonpoeder indien het wordt plakkerig. </li><li> Bovine serum albumine (BSA): 10% (w / v) BSA (fractie V, Sigma A-7906) Make-up 5 ml in het water op de dag van de spermakernen voorbereiding. </li><li> Spermaopslag buffer (1 ml) 1x NPB, 30% glycerol, 0,3% BSA. </li><li> Sperma verdunningsbuffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM spermine tetrahydrochloride. Titratie tot pH 7,3-7,5 en op te slaan 0,5-1 ml aliquots bij 20 ° C. </li><li> Hoechst No 33342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml bouillon in dH 2 O, op te slaan in een lichte strakke vat bij 20 ° C. </li></ol> Uitrusting: <ul><li> Swinging emmer rotor en centrifuge </li><li> kaasdoek </li><li> dissectie tools (tangen en scharen) </li><li> fluorescentie microscoop </li><li> trechter </li><li> handschoenen </li><li> hemocytometer </li><li> naalden (26 gauge) </li><li> papieren handdoeken </li><li> petrischalen (60 mm) </li><li> pipetten </li><li> plastic (5 en 10 ml) </li><li> Pipetman tips (1 ml en 200μl) </li><li> Spuiten (1 ml) </li><li> buizen (14 ml, Falcon, 2059) </li><li> buizen </li><li> microcentrifuge (1,5 ml) </li></ul> B. Bereiding van High Speed ​​Extract Reagentia: <ol><li> 1X Marc&#39;s Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,5. Bereid een 10X voorraad, en pas de pH met NaOH tot 7,5. </li><li> 20X Extract buffer (XB) zout voorraad: 2 M KCl, 20 mM MgCl 2, 2 mM CaCl2, filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Extract buffer (XB, vers bereid en bewaard op ijs): 1X XB zouten, 50 mM sucrose, 10mm HEPES (1 M voorraad, getitreerd met KOH, zodat de pH is 7,7 bij verdund tot 15 mm; filter-steriliseren, en bewaar in porties bij 20 ° C). Bereid je ongeveer 100 ml. </li><li> 2% (w / v) L-cysteïne hydrochloride 1-hydraat: Made in 1X XB zouten voor gebruik en getitreerd tot pH 7,8 met NaOH. Bereid je ongeveer 300 ml. </li><li> CSF-XB: 1X XB zouten, 1 mM MgCl 2 (naast de 2 aanwezig is in XB zouten MgCl; uiteindelijke concentratie 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7,7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7,7. Bereid 50 ml. </li><li> Proteaseremmers: Mengsel van leupeptin, chymostatin, en pepstatine, elk opgelost tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaren in kleine porties bij 20 ° C. </li><li> 1 M CaCl 2. </li><li> Energie-mix: 150 mM creatine fosfaat, 20 mM ATP, 20 mM MgCl 2. </li><li> Zwangere Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc, 021825). Los op in water en opgeslagen bij 20 ° C. </li><li> Humaan choriongonadotrofine (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc, 057176). Los op in water en opgeslagen bij 4 ° C. </li></ol> Uitrusting: <ul><li> Xenopus laevis vrouwen </li><li> Naalden (18 en 26 gauge) </li><li> Pasteur pipet </li><li> wijde boring </li><li> Spuiten (1 ml) </li><li> , Microcentrifuge (0,5 ml) </li><li> Tubes, dikke polycarbonaat (Beckman, 349622) </li><li> Buizen, UltraClear (14 x 95 mm, Beckman, 344060) </li><li> Ultracentrifuge en rotoren (bijvoorbeeld Beckman TL-100 met rotors SW 40 Ti en TLA-100.3) </li><li> Bekers voor de ei-collectie </li><li> Emmers of containers voor het houden van vrouwelijke kikkers (bijvoorbeeld 4-L plastic bekers met deksels mesh). </li></ul> C. Celkerntransplantatie. Reagentia: <ol><li> 2,5% agarose in 0.1XMMR (voor het maken injectie gerechten) </li><li> 2,5% cysteïne in 1XMMR, PH8.0, bereid op de dag van gebruik </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml gentamycine (1000X voorraad) </li><li> hoge snelheid ei-extract (zie boven) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> 10X MMR (zie hierboven) </li><li> Restrictie-enzym (bijv. Notl van New England Biolabs) </li><li> Sperma verdunningsbuffer (SDB, zie hierboven) en sperma kernen (zie boven) </li><li> Humaan choriongonadotrofine (HCG) zoals hierboven </li><li> minerale olie (Sigma, M8410) </li><li> Gelineariseerd plasmide worden ingevoerd als het transgen: Maak gelineariseerd plasmide bij een concentratie van ongeveer 100 ng / ul in steriele, nuclease-vrij water (we vermijden Tris en EDTA-bevattende buffers, die zijn enigszins giftig voor embryo&#39;s). De restrictie-enzym gebruikt om het plasmide te lineariseren hoeft niet hetzelfde te zijn als het wordt gebruikt in de nucleaire overdracht reactie. We gebruiken meestal Notl voor alle reacties, ongeacht wat plasmide wordt gelineariseerd met. Sommige kalibratie van het enzym verdunning gebruikt in de reactie kan het nodig zijn, kan als te veel enzym schadelijke gevolgen hebben voor post-gastrula ontwikkeling. Plasmide kan worden gezuiverd op verschillende manieren: we meestal de Qiagen QIAquick PCR zuivering kit gebruik volgens de fabrikant richtingen; zuivering van een enkele band van een gel is niet nodig. Als plasmide wordt gezuiverd met behulp van fenol / chloroform extractie en ethanol precipitatie, zeker om alle sporen van organische en ethanol te verwijderen. </li></ol> Uitrusting: Agarose gerechten voor injectie: In een 60 mm plastic petrischaaltje lag een klein bootje 35mmX35mm wegen op gesmolten 2,5% agarose in water 0.1XMMR om een ​​depressie te maken met een agarose-gecoate bodem voor het vullen met eieren. Zodra agarose is uitgehard, wikkel in parafilm en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Maak 2-3 gerechten op voorhand voor elke reactie transgene u van plan bent te doen. Infusiepomp: We maken gebruik van een enkele spuit infusiepomp van Harvard Apparatuur, voorzien van een 3 cc spuit / naald gevuld met minerale olie (Sigma M-8410). Stompe de naald tip (om te voorkomen dat perforeren de slang) en bevestig de fijne Tygon slang. Laat de pomp op ~ 10nl/sec, dit gaat ervan uit dat de tijd dat de naald in elk ei zal niet groter zijn dan 1 sec. Pomp moet worden pre-run gedurende enkele minuten vóór het begin van transgenese voor de dag om te verzekeren dat de zuiger van de spuit is gelijk met de zuiger en dat de gestage positieve stroom van olie uit de slang zich voordoet. Naalden voor nucleaire overdrachten. Met behulp van een micropipet trekker, het genereren van naalden met lange, schuin tips. Clip deze met een pincet in een dissectiemicroscoop uitgerust met een oculair micrometer tot een ~ 80 micron opening te verkrijgen met een schuine vorm. Andere apparatuur: Xenopus laevis vrouwen, stereomicroscoop, incubator, micromanipulator, micro-injectie naald puller (bijv. Model P-87, Sutter), injectienaalden (26 gauge), glas micro-injectie naalden, oculair micrometer voor gekalibreerde knippen van micro-injectie naald tips om 80μm diameter, petrischalen, wegen boten 35mm, Tygon slangen (ID = 1 / 32 inch, OD = 3 / 32 inch)

de productie van transgene xenopus laevis door restrictie-enzym mediated integratie en nucleaire transplantatie

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stabiele integratie van gekloonde gen producten in de Xenopus genoom is nodig om de tijd en plaats van meningsuiting controle, om genen te uiten in een later stadium van de embryonale ontwikkeling, en om te bepalen hoe enhancers en initiatiefnemers van genexpressie reguleren binnen het embryo. Het protocol blijkt hier kan gebruikt worden om efficiënt te produceren transgene Xenopus laevis embryo&#39;s. Deze transgenese wordt in drie delen: 1. Spermakernen zijn geïsoleerd van volwassen X. laevis testis door behandeling met lysolecithin, waarbij het ​​sperma plasmamembraan permeabilizes. 2. Ei extract wordt bereid door lage snelheid centrifugeren, toevoeging van calcium aan het extract zorgen om de voortgang te interfase van de celcyclus, en een high-speed centrifugatie om interfase cytosol isoleren. 3. Nucleaire transplantatie: de kernen en extract worden gecombineerd met de gelineariseerde plasmide DNA worden ingevoerd als het transgen en een kleine hoeveelheid van de restrictie-enzym. Tijdens een korte reactie, ei-extract decondenses gedeeltelijk het sperma chromatine en de restrictie-enzym genereert chromosomale breekt dat recombinatie van het transgen te bevorderen in het genoom. De behandelde spermakernen worden vervolgens getransplanteerd in onbevruchte eieren. Integratie van het transgen gebeurt meestal voorafgaand aan de eerste embryonale klieving zodanig dat de ontstane embryo&#39;s niet chimerisch zijn. Deze embryo&#39;s kunnen worden geanalyseerd zonder dat te fokken voor de volgende generatie, waardoor een efficiënte en snelle generatie van transgene embryo&#39;s voor analyses van de promotor en gen functie. Volwassen X. laevis als gevolg van deze procedure ook propageren het transgen door de kiembaan en kan gebruikt worden om lijnen van transgene dieren voor meerdere doeleinden te genereren.

Deze video toont een protocol methode voor het genereren van transgene<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Door de introductie van transgenen in spermakernen gevolgd door nucleaire transplantatie in onbevruchte eieren.

De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Stabiele integratie van gekloonde genproducten in het Xenopus-genoom is noodzakelijk om het tijdstip en de plaats van expressie te beheersen, om genen in latere stadia van de embryonale ontwikkeling tot expressie te brengen en om te definiëren hoe enhancers en promotoren de genexpressie binnen het embryo reguleren. Het hier gedemonstreerde protocol kan worden gebruikt om efficiënt transgene Xenopus laevis-embryo's te produceren. Deze transgenese-aanpak bestaat uit drie delen: 1. Spermakernen worden geïsoleerd uit de testis van volwassen X. laevis door behandeling met lysolecithine, wat het plasmamembraan van de spermacellen permeabiliseert. 2. Eiextract wordt bereid door middel van centrifugatie bij lage snelheid, toevoeging van calcium om het extract naar de interfase van de celcyclus te laten gaan, en centrifugatie bij hoge snelheid om cytosol uit de interfase te isoleren. 3. Kern transplantatie: de kernen en het extract worden gecombineerd met het gelineariseerde plasmide-DNA dat als transgen moet worden geïntroduceerd en een kleine hoeveelheid restrictie-enzym. Tijdens een korte reactie zorgt het eiextract voor een gedeeltelijke decondensatie van het spermachromatine en genereert het restrictie-enzym chromosomale breuken die recombinatie van het transgen in het genoom bevorderen. De behandelde spermakernen worden vervolgens getransplanteerd in onbevruchte eicellen. Integratie van het transgen vindt gewoonlijk plaats vóór de eerste embryonale klieving, waardoor de resulterende embryo's niet chimeer zijn. Deze embryo's kunnen worden geanalyseerd zonder dat het nodig is om te fokken tot de volgende generatie, wat een efficiënte en snelle generatie van transgene embryo's mogelijk maakt voor analyses van promoter- en genfunctie. Volwassen X. laevis die voortkomen uit deze procedure geven het transgen ook door via de kiemlijn en kunnen worden gebruikt om lijnen van transgene dieren voor diverse doeleinden te genereren.

Om genexpressie tijdens de embryonale ontwikkeling van xenopus te bestuderen, moeten gekloonde genproducten stabiel in het genoom worden geïntegreerd. Eerst worden spermakernen geïsoleerd uit de testes van volwassen kikkers en gepermeabiliseerd. Vervolgens worden interfase cytosolische extracten bereid uit xenopus-eieren.De spermakernen en het eiextract worden gemengd met gelineariseerd transgeen DNA en een restrictie-enzym. Tijdens deze stap zorgt het eiextract voor de decondensatie van het spermachromatine, terwijl het restrictie-enzym de integratie van het transgeen bevordert. Ten slotte worden de behandelde kernen overgebracht naar onbevruchte eicellen.Elke cel van het resulterende embryo draagt het transgen, en de promoter-afhankelijke expressie van het transgen wordt gedetecteerd via immunofluorescentiemicroscopie of andere methoden. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van andere methoden, zoals DNA-injectie, is dat de resulterende embryo's de integratie van het transgen ondergaan vóór de eerste deling. Dit betekent dat de resulterende embryo's niet chimerisch zijn, waardoor er geen fokken vereist is.Met dit protocol kunnen grote aantallen transgene embry

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kernmembraan assemblage is een essentiële stap in de celdeling-cyclus, dit proces kan worden gerepliceerd in de proefbuis door het combineren van Xenopus sperma chromatine, cytosol, en licht membraan fracties. Compleet kernen worden gevormd, met inbegrip van nucleaire membranen met poriën complexen, en deze gereconstitueerde kernen zijn in staat van normale nucleaire processen.

In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.

Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Leer transgene Xenopus laevis produceren door restrictie-enzym gemedieerde integratie en nucleaire transplantatie. Deze methode maakt stabiele genexpressie tijdens embryonale ontwikkeling mogelijk.

De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Meer video's verkennen