Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese
11 augustus 2010
Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om te bepalen of twee genen functioneel overbodig zijn voor de specificatie van een gedefinieerde cel lijn. Dit wordt bereikt door eerst het verlies van functie fenotype van elk individueel gen te definiëren met behulp van genspecifieke morphos geïnjecteerd in zich ontwikkelende zebravis embryo's. De tweede stap van de procedure is het ontwikkelen van een assay voor het kwantificeren van cel lijn specificatie of differentiatie.
Bijvoorbeeld, met behulp van een reporter vis stam, zoals we hier zullen laten zien. De derde stap van de procedure is om twee morph FENO's te combineren om het verlies van functie voor beide genen tegelijkertijd te doelen. De laatste stap van de procedure is om het fenotype te evalueren dat wordt veroorzaakt door dubbele knockdown.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verlies of functieverlies voor cellen van een specifieke lijn laten zien door onderzoek van de lijn reporter of analyse van expressie voor lijn specifieke marker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het combineren van knockouts in het muis model, is dat twee of zelfs drie genen in het vis model kunnen worden gericht door eenvoudigweg gevalideerde morphos in één experiment te combineren. Meer dan 100 embryo's kunnen worden geïnjecteerd en fenotypen kunnen gedurende meerdere dagen worden geëvalueerd.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen. In de ontwikkelingsbiologie, zoals het definiëren van de transcriptionele paden die de celbestemming controleren, worden belangrijke regulatoire paden vaak vertegenwoordigd door kleine families van verwante genen die functioneel overbodig zijn. Hun rol is daarom niet duidelijk uit muis knockout studies vanwege compensatie van zuster genen.
Hoewel dit model inzicht kan geven in zebravis embryogenese, kunnen de resultaten worden toegepast op andere systemen zoals muis, aangezien dezelfde genetische programma's doorgaans goed geconserveerd zijn gedurende de evolutie. Bereid micro-injectie platen voor voor het injecteren van embryo's. Giet ongeveer 12 milliliters van 2% agros in systeem water, wat schoon water is dat rechtstreeks uit het vissen tank systeem is genomen, in het omgekeerde deksel van een 100 millimeter Petri schaal.
Plaats twee microscoopglazen op ongeveer 45 graden hoeken in de twee zijden van het deksel. Wanneer de agros is gestold, trekt u de glijbanen voorzichtig weg van het deksel, waardoor trogs ontstaan waar de embryo's rusten tijdens injectie. Morfo's worden bewaard bij kamertemperatuur op een concentratie van één millimolar en steriel gedistilleerd gedeïoniseerd water Voor het injecteren. Incubeer morpho's stocks gedurende vijf minuten op 65 graden Celsius om er zeker van te zijn dat ze volledig in oplossing zijn.
Laat de stocks afkoelen tot kamertemperatuur. Elke nieuw ontworpen morpho moet empirisch worden gevalideerd voor activiteit en embryo tolerantie. In microcentrifugebuizen, begin met een tot twee seriële verdunning van de stock morpho in gedistilleerd gedeïoniseerd water met werkconcentraties van één millimolar 0,5 millimolar 0,25 millimolar en 0,125 millimolar.
Gebruik onder een dissectie scope zuiging om een gecalibreerde injectienaald te voorladen die aan de micro manipulator is bevestigd en op de juiste positie is geplaatst. Laad de naald met ongeveer één microliter van de laagste concentratie morpho oplossing. Gebruik een transfer pijp om bevruchte een cel embryo's in de trogs van de micro-injectie plaat te verplaatsen.
Gebruik de pijp om overtollig water van de plaat te verwijderen zodat de embryo's op de bodem van de trog vallen. Plaats de injectie plaat onder de microscoop, daal de naald door de corion en in het dooier. Injecteer elk embryo voordat de naald wordt verwijderd en de injectie plaat opnieuw wordt gepositioneerd om het volgende embryo te benaderen.
Bij het leren injecteren kan het nuttig zijn om een vitale kleurstof te gebruiken om de injectie in de cel te visualiseren zoals hier wordt getoond, breng de embryo's terug naar een 100 millimeter Petri schaal met systeem water en kweek ze bij 28,5 graden Celsius. Verwijder eventuele resterende morpho oplossing uit de naald en vul deze met de volgende hoogste concentratie morpho voor het injecteren van de volgende batch embryo's op een geschikt ontwikkelingsstadium. Onderzoek de embryo's op elk geïnjecteerd morpho concentratie op fenotypen.
De drempel dosis voor elke morpho is de laagste dosis waarbij er een gedefinieerd betrouwbaar fenotype is. Meerdere rondes titratie kunnen nodig zijn om een onnauwkeurige drempel te definiëren. Om te zoeken naar een genetische interactie tussen twee verschillende genen.
Bereid een mengsel van twee morpho's van belang, elk in zijn respectieve drempel concentratie. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat embryo's mogelijk niet meer dan 20 nanogram totale morpho per injectie kunnen verdragen. Injecteer de embryo's op dezelfde manier als voorheen.
Houd injectie volumes constant tussen experimentele en controle groepen, die sets moeten omvatten die met elke morpho alleen worden geïnjecteerd onder de dissectie microscoop. Bewaak geïnjecteerde embryo's onmiddellijk na injectie en meerdere keren gedurende de dag, gebruik een transfer pijp om dode of stervende embryo's te verwijderen. Aangezien deze de levensvatbaarheid van de resterende morphines kunnen compromitteren, verplaats of euthaniseer embryo's op elk gewenst moment met een transfer pijp.
Plaats op een depressieschuifje voor observatie. Voor fotografie. Gebruik scherpe pincetten om de corion te verwijderen indien nodig.
Stabiliseer het embryo in een druppel van 3% Methyl cellulose screen embryo's voor een duidelijk fenotype, uniek voor de combinatie van morpho's in tegenstelling tot grotere penetratie van het fenotype van enkele morphines. Hier zijn verschillende wild type embryo's wanneer geïnjecteerd met morpho's op drempel. Voor gata vijf is het typische fenotype cardio bifida of twee harten, omdat de voorlopers niet fuseerden op de middellijn.
Let op de GFP positieve cardiomyocyten aangegeven door de pijlen. Het fenotype voor zes morphines omvat misvormde harten die niet goed kunnen lusen. Deze embryo's ontwikkelen ook GFP positieve cardiomyocyten.
Echter, de embryo's geïnjecteerd met een combinatie van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de functionele redundantie van genen in zebravisembryo's, wat de genfunctie in loss-of-function-experimenten kan maskeren. Door gebruik te maken van een high-throughput-model kunnen onderzoekers compensatiemechanismen tussen genen blootleggen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Genfuncties kunnen worden gemaskeerd door compensatoire acties van andere genen.
- Zebravissen dienen als modelorganisme voor het bestuderen van geninteracties.
- Loss-of-function-experimenten zijn cruciaal voor het begrijpen van de rollen van genen.
- Functionele redundantie kan de interpretatie van gene knockdown-studies bemoeilijken.
Doel van de studie
- Om vast te stellen of twee genen functioneel redundant zijn bij de specificatie van de cellijn.
- Om de impact van gelijktijdige gene knockdown op fenotypen te beoordelen.
- Om een kwantificeerbare assay te ontwikkelen voor differentiatie van de cellijn.
Gebruikte methoden
- Injectie van gen-specifieke morpholino's in zebravisembryo's.
- Gebruik van reporter-visstammen voor assays voor lijnage-specificatie.
- Combinatie van morpholino's voor double knockdown-experimenten.
- Evaluatie van de resulterende fenotypes uit de double knockdown.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van loss-of-function-fenotypes voor individuele genen.
- Succesvolle kwantificering van de specificatie van cellijnen.
- Aantonen van functionele redundantie tussen de getargete genen.
- Inzicht in de compensatiemechanismen in genfunctie.
Conclusies
- Het zebravismodel is effectief voor het bestuderen van genredundantie.
- Gelijktijdige gen-knockdown onthult complexe geninteracties.
- Het begrijpen van functionele redundantie is cruciaal voor de analyse van genfuncties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Functionele redundantie in genfamilies kan de validatie van targets in vroege discovery-fasen bemoeilijken, wat leidt tot fout-negatieven bij fenotypische screening. Deze op zebravis gebaseerde reverse genetische benadering maakt high-throughput onderzoek naar compensatiemechanismen mogelijk, waardoor de betrouwbaarheid van targets toeneemt en de risico's bij de identificatie van lead-verbindingen worden verminderd. Door genetische interacties bloot te leggen via sub-threshold co-knockdown, ondersteunt deze methode voorspellende modellering van gen-essentialiteit in vertebraten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om genetische interacties en functionele compensatie tussen verwante genen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van morpholino-titratie om drempelwaarden vast te stellen voor individuele en gecombineerde knockdown.
- Voorspellende waarde: Onthult fenotypische uitkomsten alleen wanneer beide genen worden onderdrukt, wat duidt op functionele redundantie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van reporter-vislijnen om de specificatie van cardiomyocyten te kwantificeren als een lineage-specifieke readout.
- Operationele waarde: Maakt injectie en fenotypering van meer dan 100 embryo's per experiment mogelijk voor schaalbare screening.
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve, visueel onderscheidbare fenotypes (bijv. cardio bifida, mislukte hartlooping) voor de beoordeling van de lineage.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Bevindingen in de cardiogenese van zebravis zijn toepasbaar op zoogdiersystemen vanwege geconserveerde genetische programma's.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen fenotypes voortkomen uit het verlies van een enkel gen of dat combinatorische perturbatie vereist is.
- Ondersteuning van preklinische modellen: Biedt een op zebravis gebaseerd platform om target-redundantie te valideren voordat er wordt geïnvesteerd in zoogdiermodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om targets te valideren en hypothesen te ontrisken vóór de lead-identificatie, met name voor genfamilies met compenserende leden.
- Ontdekkingsbiologie: Test transcriptionele regulatoren zoals GATA-factoren op redundante rollen bij de specificatie van het cellot.
- Screening: Stelt gestandaardiseerde morpholino-doseringen en fenotypische scoring vast voor een reproduceerbare beoordeling van de lineage.
- Analytica: Gebruikt fenotypische penetrantie en lineage reporter-output om enkelvoudige versus dubbele knockdown-effecten te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen uit de embryogenese van zebravis met geconserveerde pathways in hogere vertebraten.
- Herbruikbaarheid in de praktijk: Workflows voor morpholino-validatie en injectie zijn aanpasbaar aan andere genparen of ontwikkelingsprocessen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door echte genetische interacties te onderscheiden van compensatoire maskering.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, high-throughput embryonale injectie en fenotypering over meerdere concentraties mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door verborgen afhankelijkheden in doelnetwerken te onthullen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets door redundantie bloot te leggen die de effectiviteit van monotherapie kan ondermijnen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in zebrafish-embryogenese, microinjectie en validatie van morpholino-ontwerp.
- Afhankelijk van microinjectieapparatuur, fluorescentiemicroscopie en embryo-culturesystemen bij 28.5°C.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de opslag van morpholino, titratie en controle van het injectievolume.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende genetische doelwitten, inclusief oplosbaarheid en toxiciteitsdrempels.
- Beperkt door de tolerantie van het embryo, waarbij de totale morpholino-dosering wordt beperkt om aspecifieke effecten te voorkomen (≤20 ng per injectie).
