Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro

T-lymfocytmigratie vindt plaats tijdens het terugkeren naar lymfatische organen, het verlaten van het vaatstelsel en het binnengaan van perifere weefsels. Dit proces omvat de adhesieve interactie van het oppervlak van de T-cel met andere cellen. Om dit fenomeen in vitro te onderzoeken, worden menselijke T-lymfocyten geïsoleerd, gekweekt en geplaatst op weefselcultuurplaten gecoat met het adhesieve eiwit.

ICAM een en chemokine SDF een. Beelden van T-lymfocytmigratie kunnen vervolgens worden verkregen en geanalyseerd. Hallo, ik ben Craig LeFort en het laboratorium van Minsu Kim in het Centrum voor Vaccinbiologie en Immunologie aan de Universiteit van Rochester.

Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie en cultivering van menselijke tienerlymfocyten, een analyse van hun migratie in vitro. We gebruiken deze test in ons laboratorium om de rol van integrinen en T-celmigratie te bestuderen. De belangrijkste integrine in T-cellen is lymfocytfunctie-associeerd antigen een of LFA een.

De specifieke liganden voor LFA een zijn de ica's, zoals ICAM een. Bovendien is een kin signaal vereist voor T-celmigratie om zowel een richtingssignaal te geven als om integrinen te activeren. In onze test gebruiken we menselijke ICAM een en CX CL 12 of SDF een als substraten voor T-celmigratie.

Dus laten we beginnen. Nadat menselijk bloed van een gezonde donor is verkregen, laat het bloed afkoelen tot kamertemperatuur. Dit duurt ongeveer 30 minuten.

Zodra het bloed is afgekoeld, pipet drie milliliter polymorfe dichtheidsgradiënt media op kamertemperatuur voorzichtig in een acht milliliter ronde bodem polystyreenbuis. Voeg vervolgens voorzichtig drie milliliter vol bloed toe. Het is belangrijk om elk mengen te vermijden.

Plaats de buizen in een centrifuge en draai het 500 G gedurende 45 minuten. Bij kamertemperatuur na de centrifugatie, zijn de perifere bloedmononucleaire cellen of P BMCs gescheiden van de andere bloedcomponenten. De PBMC-laag verschijnt als de eerste troebele band vanaf de bovenkant.

Onder steriele omstandigheden verwijdert en gooit u voorzichtig de heldere gele bovenste fase weg. Gebruik vervolgens een P 1000 micropipet om de PBMC-laag over te brengen naar een nieuwe conische buis. Was de PBMC twee keer met PBS, centrifugeer cellen bij 500 G gedurende vijf minuten.

Elke keer zal het supernatant enigszins troebel zijn Na elke was. Suspensie de cellen in 20 milliliter RPMI 1640 media bevattende 10% FBS, 1% penicilline streptomycine en één microgram per milliliter. Fyto hemagglutinine of PHA-incubatie in aanwezigheid van PHA induceert T-lymfocytactivatie en expansie.

Gebruik een pipet om de pbmc over te brengen naar een T 75-kweekfles. Vervolgens incuberen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende één tot 24 uur. Deze stap stelt monocyten, die zich aan het oppervlak van de fles zullen hechten, in staat om te worden gescheiden van de lymfocyten die in suspensie blijven.

Na de incubatie verwijdert u voorzichtig alle media die voornamelijk lymfocyten bevatten en brengt u deze over naar een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer bij 500 G gedurende vijf minuten. Reese heeft de celpellet in RPMI 1640 en brengt de cellen over naar een nieuwe T 75 flaz bevattende 25 milliliter van RPMI 1640 met FBS, penicilline, streptomycine en PHA geïncubeerd bij 37 graden Celsius.

Na 24 uur groei kan het nodig zijn om 15 tot 20 milliliter vers media toe te voegen en over te brengen naar een grotere T 1 75 fles. Blijf incuberen gedurende drie dagen of twee dagen. Als de initiële incubatie van PBMC overnacht was na drie dagen, gebruik een pipet om het medium te verwijderen, dat gesuspendeerde lymfocyten zal bevatten en breng het over naar een 50 milliliter conische buis, centrifugeer bij 500 G gedurende vijf minuten.

Reese heeft de celpellet en brengt de cellen over naar een nieuwe T 75 bevattende 25 milliliter van RPMI 1640. Met FBS, penicilline, streptomycine en humane IL twee of IL 15 plaats de cellen in de incubator. Als u een T 75-fles start, moet de cultuur worden uitgebreid en overgebracht naar een T 1 75-fles.

Na één tot twee dagen lymfocyten groeien gedurende een totaal van vier tot zeven dagen. Een dag voor de migratietest bedekt u een glazen bodem van 0,17 millimeter met 20 microgram per milliliter eiwit A of G in PBS, incubeer overnacht bij vier graden Celsius de volgende dag. Was de schaal uitgebreid met PBS, voeg vervolgens ICAM een FC en humane SD F1 in PBS-oplossing toe aan de schaal.

Incubeer gedurende vier uur bij kamertemperatuur om de moleculen te immobiliseren. Bepaal de dichtheid van de gekweekte cellen met behulp van een hemo cytometer. Was vervolgens de lymfocyten twee keer met PBS en suspendeer ze in één milliliter van L 15 media bevattende D glucose. Volg de incubatie, was de gecoate schaal met ICAM een FC en SDF een uitgebreid met PBS, breng de T-lymfocyten in één milliliter media over naar de schaal, ongeveer twee tot vijf keer 10 tot de vijfde cel moet worden gebruikt per schaal om een celdichtheid te bereiken die geschikt is voor migratieanalyse.

Om beelden van celmigratie te verkrijgen, plaatst u de schaal op de microscooptafel in een temperatuurgecontroleerde omgeving zoals een verwarmde kamer bij 37 graden Celsius. Open de NIS-elementensoftware in het menu afbeeldingsinstellingen. Kies binnend twee bij twee als de modus voor zowel live beeldvorming als afbeeldingsopname.

Ga naar het toepassingenmenu en kies, definieer, voer uit, experiment. Kies de lengte van de tijd tussen afbeeldingen en de totale tijd. Voor de afbeeldingsopnamesequentie drukt u op de knop uitvoeren om de beeldacquisitie te starten na de acquisitie.

Migratieparameters zoals snelheid, padlengte en verplaatsing kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een softwarepakket zoals Image J Auto Quant of veloc