Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van culturen van het menselijke foetale retinaal pigmentepitheel, of RPE, die als model kunnen worden gebruikt. Bij onderzoek naar menselijke oogziekten worden weefsels van donoren ontvangen in de vorm van intacte oogbollen. De eerste stap van de procedure is het wegsnijden van overtollig spier- en bindweefsel en vervolgens het openen van het oog door het hoornvlies en de lens te verwijderen.

Het oog wordt behandeld met dispa en platgedrukt, waarna de RPE-monolaag van het choroidea wordt gepeld. De gedissecteerde RPE-cellen worden in kolfjes gezaaid en gedurende enkele weken gekweekt tot ze confluente monolagen vormen en pigment ontwikkelen. De celculturen worden gebruikt in in vitro functionele experimenten.

Succesvolle in vitro experimenten worden herhaald in preklinische diermodellen, waarbij RPE-responsen beter geëvalueerd kunnen worden in complexere signaleringsomgevingen. Het hier gepresenteerde model zal leiden tot een beter begrip van de RPE-fysiologie en nieuwe therapeutische interventies voor de behandeling van oogziekten. Hallo, mijn naam is Sheldon Miller.

Mijn laboratorium is gevestigd in het National Eye Institute, dat deel uitmaakt van de National Institutes of Health op de campus in Bethesda, Maryland. Hallo, ik ben Arki van het Miller Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het prepareren van primaire culturen van humane foetale retinaal pigmentepitheelcellen.

Deze cellen worden geprepareerd als confluente monoculturen die kunnen worden gemonteerd in gemodificeerde sing-kamers. We zullen deze geïsoleerde menselijke RPE-cellen ook gebruiken voor studies in de biochemie en genetica. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om primaire culturen van epitheelcellen op te zetten om de functie en regulatie van fysiologische en pathofysiologische processen te bestuderen en om klinische diermodellen van ziekten te ontwikkelen.

We richten ons op het retinaal pigmentepitheel of RPE, dat zich aan de achterzijde van het oog bevindt en de neurale retina scheidt van de bloedvoorziening van het choroidea. Dit schema van het oog toont de locatie van de RPE-laag aan de achterzijde van het oog, direct grenzend aan de fotoreceptoren. De inzet toont de cellen van de retina, met de fotoreceptoren rechts en de ganglioncellen links.

Dit epitheel is metabool extreem actief. Het fagocyteert continu fotoreceptoren op dagelijkse basis en het slaat vitamine A, het visuele pigment, op, hergebruikt en transporteert dit naar de fotoreceptoren. In de visuele cyclus werkt het homeostatisch om de chemische samenstelling en het volume van de omringende extracellulaire ruimtes te handhaven.

Een cruciale eigenschap van epitheel is de polariteit. De voortdurende asymmetrische levering van eiwitten aan de apicale en basolaterale membranen is een gereguleerd proces waardoor het epitheel het vectoriële transport van metabolieten, ionen en vloeistoffen van de ene extracellulaire ruimte naar de andere kan uitvoeren. Deze activiteit helpt het epitheel om de gezondheid en integriteit van het neurale retina te behouden.

De in vitro preparatie die we hier beschrijven, maakt de analyse mogelijk van transporteiwitten, receptoren en signaleringspaden die de epitheliale polariteit en functie bepalen voordat de dissectie begint. Bereid een 12-wells plaat voor in een laminaire flowkast met oplossingen op kamertemperatuur. Elk oog vereist één well met 10 x antibioticum-antimycotische oplossing, twee wells met 1 X PBS en één well met 2 units per milliliter disc space gedilueerd in 5% RPE-medium met serum. Vul een met siliconen gevoerde dissectieschaal met 1 X HBSS, giet de vloeistof af en breng elk oog over naar één well met antibioticum-antimycotische oplossing.

Incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Vermijd het uitoefenen van overmatige druk op de oogbol. Spoel het oog in twee opeenvolgende putjes met XPBS om overtollig antibioticum te verwijderen.

Gebruik vervolgens een pincet om het oog onder een dissectiestereomicroscoop over te brengen naar de dissectieschaal gevuld met één X-H-B-S-S. Gebruik irisscharen om overtollig spier- en bindweefsel rond het oog te verwijderen. Richt het oog zodanig dat het hoornvlies naar boven is gericht.

Gebruik twee steriele naalden van 27 gauge om het oog via het bindweefsel aan het siliconen kussen vast te pinnen zonder de sclera te beschadigen. Maak in deze positie met een side port-mesje een incisie door de sclera. De snede moet zich op één derde van de afstand tussen de equator van het oog en het anterieure oppervlak bevinden.

Gebruik irisscharen om de cirkelvormige incisie rond het oog voort te zetten om beschadiging aan het retinaal pigmentepitheel, afgekort RPE, door tractie van het glasachtig lichaam op de retina te voorkomen. Gebruik dezelfde scharen om door het glasachtig lichaam te knippen om de voorste ooglap van de oogbeker te scheiden.

Til het voorste gedeelte van de IOA op en gooi dit weg. Gebruik een pincet om het geopende oog over te brengen naar de well met dys. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het oog zitten.Cup.

Incubeer gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 °C met 5% CO₂. Verplaats het oog vanuit de incubeerruimte terug naar de dissectieschaal, die is gevuld met vers 1X HBSS op kamertemperatuur. Positioneer het oog met de beker naar boven gericht en zet het vast met twee naalden van 27 gauge.

Til onder de dissectiemicroscoop het gedeeltelijk gescheiden netvlies voorzichtig op met een fijne pincet en een retinaschaar. Snijd het netvlies los van de oogzenuw. Verwijder het netvlies met de irisschaar.

Maak een incisie vanaf de periferie van het oog naar de oogzenuw. Zet het oog vast met 5 naalden van 27 gauge. Gebruik retinascharen om een cirkelvormige snede rond de oogzenuw te maken om de RPE-laag uit te rekken.

Scheid de RPE-laag door over te schakelen naar een vergroting van 250 x of meer. Zoek de rand van het RPE-vel langs de snede die met de irisschaar is gemaakt en dicht bij de oogzenuw. Gebruik twee pincetten om het RPE en het Bruch-membraan te scheiden van de choroïdale weefsellaag.

Probeer verschillende gebieden langs de gesneden rand om te bepalen waar de verbinding tussen het RPE en het choroidea het zwakst is. Pel het membraan voorzichtig terug om het volledig te verwijderen. Plaats de RPE-vellen in een kegelvormige buis van 15 milliliter gevuld met trips in EDTA op kamertemperatuur.

Wanneer alle vellen zijn verzameld, sluit u de buis af en incubeert u de buizen 10 minuten in een waterbad bij 37 °C. Schud de buis krachtig om het RPE in kleine clusters te scheiden. De afwezigheid van donkere celklonters betekent dat de scheiding voltooid is.

Plaats de buis nog eens vijf minuten terug in het waterbad. Gebruik een pipette en voorzichtig zuigen om eventuele onverteerde weefselresten te verwijderen. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 280 5G.

Verwijder het supernatant. Vul het uiteindelijke volume aan tot negen milliliter met 15%RPE-medium en resuspendeer de cellen met een pipet. Pipetteer drie milliliter van de celsuspensie in een kolf van 25 vierkante centimeter.

Voeg twee milliliters vers 15% RPE-kweekmedium op kamertemperatuur toe. Laat de cellen een nacht incuberen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Naarmate de culturen rijpen, zal de pigmentatie na drie tot vier weken toenemen.

Succesvolle culturen zullen confluent zijn en een uniforme, intense pigmentatie vertonen. We hebben zojuist laten zien hoe u primaire culturen van menselijk foetaal RP prepareert. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.