Chemotactische respons van mariene micro-organismen aan Micro-Scale voedingsstoffen Lagen

Hoi, mijn naam is Marcos. Ik werk samen met professor Roman Stalker bij Civil Environmental Engineering aan MIT en ik zal u laten zien hoe u een microkanaal maakt met behulp van de zelf-fotografietechniek. Om te beginnen moeten we een masker ontwerpen.

Dit is het masker, wat in feite het uiteindelijke ontwerp is van het microkanaal dat we willen maken. Dit is het ontwerp van een injector, waarmee we een dunne laag voedingsstoffen kunnen creëren waarin we micro-organismen laten zwemmen om te zien hoe de chemotaxis werkt, en dit is een kanaal met een zijholte om een microvortex in de holte te genereren; hiervan volgt later in de video een demonstratie. Nadat we het masker hebben verkregen, nemen we de wafers mee naar de cleanroom en plaatsen we deze in de petrischaal. We gaan nu naar de cleanroom.

Nu het masker is geprint en gereed, bevinden we ons in de cleanroom voor de eigenlijke microfabricage. Wat ik nu ga doen, is een stuk van de schone wafer nemen dat ik zojuist heb aangeschaft; ik wil er zeker van zijn dat deze extra schoon is door de volgende drie oplosmiddelen te gebruiken. De eerste stap is reinigen met aceton en vervolgens direct met methanol.

Vervolgens is de laatste stap isopropanol. We werken aan de glanzende zijde van de wafer, die is voorbereid voor de coating. Nu ga ik deze droogblazen met stikstof.

Na het drogen van de wafer plaatsen we deze in een oven op ongeveer 130 °C en bakken we deze gedurende vijf tot 10 minuten. Ondertussen, terwijl we wachten tot de wafer is gebakken, kunnen we de twee warmteplaten voorbereiden, één op 65 °C en de andere op 95 °C. Na vijf minuten bakken halen we de wafer uit de oven en laten we deze ongeveer vijf minuten op kamertemperatuur rusten.

Vervolgens zijn we klaar voor het spin-coaten. Voordat we de photoresist gieten, moeten we er zeker van zijn dat er geen stofdeeltjes op liggen; hiervoor gebruiken we stikstof om het oppervlak van de wafer schoon te spuiten. De spuitbeweging gaat van het centrum naar buiten.

Ik ga nu de fotolak over deze wafer gieten. We gieten een hoeveelheid van ongeveer drie milliliters. Probeer de fles zo laag mogelijk te houden, zodat er geen belletjes ontstaan terwijl u de fotolak over de wafer giet.

Laat de fotoresist nu ongeveer een minuut op de wafer rusten voordat we beginnen met spinnen. Zoals ik al vermeldde, ga ik een coatingdikte van 100 micron aanbrengen. We stellen de totale spin-tijd daarom in op 55 seconden en kunnen nu beginnen met spinnen.

Allereerst verhogen we de spinsnelheid in vijf seconden van nul naar 500 RPM en laten we dit ongeveer 10 seconden aanhouden, zodat kan worden waargenomen dat de photoresist de gehele wafer bedekt; vervolgens verhogen we de snelheid naar 3000 RPM gedurende ongeveer zeven seconden en laten we dit 30 seconden spinnen. Na het coaten van de wafer met de photoresist plaats ik de wafer op de warmteplaat voor een soft bake bij 65 °C gedurende vijf minuten en bij 95 °C gedurende 20 minuten. Nadat het soft baken bij 95 °C is voltooid, koelen we de wafer af tot kamertemperatuur, maar we koelen deze eerst terug naar 65 °C gedurende ongeveer twee tot drie minuten om een te snelle temperatuurdaling te voorkomen.

Vervolgens laten we het ongeveer vijf minuten afkoelen op kamertemperatuur. Nu ga ik het blootstellen aan UV-licht, zodat het belichte gedeelte uithardt en het niet-belichte gedeelte later kan worden weggespoeld. Dit is het onderdeel waarbij we het masker gebruiken en, zoals u ziet, bestaat het masker uit twee delen: het transparante gedeelte en het andere gedeelte dat in deze opstelling volledig ondoorzichtig of zwart is.

Ik ga dit masker nu bovenop de gecoate wafer plaatsen. Het masker dat u van het drukbedrijf ontvangt, heeft twee zijden. Eén daarvan is de zijde waarop zij met de inkt printen.

En dit is de zijde die u in contact met de wafer wilt brengen. Nu ga ik de wafer door het masker belichten met UV-licht. En om veiligheidsredenen zal ik deze veiligheidsbril dragen.

De belichtingstijd hangt af van de SUA die u gebruikt en de dikte die u wilt bereiken. Na het belichten plaats ik de wafer op de warmteplaat van 65 °C en bak ik deze opnieuw gedurende vijf minuten, gevolgd door 20 minuten bij 95 °C. Houd er rekening mee dat deze baktijd varieert afhankelijk van de gewenste dikte en de gebruikte SUA.

Vervolgens gaan we de wafer ontwikkelen. Ontwikkelen houdt in dat we het ongewenste deel van de fotoregist verwijderen, zodat alleen het belichte gebied op de wafer overblijft. Om de wafer te ontwikkelen en het ongewenste deel van de fotoregist weg te wassen, gebruiken we de ontwikkelaar.

In dit geval gebruik ik pomonal-acetaat als ontwikkelaar. Ik giet dit oplosmiddel in dit bekerglas, plaats de wafer en dompel deze ongeveer 10 minuten onder in het bekerglas. De tijd varieert overigens afhankelijk van de dikte en het gebruikte oplosmiddel. Na 10 minuten is te zien dat wat overblijft op deze wafer het gewenste ontwerp van het kanaal is, en dat alle ongewenste delen zijn weggespoeld; ik spoel het nu nog kort na.

We gebruiken hetzelfde solvent, een verse hoeveelheid, hetzelfde polyon-acetaat, en spuiten dit op de wafer om deze af te spoelen. Ten slotte gebruiken we isopropanol om het solvent weg te spoelen. Vervolgens drogen we de wafer af met stikstof.

U heeft nu een schone wafer met het gewenste patroon erop. Dit noemen we de master. We gaan nu terug naar ons laboratorium om PDMS hierop te gieten en de rest van de procedure te vervolgen.

We zijn nu terug uit de cleanroom en we hebben de master ontvangen, wat in feite de mal is die we gaan gebruiken. De volgende stap is het gieten van PDMS, een polymeer dat vervolgens zal uitharden. Zoals u kunt zien, zal het polymeer groeven vertonen wanneer we het over deze mal gieten; wanneer we dit vervolgens aan een glazen plaat hechten, vormt het polymeer zelf het kanaal.

Nu gaan we de PDMS voorbereiden. Dit is de PDMS, het polymeer polydimethylsiloxaan. En dit is een uithardingsmiddel.

Ik ga deze uithardingsmiddel in dit bekertje gieten en deze PDMS in dit bekertje gieten en ze mengen in een verhouding van 1:10. Over het algemeen gebruiken we een staafje om het homogeen te roeren. Tijdens het roeren ontstaan er veel bellen, en deze bellen dienen als indicatie om te zien of we het voldoende hebben geroerd.

Nu we de PDMS met het uithardingsmiddel hebben gemengd, kunnen we dit mengsel op de master gieten, wat in dit geval een wafer is. Om er zeker van te zijn dat de wafer niet verschuift tijdens het gieten, hebben we de wafer met tape vastgezet. Voordat we het PDMS-mengsel op de wafer gieten, willen we de wafer zo schoon mogelijk maken om eventueel neergeslagen stof te verwijderen.

We zetten de compressor aan om de wafer stofvrij te maken. Oké, u kunt zien dat het PDMS veel bellen bevat. We gaan deze bellen verwijderen door dit in een vacuümkamer te plaatsen.

Het vacuümtrekken duurt ongeveer 30 minuten om alle bellen te verwijderen. Zodra de bellen zijn verwijderd, halen we dit eruit en plaatsen we het in de oven op 65 graden Celsius om het gedurende ten minste 12 uur te bakken. Na 12 uur is de wafer klaar om gesneden te worden.

Ik gebruik dit mes om het PDMS door te snijden en het PDMS van de wafer te verwijderen, en daarna gebruik ik deze pons om de gaten voor de in- en uitlaten van de buisjes te ponsen. Bij het snijden moet u het mes naar beneden bewegen tot het de wafer raakt, maar oefen niet te veel druk uit om te voorkomen dat de wafer breekt, en snijd rondom uw kanaal. Pel het nu af.

Zoals u nu kunt zien, is dit het kanaal, wat het patroon van de wafer is. U ziet dat ze identiek zijn. En dit patroon is nu gegraveerd in dit polymeer, deze PDMS.

Zodra dit op een glazen plaat wordt gebonden, vormt dit het kanaal voor ons experiment. De volgende stap, die belangrijk is, is om eraan te denken gaten te ponsen, zodat we in- en uitlaten in de microkanalen kunnen plaatsen nadat de gaten in de microkanalen van de PDMS zijn geponst. We hebben schilderstape gebruikt om de kant van het kanaal, dus waar de groef zich bevindt, af te plakken.

En de reden dat we dit kanaal met plakband afplakken, is om alle stofdeeltjes te verwijderen. De volgende stap is de plasmabinding. Voorafgaand aan de plasmabinding, die we in het andere laboratorium zullen uitvoeren, verwijderen we de tape om het oppervlak dat we willen binden — namelijk dit oppervlak en de glazen objectglas — bloot te leggen, waarna we ze blootstellen aan zuurstofplasma en ze vervolgens samenvoegen, zodat ze zullen hechten.

Hallo, mijn naam is Justin Seymour en ik ben postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Roman Stocker aan het MIT. Mijn onderzoek richt zich op microbiële ecologie, meer specifiek op de manier waarop mariene microben in staat zijn om voedselconcentraties in de oceaan te vinden. We maken gebruik van microfluidische technieken om dit soort patronen te bestuderen.

We gaan nu het kanaal gebruiken dat Marcus eerder heeft gedemonstreerd hoe te produceren, na de plasmabinding. We kunnen dit vervolgens gebruiken in een microfluidisch experiment. Voorafgaand aan dit experiment moeten we de substraten die we in het experiment gaan gebruiken voorbereiden.

In het experiment van vandaag bekijken we hoe het mariene fytoplankton donella tur electro in staat is om voedselplekken op microschaal te vinden. In dit geval gaat het om ammonium, en we zullen een concentratie van 100 µM ammonium aanbieden. In deze experimenten kunnen we de voedselplekken visualiseren door een fluorescerende kleurstof toe te voegen aan de nutriënten die we verstrekken.

Daarom gebruiken we fluoresceïne-kleurstof. Hier pipetteer ik fluoresceïne tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar bij het ammonium, dat we als voedingsstof gebruiken. Vervolgens kunnen we deze voedingsstof visualiseren onder een fluorescentiemicroscoop, wat ons in staat stelt om te bekijken hoe een concentratie voedingsstoffen uitdiffundeert en vervolgens de reactie van organismen op die concentratie voedingsstoffen te bestuderen.

In de microfluidica-experimenten gebruiken we glazen spuiten. De eerste stap is het toevoegen van de substraten en organismen aan de spuiten die we gaan gebruiken. De volgende stap is het inbrengen van de slangetjes in de microfluidica-opstelling.

Dit doen we op de objecttafel van de microscoop. We plaatsen ons microfluïdische kanaal op de objecttafel en sluiten vervolgens de slangen aan op de in- en uitlaten. Daarna plaatsen we een afvalreservoir en zorgen we ervoor dat dit reservoir voor de helft is gevuld met vloeistof, zodat de slang in het afvalreservoir volledig ondergedompeld is.

Dit stelt ons in staat om een constante druk binnen het kanaal te handhaven. Vervolgens bevestigen we spuiten aan de slang die het microfluïdische kanaal voedt met de organismen, in dit geval donella, lector, en het voedingssubstraat, in dit geval ammonium. Daarna stellen we de microscoop in en controleren we of het microfluïdische kanaal in de juiste positie staat voordat we met de experimenten beginnen.

Zodra het kanaal in positie is, schakelen we over naar de camera om het kanaal te bekijken en kunnen we dit op de computer visualiseren. We kunnen nu fijnere aanpassingen aan de focus uitvoeren en we kunnen de injector visualiseren waarmee we voedingsstoffen injecteren. Deze bestaat uit een naaldpunt van 100 µm die in het microfluïdische kanaal is ingebouwd.

Door middel van injectie kunnen we een gradiënt van voedingsstoffen creëren. Vóór de start van de experimenten moeten we op dit punt eventuele luchtbellen verwijderen die in het microfluidische systeem terecht zijn gekomen. Dit doen we met behulp van een spuit gevuld met in dit geval kunstmatig zeewater, die we via een ventiel aan het microfluidische kanaal kunnen koppelen.

Vervolgens duwen we deze spuit om luchtbellen uit het kanaal te verwijderen. We kunnen luchtbellen op een van twee manieren verwijderen: door ze via de door de spuit gegenereerde druk via de uitlaat naar buiten te persen, of door ze door de wanden van het PDMS-materiaal te persen, aangezien dit materiaal gasdoorlatend is. Zodra de luchtbellen zijn verwijderd en we klaar zijn om met het experiment te beginnen, stellen we met behulp van een spuitenpomp de juiste stroomsnelheden in voor de injectie en de materialen in het kanaal.

In dit geval gebruiken we een debiet van 2 µL per minuut, wat overeenkomt met een stroomsnelheid in het kanaal van 266 µm per seconde. Zodra we het juiste debiet hebben ingesteld, kunnen we het experiment starten door de stroom te beginnen, waardoor er een dunne band van nutriënten ontstaat. We kunnen de nutriënten visualiseren terwijl ze vanaf het injectiepunt in het kanaal worden geïnjecteerd door fluoresceïne-kleurstof aan de nutriënten toe te voegen en dit te visualiseren met behulp van APF-fluorescentiemicroscopie. Vervolgens kunnen we de patchdynamiek bestuderen door de stroom in het microfluïdische kanaal te stoppen en de band van nutriënten te visualiseren die zijdelings vanuit hun oorspronkelijke positie diffundeert.

Vervolgens schakelen we over naar fasecontrastmicroscopie om de organismen te visualiseren die in het kanaal zwemmen en om hun posities ten opzichte van de nutriëntenplek te bekijken. Dit kunnen we doen door een reeks beelden op te nemen met een beeldrate van 10 per seconde, wat een film oplevert waarin we deze organismen kunnen visualiseren. We kunnen zwemmende organismen vervolgens visualiseren door tijdsverschillen te bepalen tussen twee individuele beelden, waarbij één beeld van het vorige wordt afgetrokken, zodat alleen de bewegende objecten worden gevisualiseerd.

Zo kunnen we de achtergrondruis uit de beelden verwijderen. Vervolgens nemen we met regelmatige tussenpozen opnames op gedurende 10 tot 20 minuten na de initiële vrijgave van de nutriëntenpatch. Door beeldanalyse-software te gebruiken om de posities van organismen van het ene frame in de sequentie op het andere te projecteren, kunnen we de veranderingen in positie van deze organismen bestuderen om informatie te verkrijgen over hun zwemtrajecten, waaruit we vervolgens meer gedetailleerde informatie over hun zwemstatistieken kunnen afleiden, waaronder snelheden en richtingsveranderingen.

Deze experimenten hebben ons er voor het eerst in staat gesteld om direct te onderzoeken hoe mariene microben in staat zijn om nutriëntenplekken op microschaal te vinden en te benutten. Dit zou belangrijke implicaties kunnen hebben voor de trofische dynamiek en de nutriëntencyclus in de oceaan. In aansluiting op wat Justin noemde, kan de manier waarop micro-organismen, en met name bacteriën, reageren op hun voedsel in de oceaan vele effecten hebben op biochemische cycli.

De oceaan is echter niet geheel stil; er zijn veel stromingscondities, zoals turbulentie die wordt opgewekt door de wind aan het oppervlak. Op de schaal van micro-organismen is datgene wat zij ervaren niet zozeer de grote turbulentie, maar wel de afschuiving, waarbij de kleinste overblijfselen van turbulentie bekendstaan als Kolmogorov-eddies. Wat we hier proberen te onderzoeken, is wat het effect van deze eddies is op het zwemgedrag van micro-organismen.

En om dat te doen, maken we een ander kanaal met behulp van deze massa die ik u eerder heb laten zien. En er is een holte in het centrum. Laat me dit tekenen om het diagram te vergroten.

Dit is hoe het kanaal eruitziet; dit is het bovenaanzicht, waarbij we de vloeistofstroom van links naar rechts injecteren. Door de afschuiving ontstaat er een recirculerende zone binnen deze holte. Deze holte is een representatie van een graad Addis. We kunnen dezelfde opstelling gebruiken die Justin eerder heeft uitgelegd; wanneer de spuitpomp is uitgeschakeld en er geen stroming is, is te zien dat de bacteriën vrijwel willekeurig en ongehinderd binnen deze holte zwemmen.

En er is geen voorkeursoriëntatie. De film die u ziet is een time-lapsefilm, wat precies dezelfde techniek is die Justin gebruikt. Wanneer de stroming erg snel is, zoals u kunt zien, worden de bacteriën door de vortex weggevoerd.

En de baan van de bacteriën zelf volgt de stroomlijn van de vortex. En wat eigenlijk interessanter is, is het volgende wanneer we de spuitpomp inschakelen. Maar de snelheid is niet zo hoog.

Het gaat niet zo snel dat bacteriën, de bacteriën er niet tegen kunnen vechten. Maar op een bepaalde manier is in deze film nog steeds een gelijkenis met een vortex te zien. Uit dit experiment hebben we dus geleerd dat in de aanwezigheid van een zeer sterke, turbulente stroming bacteriën overgeleverd zijn aan de stroming; ze zijn niet in staat de stroming te overwinnen.

In een regio met lichte turbulentie zijn ze echter nog steeds in staat om uit eigen beweging te zwemmen.