Name: Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer laser capture microdissectie van Drosophila perifere neuronen uit derde instar larven. Deze methode isoleert specifieke zenuwcellen met hoge precisie voor RNA-extractie en downstream analyses zoals qRT-PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden gebruikt in deze studie, en Virginia Espina, dr. Emanuel Petricoin en Dr Lance Liotta voor hulp bij LCM. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost s Office (EPRI).

Algemene opmerkingen over LCM van Drosophila perifere neuronen Laat vanaf 6 uur, tot een week of langer voor het LCM, afhankelijk van het weefseltype en het aantal benodigde cellen. Alle procedures worden uitgevoerd in strikt RNAse-vrije omstandigheden volgens standaard procedures. Larven dat zich 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP of ppk-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgene reporter lijnen werden gebruikt voor deze experimenten. 1. De voorbereiding van de larven <ol><li> Verzamel 30-40 leeftijd-gematchte derde instar larven en was ze in DDH 2 O gevolgd door een korte spoelt in RNAse Away (Sigma-Aldrich), en een laatste wasbeurt in DDH 2 O tot Away te verwijderen RNAse. Wick het overtollige DDH 2 O helemaal met een schone Kimwipe voorafgaand aan de verankering van de larven in oktober </li><li> Neem een ​​schone tissue inbedding schimmel en combineer het met een dun (1,5-2mm) laag van oktober, net genoeg om een ​​enkele laag van de larven te dekken. </li><li> Voorafgaand aan de verankering van de larven, indien nodig, koel de LGO tot 0 ° C in het weefsel inbedding mallen. Doe dit door het plaatsen van de mal met LGO op een blok ijs. Dit zal bijdragen tot het verminderen larvale beweging tijdens de inbedding proces. </li><li> Plaats de schone larven op de pre-cooled oktober en schik ze in parallel aan elkaar. Nadat de larven zijn geregeld, langzaam vullen van de mal met oktober zonder verstoring van het larvale arrangement. Snap bevriezing van de schimmel door het op een droog ijs blok. [Critical Stap:. Snap-bevriezing van de larven direct om beweging te verminderen] Deze methode zal toelaten de larven worden in een enkel vlak, het maximaliseren van het aantal cellen beschikbaar per sectie voor vast te leggen. </li></ol> Als het nodig is om het weefsel morfologie behouden voor het identificeren van de cellen van belang, of indien de verwachte aantal cellen per sectie blijkt te zijn bevredigend dan direct doorgaan naar stap 11. Als alternatief als de cellen zijn specifiek gelabeld en kan worden geïdentificeerd met een duidelijk herkenbare marker, zoals GFP of RFP, maar het aantal cellen per sectie blijkt te laag te zijn, dan stappen 05 tot 10 mei nuttig zijn voor het verhogen van het aantal cellen beschikbaar voor het vastleggen per sectie. Dit zijn optionele stappen en mag alleen worden overwogen indien nodig, als een methode voor het verhogen van het aantal da neuronen beschikbaar voor LCM per sectie als de andere methode niet het scheppen van gunstige resultaten. [Let op: Deze methode kan verstoren van de algemene weefsel morfologie en maak weefsels identificatie op basis van specifieke ruimtelijke locatie erg moeilijk.] <ol start="5"><li> Was 50-70 derde instar larven, zoals beschreven in stap 1. Plaats de larven in een 1,5 ml microfugebuisje die 500 pi van RNAse vrij 1X PBS. </li><li> Dounce de larven met behulp van een stamper polypropyleen (USA Scientific), met 6-7 langzame krachtige slagen. </li><li> Centrifugeer de oplossing bij 16.000 (x) g gedurende 5-10 seconden (totdat de larven nagelriemen naar beneden naar de bodem van de microfugebuis]. Verwijder het supernatant. De pellet moet bestaan ​​voornamelijk uit larven cuticula waarop de PNS, inclusief da neuronen , is goed gehandeld. </li><li> Was de cuticula pellet 2-3 keer in 1X PBS en resuspendeer de pellet in 500 ui 1X PBS. Spin de oplossing bij 16.000 (x) g gedurende 1 minuut tot een compact pellet vorm. Zuig het supernatant geheel met een fijne Pasteur pipet. </li><li> Verwijder voorzichtig de pellet uit de microfugebuis met een schone spatel en lont uit het overtollige PBS met een schone tissue Kimwipe. [Opmerking: Het is belangrijk om de pellet te houden zo compact mogelijk naar de cel opbrengst te verhogen]. Plaats de compacte cuticula pellet op een plastic mal met een dunne laag van de OCT (1mm ongeveer). </li><li> Voorzichtig verspreid de korrel in een dunne cirkelvormige ruimte. Vul de mal met oktober, en vries het weefsel zoals beschreven in stap 4. </li><li> Met behulp van een cryostaat, snij vriescoupes bij 5-8 micrometer dikte op vlakte, geëtiketteerd, ongeladen, RNAse gratis glas microscoopglaasjes. [Kritische stap: Plaats de weefselcoupes in het midden van de dia.] </li><li> Bewaar de dia's direct op droog ijs of bij -80 ° C in een schone slide-box tot aan microdissectie. Voer LCM bij voorkeur binnen een week na het snijden van het weefsel. </li></ol> PAUZE PUNT 2. Uitdroging en nagelriem verwijderen van Frozen larvale secties [Kritische stap: Alle oplossingen voor uitdroging moet vers worden bereid voor elke LCM sessie. Volledige uitdroging van bevroren larvale weefsel is essentieel voor het bereiken van optimale efficiëntie microdissectie] <ol><li> Verwijder de dia's met daarin de bevroren larvale weefsel secties van de -80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs. </li><li> Verwijder een dia van droog ijs en meteen plaatst u dit rechtstreeksin een 50 ml conische buis gevuld met 70% ethanol fixatief, gevolgd door een korte spoeling in RNAse vrij DDH 2 O volgens de aanbevolen tijden weergegeven in tabel 1. </li><li> De aanwezigheid van larvale cuticula in de bevroren delen kunnen afbreuk doen aan de capture efficiency door het voorkomen van een efficiënte LCM cap-cel contact, die kunnen leiden tot niet-specifieke vast te leggen. Indien nodig, het gedrag van de volgende stappen (4-5) om de cuticula uit weefselcoupes. </li><li> Zachtjes direct pipet 50 ul van 2,5% trypsine op de weefselcoupes en incubeer gedurende 5-30 seconden bij kamertemperatuur. [Kritische stap: Deze stap kan nodig optimalisatie. De incubatietijd is afhankelijk van het weefsel te gemicrodissecteerde en sectie dikte. Langere incubatietijd kan duidelijk alles met inbegrip van de cellen van belang, terwijl een korte incubatietijd kan onvoldoende zijn om de cuticula te verwijderen] </li><li> Kort Spoel de secties in een 50 ml conische buis met RNAse-vrij DDH 2 O tot trypsine te verwijderen, en losjes gehandeld cuticula fragmenten. </li><li> Opeenvolgend Dompel de dia's in elk van de resterende ethanol en xyleen oplossingen voor de aanbevolen tijd (tabel 1) om de uitdroging te voltooien. </li><li> Na de uitdroging gradiënt, worden de dia's kort gedroogd onder een milde luchtstroom voor 60 tot 120 seconden bij kamertemperatuur voor het uitvoeren van LCM. [Let op: helemaal droog de ​​xyleen uit het weefsel secties voor het uitvoeren van LCM. Xyleen is bekend bij de LCM cap polymeer wat resulteert in microdissectie mislukking] te ontbinden. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 70% ethanol (Fixatief) </td><td> 30-10 Seconden </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 5-10 seconden </td></tr><tr><td> 2,5% Trypsine Incubation </td><td> 50-30 Seconden </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 5-10 seconden </td></tr><tr><td> Ethanol 70% </td><td> 60 Seconds </td></tr><tr><td> 95% Ethanol </td><td> 60 Seconds </td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> 120 seconden </td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> 120 seconden </td></tr><tr><td> 100% Xyleen </td><td> 120 seconden </td></tr><tr><td> 100% Xyleen </td><td> 120 seconden </td></tr><tr><td> De lucht drogen in een milde luchtstroom </td><td> 60 tot 120 seconden </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Aanbevolen procedure voor LCM uitdroging van diepgevroren larvale weefselcoupes. 3. Laser capture microdissectie PixCell IIe LCM instrument uitgerust met Fluor 300 epifluorescentie optiek geoptimaliseerd voor EGFP werd gebruikt voor het uitvoeren van het LCM. [Kritische stap: Indien mogelijk, de microdissectie presteren in een luchtvochtigheid gecontroleerde ruimte om een eventuele verlaging van microdissectie efficiency gevolg van de toegenomen vocht te voorkomen. Vochtigheid in de ruimte is een kritische factor invloed is op de microdissectie efficiency. Een lage vochtigheid in de ruimte kan leiden tot een verhoogde statische vastklampen wat resulteert in niet-specifieke vast te leggen, terwijl de hoge vochtigheid in de ruimte kan resulteren in een lage microdissectie efficiëntie. We realiseerden een optimale LCM efficiëntie tussen 25-50% relatieve luchtvochtigheid.] <ol><li> Schakel de stroom voor de microscoop en laser schakelkast. </li><li> Laad de CapSure dop houder montage met HS LCM caps (Molecular Devices): Twee patronen van LCM caps kunnen worden geladen in een keer. </li><li> Open de Molecular Devices software en voer het experiment details met inbegrip van dianummer en Cap lotnummer. </li><li> Plaats een nieuwe HS LCM kap van de cartridge op de PixCell IIe LCM instrument en positie van het correct met betrekking tot de joystick om een ​​goede positionering van de kap ten opzichte van ervoor te zorgen dat de vangst gebied. </li><li> Plaats de microscoop slide voorzien van vers gedroogde larven weefselcoupes op de microscoop podium voor microdissectie. </li><li> Zoek de fluorescent gelabelde cellen met behulp van de lenzen of het computerscherm. Vanwege de hoge specificiteit van PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgene reporter lijn, kan de klasse IV da neuronen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door de GFP fluorescentie. </li><li> Onder voorbehoud van het weefsel met behulp van LCM CapSure HS LCM caps [voor een gedetailleerde set van instructies voor het instellen van het instrument, het richten van de laser en het uitvoeren van LCM zie referentie 22]. </li><li> Pas de "Power" en "Duur" laserpuls parameters om een ​​precieze gesmolten polymeer spot, waarvan de grootte overeenkomt met het geselecteerde laser spotgrootte te bereiken. Pas de instellingen aan de grootte van gesmolten polymeer gebied aan te passen. De volgende parameters werden gebruikt voor microdissecting enkele klasse IV da neuronen: Spot diameter 7,5 micrometer, laser kracht 30-50 mW, laser tijd en 2-4 ms en 1-2 sHots per cel werden gebruikt. [Kritische stap: de laser parameters die nodig zijn voor een goede plek kan variëren, afhankelijk weefseldikte en ruimte luchtvochtigheid. Pas de "Power" en "Duur"-instellingen om de vereiste gesmolten polymeer puntgrootte bereiken voor microdissecting een of meerdere cellen.] </li><li> Voor een maximale specificiteit, microdissect cellen met minimale overlap en een sterke fluorescentie. Elke kap is in staat om het vastleggen van een groot aantal cel-lichamen. [Kritische stap: Om te voorkomen dat RNA degradatie, de totale analyse termijn waaronder uitdroging en microdissectie tot minder dan 45 minuten] </li><li> Als alle cellen van belang zijn vastgelegd, tilt u de HS LCM dop met de gemicrodissecteerde cellen en plaatste het op een schoon objectglas om de aanwezigheid van de gevangen cellen te bevestigen en visueel de dop op de aanwezigheid van ongewenste cellen of puin. </li></ol> 4. RNA isolatie van LCM afgeleide cellen <ol><li> Bevestig de kap met de gemicrodissecteerde cellen een ExtracSure (Molecular Devices) apparaat. Voeg 12μl van RNA-extractie buffer (PicoPure, Molecular Devices) om de dop oppervlak met daarin de cellen en sluit een omgekeerde dunwandige buis reactie (GeneAmp, Applied Biosystems) om het ExtracSure apparaat. Plaats het geheel op een lijn tray (Molecular Devices) en bedek het met een incubatie blok (Molecular Devices) voorverwarmd tot 42 ° C in een incubator. </li><li> Na een 30 minuten incubatie, centrifuge de buizen met de extracten van 800 (x) g gedurende 2 minuten. Sluit de buizen en op te slaan van de cel extracten bij -80 ° C tot aan RNA-zuivering. </li></ol> PAUZE PUNT <ol start="3"><li> Extract en de kolom van de RNA te zuiveren volgens de PicoPure (Molecular Devices) RNA-extractie kit instructies. DNAse behandeling is optioneel, en kan worden uitgevoerd op kolom in de RNA-zuivering als dat nodig is. Indien gewenst, kunnen meerdere LCM monsters worden gegroepeerd tijdens het zuiveringsproces in een kolom aan de uiteindelijke RNA opbrengst te verhogen en kan worden geëlueerd in een klein volume (11 tot 30 pl) van elutiebuffer (PicoPure, Molecular Devices) en opgeslagen bij -80 ° C tot klaar voor gebruik. Indien gewenst kan een 1 pi aliquot kan worden gebruikt om de totale RNA kwaliteit te beoordelen op een Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) </li></ol> Representatieve resultaten Laser capture microdissectie (LCM) werd gebruikt om single, klasse-specifieke of meervoudige Drosophila da neuronen te isoleren uit derde instar larven (figuur 1). LCM zorgt voor een hoge mate van precisie en specificiteit in de isolatie van Drosophila da neuron cellichamen (Figuur 2a-c). Bovendien werd het totaal RNA gezuiverd van deze geïsoleerde da neuronen blijken te zijn van uitstekende kwaliteit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van scherpe 5.8S, 18S en 28S ribosomaal RNA pieken wanneer geanalyseerd op een Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) (figuur 2d). Voor de beoordeling van de neuronale-specifieke verrijking van onze geïsoleerde cellen voerden wij real-time kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR) met behulp van de neuronale gen-specifieke marker, elav. Voor de qRT-PCR analyses hebben we de relatieve niveaus van elav expressie berekend in de LCM gemicrodissecteerde da neuronen en genormaliseerd deze uitdrukking aan die van onze endogene controle (rp49) en de verhouding tot de totale RNA geïsoleerd uit larven zijn geheel met behulp van de methode ΔΔCt 23. Deze analyses blijkt meer dan 2,5-voudige verrijking in de relatieve niveaus van elav in LCM micro-ontleed da neuron monsters ten opzichte van hele dieren (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: LCM van Drosophila perifere neuronen. (A) Leeftijd afgestemd derde instar larven worden geselecteerd, gewassen en (b) ingebed in een cryomold met oktober en ingevroren bij -80 ° C, (c) 8μm seriële coupes worden gemaakt met behulp van een standaard cryostaat en (d) geplaatst gelijkmatig op schoon glas dia's. Het glas dia's met de aangebrachte weefselcoupes worden bewaard bij -80 ° C voorafgaand aan de verwerking van LCM. (E, f) onmiddellijk voorafgaand aan LCM, het weefsel secties ontdooid en kort vast in 70% ethanol, gevolgd door korte spoeling in DDH 2 O. (g) De dia's worden in het kort geïncubeerd met trypsine en gespoeld met DDH 2 O tot nagelriemen (zwart) te verwijderen van de larvale secties. (h, i) weefselcoupes zonder larvale nagelriemen worden vervolgens verder gedehydrateerd in ethanol een gradiënt en uiteindelijk goedgekeurd in xyleen . (j) De LCM pet met een thermolabiele polymeer wordt geplaatst op de weefselsectie en de laser is pulserend op de geselecteerde fluorescerende cel lichaam. De laserpuls smelt het polymeer en overspoelt de geselecteerde cel lichaam. Het polymeer cap, samen met de gevangen cellichaam wordt opgeheven, en (k) <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: LCM faciliteert hoge precisie vastleggen van da neuronen. (A) representatief beeld van een uitgedroogd en trypsine behandeld 8 micron weefselsectie voor het uitvoeren van LCM, die twee klasse-IV da neuronen gelabeld met GFP door de PPK-GAL4, UASmCD8:: GFP reporter stam. Let op, is een van de neuronen gemarkeerd (pijlpunt) voor het vastleggen. (B) cellichaam van de gemarkeerde neuron (pijlpunt) netjes is micro-doorsneden met een hoge specificiteit van het weefsel sectie. (C) End-on weergave van een enkele klasse -IV da neuron gevangen op de LCM dop. (d) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) electropherogram van totaal RNA geïsoleerd van LCM-afgeleide da neuronen, waaruit de uitstekende kwaliteit van RNA, zoals aangegeven door de aanwezigheid van scherpe 5.8S, 18S , en 28S rRNA pieken. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3:. QRT-PCR onthult aanzienlijke verrijking van de neuronale marker genexpressie in LCM gevangen da neuronen in verhouding tot hele dier qRT-PCR analyses van neuron-specifieke marker-gen expressie (elav) in LCM gevangen da neuronen (21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP) en de hele dieren in de leeftijd afgestemd derde instar larven werd in drievoud uitgevoerd. Relatieve niveaus van elav uitdrukking in LCM gevangen da neuronen werden genormaliseerd om de endogene controle (rp49) en de relatieve om hele larven met behulp van de methode ΔΔCt 23. Een 2,5-voudige verrijking in de relatieve niveaus van elav in LCM gevangen da neuron monsters werd ten opzichte van hele dieren waargenomen. Het oplossen van problemen Probleem: RNA gedegradeerd, of van lage kwaliteit. Zorg ervoor dat RNAse vrij staat het hele experiment. Probeer het verminderen van hoeveelheid tijd besteed aan LCM per slide tot 30 minuten. Houd de dia's en samples op droog ijs, behalve bij het uitvoeren van LCM. Vermijd het ontdooien van de weefselcoupes als ze eenmaal zijn afgesneden. Probleem: De meeste cellen verloren gaan van de glijbaan tijdens de trypsine behandeling (stap 17-18). Probeer het verminderen van de tijd van trypsine behandeling. Probeer het verminderen van de trypsine concentratie. Probleem: Aanwezigheid van cuticula en andere niet-specifieke weefsel puin op de dop polymeer. Probeer het verwijderen van het weefsel puin door blotting het polymeer oppervlak met de kleverige kant van een zelfklevende noot 22. Probleem: Lage LCM-efficiëntie. Probeer het verhogen van de incubatietijd in 100% ethanol en xylenen. Verminder vochtigheid in de ruimte met behulp van ontvochtigers.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting%2C+for+use+in+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li>
<li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
<li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Het protocol vermeld in dit document beschrijft onze geoptimaliseerde methode voor de isolatie van Drosophila perifere neuronen via LCM. Terwijl dit LCM-protocol is ontworpen voor de specifieke isolatie van enkele, klasse-specifieke of meervoudige Drosophila da neuronen uit de derde instar larvale stadium van ontwikkeling, kunnen kleine wijzigingen van het protocol gemakkelijk worden aangepast voor het vangen van andere Drosophila celtypen van alle ontwikkelings- fasen met behulp van verschill...

Uitrusting: <ul><li> Cryostaat </li><li> 50 ml conische buis voor dia fixatie, spoelen, trypsine behandeling en ethanol / xyleen uitdroging </li><li> -80 ° C vriezer </li><li> Couveuse </li><li> PixCell IIe LCM Instrument met Fluor 300 epifluorescentie optiek geoptimaliseerd voor EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) </li></ul>

laser capture microdissectie van drosophila perifere neuronen

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

De dendritische arborization (da) neuronen van de Drosophila perifere zenuwstelsel (PNS) bieden een uitstekend model systeem in om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen klasse-specifieke dendriet morfogenese 1,2 onderzoeken. Ter bevordering van moleculaire analyses van de klasse-specifieke da neuron ontwikkeling, is het essentieel om deze cellen te verkrijgen in een zuivere populatie. Hoewel een waaier van verschillende cel en weefsel-specifieke RNA-isolatie technieken bestaan ​​voor Drosophila cellen, met inbegrip magnetische bead gebaseerd cel zuivering 3,4, TL-Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, en RNA-bindend eiwit op basis van strategieën 9, geen van deze methoden kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor het isoleren van een of meerdere klasse-specifieke Drosophila da neuronen met een hoge mate van ruimtelijke precisie. Laser capture microdissectie (LCM) is naar voren gekomen als een zeer krachtig instrument dat kan worden gebruikt om specifieke soorten cellen te isoleren uit weefsel secties met een hoge mate van ruimtelijke resolutie en nauwkeurigheid. RNA verkregen uit geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses waaronder qRT-PCR en microarray expressie profilering binnen een bepaald celtype 10-16. Tot op heden is LCM niet op grote schaal toegepast in de analyse van Drosophila weefsels en cellen 17,18, inclusief da neuronen in de derde instar larvale stadium van ontwikkeling. Hier presenteren we onze geoptimaliseerd protocol voor isolatie van Drosophila da neuronen met behulp van de infrarood (IR) klasse van LCM. Deze methode zorgt voor het vastleggen van enkele, klasse-specifieke of meerdere da neuronen met een hoge specificiteit en ruimtelijke resolutie. Leeftijd gematchte derde instar larven uitdrukken van een UAS-mCD8:: GFP 19 transgen onder de controle van zowel de klasse IV da neuron specifieke ppk-GAL4 20 driver of op de pan-da neuron specifiek 21-7 GAL4-21 driver werden gebruikt voor deze experimenten. RNA verkregen uit de geïsoleerde da neuronen is van zeer hoge kwaliteit en kunnen direct worden gebruikt voor downstream toepassingen, waaronder qRT-PCR of microarray-analyses. Bovendien kan deze LCM protocol gemakkelijk worden aangepast voor het vastleggen andere Drosophila soorten cellen een verschillende stadia van ontwikkeling afhankelijk van het celtype specifieke, GAL4 gedreven expressiepatroon van GFP.

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of meerdere<em&gt; Drosophila</em&gt; Da neuronen uit derde instar larven met behulp van de infrarood-capture (IR) klasse van de laser capture microdissectie (LCM). RNA verkregen uit de geïsoleerde neuronen kan gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen, waaronder qRT-PCR of microarray-analyses.

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

De dendritische arborisatie (da)-neuronen van het perifere zenuwstelsel (PNS) van Drosophila vormen een uitstekend modelsysteem om het ... te onderzoeken.

Lasercapture-microdissectie of LCM is ontstaan als een uiterst krachtig instrument dat kan worden gebruikt om specifieke celtypen uit weefselcoupes te isoleren met een hoge mate van ruimtelijke resolutie en nauwkeurigheid. Hier wordt LCM gebruikt om perifere neuronen te disseceren uit oph-larven in het derde stadium. Larven in het derde stadium worden ingebed in een cryovorm en bevroren, waarna een cryostaat wordt gebruikt om seriële weefselcoupes te snijden, die op glazen objectglazen worden geplaatst, ontdooid en gefixeerd in 70% ethanol.De coupes worden vervolgens geïncubeerd met trypsine om resterende larvale cuticula's te verwijderen en ondergaan dehydratatie via een ethanolgradiënt en xyleen-klaring. Vervolgens wordt er een LCM-kap op de weefselsectie geplaatst en worden selectieve fluorescente neuronen opgevangen met een gepulseerde laser. Ten slotte wordt RNA geïsoleerd uit de opgevangen cellen voor downstream-applicaties zoals kwantitatieve R-T-P-C-R of microarray-analyses.Hoi, ik ben Dan Cox van het Department of Molecular and Microbiology en het Krasnow Institute for Advanced Study aan de George Mason University. Hoi, ik ben Ish AER uit het laboratorium van Dr. Dan Cox.

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde...

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een ​​zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Hier een protocol beschrijven we voor optogenetic manipulatie van motoneuronal activiteit, terwijl het volgen van veranderingen in motorvermogen (spiercontractie) in...

Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Dit protocol demonstreert de lasercelablatie van individuele neuronen in intacte Drosophila-larven . De methode maakt het mogelijk om het effect te bestuderen van het verminderen van competitie tussen neuronen in het zich ontwikkelende zenuwstelsel.

Lasercelablatie in intacte Drosophila-larven onthult synaptische competitie

Leer laser capture microdissectie van Drosophila perifere neuronen uit derde instar larven. Deze methode isoleert specifieke zenuwcellen met hoge precisie voor RNA-extractie en downstream analyses zoals qRT-PCR.

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

Meer video's verkennen