Name: Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Leer functionele redundantie van genen tijdens embryogenese onderzoeken met Danio rerio. Deze methode gebruikt morfolino-injecties en reporterlijnen om compenserende mechanismen tussen genen te onthullen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de Evans laboratorium voor hun hulp bij de voorbereiding van deze presentatie. De morpholinos hier gebruikt werden oorspronkelijk gevalideerd door dr. Audrey Holtzinger. TE wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL064282 en HL056182). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Institute for Animal Care en gebruik Comite dat is ingesteld, van het Weill Cornell Medical College.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

In het experiment hier beschreven, combineerden we twee morpholinos, die elk alleen al het genereren van een duidelijke reeks van fenotypen, en vond een heel ander fenotype toen ze samen waren co-injectie. Uiteraard moesten we een rechtvaardiging voor het doen van dit experiment in de eerste plaats. We vermoedden dat de twee genen kunnen elkaar compenseren voor een eerdere functie, in dit geval hart-specificatie. Dit komt omdat de genen zijn zeer verwant (en in staat te binden aan dezelfde DNA-sequenties) en worden uitg...

<table><tbody><tr><td>Kweekbakken en scheidingswanden voor vissen</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visnetten</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Systeemwater</td><td></td><td></td><td>60mg Instant Ocean&amp;#8221; per liter dH2O</td></tr><tr><td>100mm Petri-schalen</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet-naaldtrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>3.5&quot; glazen capillairen</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Scheermesje</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Microslijper</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopoculair met raster</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerpbare weegschaaltjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Conventionele magnetron</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer-kolf</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>Maatkolf</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Automatische pipetman</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol wassoplossing</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>N2-cilinder</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; splice site morpholino</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5 ATG-blokker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt; Long Isoform ATG-blokker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Wegwerpbare Pasteur-pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-methansulfonaat</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Warmteblok</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Scherpe pincet</td><td>Dumont</td><td></td><td>Maat 55</td></tr><tr><td>Micro-objectglazen met kuiltje</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie test tijdens de embryogenese

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene functie tijdens de embryogenese wordt meestal bepaald door het verlies-van-functie experimenten, bijvoorbeeld door middel van gerichte mutagenese (knock-out) in de muis. In de zebravis model, doeltreffende omgekeerde genetische technieken die zijn ontwikkeld met behulp van micro-injectie van gen-specifieke antisense morpholinos. Morpholinos doel een mRNA via specifieke base-pairing en blokkeren genfunctie tijdelijk door het remmen van vertaling of splitsen voor meerdere dagen tijdens de embryogenese (knockdown). Echter, in gewervelde dieren zoals muizen of zebravissen, kunnen sommige genfuncties worden gestoord door deze benaderingen door de aanwezigheid van een ander gen, dat compenseert het verlies. Dit geldt vooral voor gen-families met zus genen die co-uitgedrukt in dezelfde ontwikkelen van weefsels. In de zebravis, kan functionele compensatie worden getest in een relatief high-throughput wijze, door co-injectie van morpholinos die zich richten op knockdown van beide genen tegelijk. Ook met behulp van morpholinos, kan een genetische interactie tussen twee genen worden aangetoond door knockdown van beide genen samen op sub-threshold levels. Kan bijvoorbeeld morpholinos worden getitreerd zodanig dat noch individuele knockdown een fenotype genereert. Als onder deze omstandigheden, co-injectie van beide morpholinos veroorzaakt een fenotype, is een genetische interactie getoond. Hier laten we zien hoe de functionele redundantie show in het kader van twee verwante GATA transcriptiefactoren. GATA factoren zijn essentieel voor de specificatie van cardiale voorlopercellen, maar dit is alleen onthuld door het verlies van zowel Gata5 en Gata6. We laten zien hoe het uitvoeren van micro-injectie experimenten, valideren morpholinos, en evalueren van het gecompenseerde fenotype voor cardiogenese.

Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo&#39;s.

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Genfunctie tijdens de embryogenese wordt doorgaans gedefinieerd door loss-of-function-experimenten, bijvoorbeeld door gerichte mutagenese (knock-out) bij de muis. In ...

Het algemene doel van deze procedure is om vast te stellen of twee genen functioneel redundant zijn voor de specificatie van een gedefinieerde cellijn. Dit wordt bereikt door eerst het loss-of-function fenotype van elk individueel gen te definiëren met behulp van genspecifieke morphino's die worden geïnjecteerd in zich ontwikkelende zebravisembryo's. De tweede stap van de procedure is het ontwikkelen van een assay voor het kwantificeren van de specificatie of differentiatie van de cellijn.Bijvoorbeeld door gebruik te maken van een reporter-vislijn, zoals we hier zullen laten zien. De derde stap van de procedure is het combineren van twee morph FENO's om gelijktijdig het functieverlies van beide genen te targeten. De laatste stap van de procedure is het evalueren van het fenotype dat wordt veroorzaakt door de dubbele knockdown.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verlies of winst van functie aantonen voor cellen van een specifieke lineage door onderzoek van de lineage-reporter of analyse van de expressie van een lineage-specifieke marker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het combineren van knock-outs in het muismo

a-reverse-genetic-approach-to-test-functional-redundancy-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

Deze video artikel beschrijft een eenvoudige in vivo methodiek die gebruikt kunnen worden om systematisch en efficiënt te karakteriseren componenten van complexe signaalwegen en regulatorische netwerken in vele ongewervelde embryo's.

De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryo&#39;s als<em&gt; In Vivo</em&gt; Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Het licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. Hier presenteren we een film die gedetailleerde procedures over hoe we het gedrag van de test toont.

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Leer functionele redundantie van genen tijdens embryogenese onderzoeken met Danio rerio. Deze methode gebruikt morfolino-injecties en reporterlijnen om compenserende mechanismen tussen genen te onthullen.

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Meer video's verkennen