Name: Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van humane T-lymfocyten voor migratieanalyse in vitro met ICAM-1 en SDF-1. Deze methode biedt inzicht in integrine-afhankelijke immuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies HL087088 (MK) en HL18208 (MK).

1. Isolatie van menselijke T-lymfocyten <ol><li> Verkrijgen menselijk bloed van een gezonde donor. Laat het bloed op kamertemperatuur (~ 30 min) afkoelen voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Voorzichtig Pipetteer 3 ml kamertemperatuur Polymorph dichtheidsgradiënt media in een 8 ml ronde bodem polystyreen buis. Voorzichtig Voeg 3 ml bloed op de top van de Polymorph media. Het is belangrijk om te voorkomen dat het mengen van de twee reagentia. </li><li> Centrifugeer de buizen op 500 xg gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na het centrifugeren, hebben het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) nu gescheiden van andere bloedcomponenten in de bovenste cellaag. De PBMC laag verschijnt, van boven naar beneden, als de eerste troebel band. </li><li> Verwijder voorzichtig het heldere geel gekleurde bovenste fase van het bloed, boven de PBMC laag, en gebruik vervolgens een P1000 micropipet aan de PBMC laag over in een 15 ml of 50 ml conische buis. </li><li> Twee keer Was de PBMC met PBS, centrifugeren cellen op 500 xg gedurende 5 minuten per keer. Het supernatant wordt half bewolkt na elke wasbeurt. </li></ol> 2. Cultuur van de Mens T-lymfocyten <ol><li> Met behulp van een pipet, de PBMC over te dragen aan een T-75 cultuur kolf in 20 ml RPMI 1640 medium met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1 ug / ml fytohemagglutinine (PHA). </li><li> Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 voor minimaal 1 uur, en tot 24 uur. Deze stap maakt monocyten, die zal worden aanhanger van de kolf oppervlak, worden gescheiden van de lymfocyten die blijven in suspensie. Als een korte incubatie (1 uur) wordt gebruikt bij deze stap, is het acceptabel om RPMI 1640 medium met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine, zonder aan te vullen met PHA zoals gespecificeerd in stap 2.1 gebruikt. </li><li> Verwijder voorzichtig al het afdrukmateriaal uit de kolf, voeg deze toe aan een 50 ml conische buis, en centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de celpellet, die voornamelijk bevat nu lymfocyten, en de cellen om een ​​nieuwe T-75 kolf met 25 ml RPMI 1640 medium met 10% FBS transfer, 1% penicilline / streptomycine en 1 ug / ml PHA. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 dagen (2 dagen als de eerste incubatie van PBMC 's nachts was). Na 24 uur van de groei, kan het nodig zijn van 15-20 ml vers medium toe te voegen en een grotere T-175 fles overdracht. </li><li> Na 3 dagen gebruik van een pipet aan de media en opgehangen lymfocyten uit de kolf en over te dragen aan een 50 ml conische buis. Centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de celpellet en overdracht cellen om een ​​nieuwe T-75 of T-175 kolf met 25 ml (T-75) of 50 ml (T-175) RPMI 1640 met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, en 20 ng / ml humaan IL-2 of IL-15. </li><li> Grow-lymfocyten voor 4-7 dagen. Als beginnend met een T-75 kolf, zal de cultuur moeten worden uitgebreid en overgebracht naar een T-175 fles na 1-2 dagen. </li></ol> 3. In vitro lymfocytenmigratie Assay <ol><li> 1 dag vóór de migratie test, jas een glazen bodem 0,17 mm schotel met 20 ug / ml Proteïne A of G in PBS overnacht bij 4 ° C. </li><li> Uitgebreid Was de schaal met PBS. </li><li> Immobiliseren menselijke ICAM-1/Fc (10 ug / ml) en menselijke SDF-1 (2 ug / ml) door het toevoegen van deze reagentia in PBS oplossing voor de schotel en 4 uur incuberen bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid T-lymfocyten door eerst het bepalen van de celdichtheid aan cultuur in de T-175 fles met behulp van een hemacytometer. Ongeveer 2-5 x 10 5 cellen worden gebruikt per schotel naar een celdichtheid geschikt is voor de migratie analyse. </li><li> Twee keer wassen T-lymfocyten met PBS en vervolgens opnieuw in suspensie in 1 ml L-15 medium met 1 mg / ml D-glucose. </li><li> Was de schaal bedekt met ICAM-1/Fc en SDF-1 uitgebreid met PBS. </li><li> Transfer T-lymfocyten in 1 ml media om de schotel en ze op 37 ° C te houden </li></ol> 4. Het vastleggen van een Image Sequence Met behulp van NIS Elements-software <ol><li> Open NIS Elements software. </li><li> In de camera-instellingen menu, kies "2x2 binning" als de modus voor zowel live beeldvorming en beeld vast te leggen. </li><li> Ga naar het menu Toepassingen en kies Definieer / Run Experiment. </li><li> Kies de lengte van de tijd tussen de beelden en de totale lengte van het beeld vast te leggen volgorde. </li><li> Druk op de "Run" knop om de afbeelding overname te beginnen. </li><li> Cellen kunnen worden getraceerd en migratie parameters (snelheid, weglengte, verplaatsing, enz.) gekwantificeerd met behulp van een van de verschillende softwarepakketten, waaronder ImageJ, AutoQuant of Volocity (figuur 1). </li><li> Voor het genereren van een 'spinnenweb plot,' de xy coördinaten voor elke cel en tijdstip bepaald worden verzameld (figuur 2) en geprojecteerd op een grafiek met een gemeenschappelijk uitgangspunt voor elke cel in de oorsprong (figuur 3). </li></ol> 5. Representatieve resultaten Op dag 6 van cultuur in de aanwezigheid van een IL-2 of IL-15, T-lymfocytenmake-up&gt; 98% van de cellen, zoals bepaald door positieve CD3 kleuring als positieve CD4-en / of CD8 vlekken. Voor IL-2, vonden we 83% CD4 +-cellen, 15% CD8 + en &lt;1% CD4 + CD8 + cellen. Voor IL-15, vonden we 88% CD4 +-cellen, 11% CD8 + en &lt;1% CD4 + CD8 + cellen. Tijdens de T-lymfocyt migratie op ICAM-1/SDF-1 substraten, cellen vertoonden een snelheid van ongeveer 15 micrometer / min die kan worden volgehouden meer dan een 1 uur tijd. T-lymfocyt migratie op ICAM-1/SDF-1 is afhankelijk van LFA-1-gemedieerde adhesie, als een anti-ligand LFA-1-blokkerende antilichaam ernstig remt migratie. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Cel volgen van het migreren van T-lymfocyten. T-lymfocyten geïsoleerd uit volbloed en gekweekt in de aanwezigheid van IL-2 of IL-15 voor 6 dagen mochten hechten en migreren op glas-bodem schalen bekleed met 10 ug / mL ICAM-1 en 2 ug / ml SDF-1. Beelden werden verworven elke 10 seconden gedurende 30 minuten. De cellen werden geïdentificeerd in elk beeld en gevolgd in de tijd met behulp van Volocity software. Deze film toont de willekeurige migratie van T-lymfocyten met een snelheid van ~ 15 micrometer / min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">Klik hier om de video te zien.</a> Film 1. Cell volgen van het migreren van T-lymfocyten. T-lymfocyten geïsoleerd uit volbloed en gekweekt in de aanwezigheid van IL-2 of IL-15 voor 6 dagen mochten hechten en migreren op glas-bodem schalen bekleed met 10 ug / mL ICAM-1 en 2 ug / ml SDF-1 . Beelden werden verworven elke 10 seconden gedurende 30 minuten. De cellen werden geïdentificeerd in elk beeld en gevolgd in de tijd met behulp van Volocity software. Deze film toont de willekeurige migratie van T-lymfocyten met een snelheid van ~ 15 micrometer / min. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Spatio-temporele cel positie. De XY coördinaten van elke cel werden verkregen voor elk tijdstip met behulp van Volocity software. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. "Spider web plot." Met behulp van de XYt coördinaten voor elke cel, 15 cellen werden willekeurig gekozen en uitgezet met een gemeenschappelijke startpunt bij de oorsprong. Het vergelijken van spinnenweb plots geeft een snelle visuele weergave van de verschillen in de migratie tussen de verschillende experimentele condities. Percelen voor de T-lymfocyt migratie onder controle condities (linker paneel) en in de aanwezigheid van een anti-ligand LFA-1-blokkerende antilichaam (rechter paneel).

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

In dit experiment geven we details over een eenvoudig systeem om de beweeglijkheid van de primaire menselijke T-lymfocyten te analyseren. In vitro migratie testen zijn gebruikt om de rol van de vele moleculen en signaalwegen die betrokken zijn bij de motoriek van de verschillende celtypes ontleden. Een aantal kritische controles in gedachten te houden bij het ontwerpen van je eigen experiment uit ons protocol zijn: 1) Niet-klevende en niet-klevende integrine substraat coatings, zoals bovine serum albumine (BSA)...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Rec. humaan IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>Rec. humaan IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>Rec. humaan ICAM-1/Fc</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>Rec. humaan SDF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

human t-lymfocyt isolatie, cultuur en analyse van de migratie in vitro</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

De migratie van T-lymfocyten houdt de lijm interactie van het celoppervlak integrines met liganden uitgedrukt op andere cellen of met extracellulaire matrix eiwitten. De precieze spatiotemporele activering van integrines van een lage affiniteit staat om een ​​hoge affiniteit toestand bij de cel leading edge is belangrijk voor de T-lymfocyt migratie<sup&gt; 1</sup&gt;. Ook terugtrekken van de cel achterrand of uropod, is een noodzakelijke stap in het onderhouden van aanhoudende integrine-afhankelijke T-lymfocyt motiliteit<sup&gt; 2</sup&gt;. Vele therapeutische benaderingen van auto-immuunziekten of ontstekingsziekten doel integrines als een middel om het buitensporige werving en migratie van leukocyten remmen<sup&gt; 3</sup&gt;. De studie van de moleculaire gebeurtenissen die de menselijke T-lymfocyten migratie te reguleren, hebben we gebruik gemaakt een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem naar cel migratie te analyseren op een twee-dimensionale substraat dat de omgeving die een T-lymfocyt tegenkomt bij de werving van het vaatstelsel nabootst. T-lymfocyten worden eerst geïsoleerd uit menselijke donoren en worden vervolgens gestimuleerd en gekweekt voor zeven tot tien dagen. Tijdens de test, zijn T-lymfocyten mogen hechten en migreren op een substraat bekleed met intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1), een ligand voor integrine LFA-1, en stromale cel-afgeleide factor-1 (SDF-1). Onze gegevens tonen aan dat T-lymfocyten een trekkende snelheid van ~ 15 micrometer / min vertonen. T-lymfocyt migratie kan worden geremd door integrine blokkade<sup&gt; 1</sup&gt; Of door remmers van de cellulaire actomyosin machines die regelt celmigratie<sup&gt; 2</sup&gt;.

T-lymfocyt migratie vindt plaats tijdens homing aan lymfoïde organen, het verlaten van het vaatstelsel en het aangaan van perifere weefsels. We beschrijven hier een protocol dat gebruikt kan worden om T-lymfocyten migratie te analyseren<em&gt; In vitro</em&gt;.

Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro</em

De migratie van T-lymfocyten omvat de adhesieve interactie van integrines op het celoppervlak met liganden die tot expressie komen op andere cellen of met extracellulaire ...

Migratie van T-lymfocyten vindt plaats tijdens het homing-proces naar lymfoïde organen, het verlaten van de vasculatuur en het binnendringen van perifeer weefsel. Dit proces omvat de adhesieve interactie van het T-celoppervlak met andere cellen. Om dit fenomeen in vitro te onderzoeken, worden humane T-lymfocyten geïsoleerd, gekweekt en geplaatst op weefselkweekplaten die zijn gecoat met het adhesieve eiwit.ICAM 1 en chemokine SDF 1. Beelden van T-lymfocytmigratie kunnen vervolgens worden verkregen en geanalyseerd. Hallo, ik ben Craig LeFort uit het laboratorium van Minsu Kim aan het Center for Vaccine Biology and Immunology van de University of Rochester.Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie en kweek van menselijke T-lymfocyten en een analyse van hun migratie in vitro. We gebruiken deze assay in ons laboratorium om de rol van integrines en T-celmigratie te bestuderen. Het belangrijkste integrine in T-cellen is lymfocytfunctie-geassocieerd antigeen 1 of LFA-1.De specifieke liganden voor LFA-1 zijn de ICAMs, zoals ICAM-1. Daarnaast is een kine-signaal vereist voor T-celmigratie om zowel een richtingsignaal te geven als om integrines te activeren. In onze assay gebrui

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

This video demonstrates an experimental investigation of lymphocyte transmigration across a blood-brain barrier (BBB) endothelium model. A monolayer of human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) is generated in vitro, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) containing lymphocytes are added to the monolayer. The cells are then incubated to allow lymphocyte transmigration, and the migrated cells are quantified using flow cytometry.

Studying Lymphocyte Transmigration Across a Microvascular Endothelial Cell Monolayer

We beschrijven een protocol om efficiënt huidresidente T-cellen te isoleren uit humane huidbiopsieën. Dit protocol levert voldoende aantallen vitale humane huidresidente lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo kweek.

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

Leer de isolatie en cultuur van humane T-lymfocyten voor migratieanalyse in vitro met ICAM-1 en SDF-1. Deze methode biedt inzicht in integrine-afhankelijke immuniteit.

Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro

Meer video's verkennen