Name: Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Verken een reproduceerbare methode voor het kweken van humane foetale retinale pigmentepitheelcellen die volwassen weefseleigenschappen nabootsen. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar oogziekten en therapeutische interventies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Lab leden Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Rong Li, Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova voor hulp bij het karakteriseren van deze celculturen. Speciale dank aan Jing Zhao, Connie Zhi, en Tina Banzon voor hun hulp bij het handhaven van een grote voorraad van de celculturen. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Intramurale Research Program.

1. Menselijk foetaal weefsel Alle menselijke weefsels gerelateerd onderzoek volgt de principes van de Verklaring van Helsinki en de NIH Institutional Review Board. Foetale ogen zijn verkregen door een onafhankelijke souteneur, Advanced Bio-Resources (ABR, Alameda, CA), van willekeurige donoren op 16 tot 22 weken van de zwangerschap, geplaatst in RPMI-1640 medium met buizen (geleverd door ABR), verpakt op ijs en geleverd door een overnachting prioriteit bezorgdienst. Weefsels blijven levensvatbaar tot 48 uur na de enucleatie. 2. Celkweekmedium MEM-alpha gemodificeerd medium (Sigma-Aldrich) wordt gebruikt als de basis medium tot 5% voor te bereiden en 15% serum-bevattende media voor het kweken van RPE cellen (RPE medium; onderstaande tabel 1). <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Aantal </td><td> Opslagruimte </td></tr><tr><td> MEM, alpha wijziging </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 te vullen </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurine </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 pg </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 ng </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum ** </td><td></td><td></td><td> 5% of 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Human Foetale RPE Medium componenten voor de bereiding van 500 ml Medium * THT wordt gemaakt door het oplossen van taurine-hydrocortison-triiodo-thyronin in een 1,5 ml PBS voordat u het medium. Meerdere fracties zijn gemaakt en opgeslagen bij -80 ° C tot het kweken van de voorbereiding van het kweekmedium te vereenvoudigen. ** Foetale bovine serum is niet verkregen van Sigma-Aldrich of Gibco. Foetaal runderserum worden gebruikt in de media bereiding wordt verkregen uit Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Elke fles van het serum is warmte geïnactiveerd (56 ° C gedurende 1 uur) voorafgaand aan het gebruik. Om ervoor te zorgen celcultuur consistentie van grote hoeveelheden serum van dezelfde partij worden gekocht en opgeslagen in -20 ° C tot ze worden gebruikt voor media voorbereiding. Dun gezaaid cellen van een specifieke partij hfRPE cellen worden gekweekt in 24 - of 12 - goed platen voor een paar weken in media die 20% FBS uit verschillende partijen. De snelst groeiende melanated cellen met de meest klassieke RPE morfologie (kasseien) geven een juiste serum veel dat kan worden gebruikt voor celkweek. Celkweekmedium bevat ook: N1 supplement (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml, Glutamax / penicilline-streptomycine 1:100 ml / ml (Gibco), en niet-essentiële aminozuren oplossing (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Daarnaast, hydrocortison (20 ug / L), taurine (250 mg / L), en triiodo-thyronin (0,013 ug / L) (THT) is vooruit bereid door het oplossen van deze drie componenten in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1:500 (ml / ml). Hoeveelheden van THT worden bewaard bij 80 ° C tot toegevoegd aan het RPE medium. 3. Cel Cultuur Bij ontvangst, intact zijn bollen gespoeld in antimycotische antibiotica-oplossing (verdund tot 10x;.. Cat geen 15240-096, Invitrogen) plus gentamicine (1 mg / ml) gedurende 3 tot 5 minuten (figuur 1 hieronder). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Na incubatie antibiotica zijn afgespoeld tweemaal met medium zoals HBSS of PBS. Een oogbol op het moment dat wordt overgedragen aan 10 cm Petrischaal met gecoat met Sylgard-184 (WPI) en vastgezet met 27G naalden. Met behulp van kaal gekapt SidePort mes (Alcon), een incisie wordt gemaakt door de sclera onder het corpus ciliare (1 / 3 van de afstand van oog evenaar naar de voorste oppervlak). Deze incisie wordt gebruikt om een ​​cirkelvormig gesneden voor het verwijderen van het voorste gedeelte oog te starten. Deze snede wordt gemaakt met behulp van een wolfraam-carbide coating gebogen iris schaar met een mes gekarteld (FST). Voorafgaand aan het verwijderen van het voorste deel van het oog, wordt een snede gemaakt door het glasachtig lichaam om te voorkomen dat het losmaken van de retina van de RPE op de achterste paal. Na het voorste deel van het oog is verwijderd, wordt de achterste paal geïncubeerd met dispase-I-oplossing (2 U / mL, cat geen 04942086001,.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in 5% serum met medium voor 40-60 minuten in 37 ° C-5% CO 2. Na de dispase behandeling worden de achterste palen overgebracht naar een HBSS in petrischalen met siliconen vulling (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) en ontleed in kwadranten of grotere stukken voldoende plat weefsels. Dan het netvlies wordt voorzichtig verwijderd met een pincet. Single-cell RPE lagen afgepeld in bladen en direct verzameld in koude trypsine-EDTA (Gibco, # 25200-056) oplossing. Nadat de RPE worden verzameld, zijn buizen met weefsels in trypsine-EDTA verzegeld en overgebracht naar waterbad gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C. Na 10 minuten incubatie, zijn de buizen krachtig geschud om RPE scheiden in kleine clusters. Als de scheiding niet compleet is, zijn de buizen terug geplaatst in het water bad voor nog eens 5 minuten. Na het trypsine-EDTA incubatie worden de buizen gecontroleerd op mogelijke niet-opgeloste gemengde cel clusters. Alle waargenomen clusters zijn verwijderd met behulp van fijne getipt glas Pasteur pipet. Na het stoppen met draaien (1,4 rpm op klinische centrifuge voor 4 min.), zijn hfRPE cellen opnieuw gesuspendeerd in 15% RPE media en vervolgens in Primaria kolven (bijvoorbeeld: cat geen 08-772-45, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Dit medium wordt vervangen na een dag met 5% serum-bevattend RPE medium, en de daaropvolgende wijzigingen zijn aangebracht om de 2 tot 3 dagen. Na 3 tot 4 weken, de cellen werden samenvloeiende en gelijkmatig gepigmenteerd. Vervolgens worden ze getrypsiniseerd in 0,25% trypsine-EDTA voor 10 tot 15 minuten, opnieuw gesuspendeerd in 15% serum-bevattende RPE celcultuurmedium, en gezaaid op clear cell cultuur inzetstukken in de 150 tot 200K cellen per well (Transwell, Corning Costar, Corning, NY), met behulp van 12-mm diameter inserts, 0,4-um poriën, polyester membranen (bijvoorbeeld: cat geen 07-200-161, Fisher Scientific)... Voor zaaien, werden de putjes bekleed met menselijke extracellulaire matrix (10 ug in 150 ul per putje HBSS, cat geen 354.237,.. BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey) en uitgehard met UV licht in de kap voor 2 uur. In sommige gevallen werd de behandeling met trypsine procedure herhaald voor de tweede keer, om de cellen die niet los na de eerste behandeling met trypsine te verzamelen. Hetzelfde protocol (met uitzondering van coating met ECM) werd gebruikt om de cultuur cellen op de kolven om de P1 populatie van cellen te genereren. Deze cellen werden gebruikt in experimenten toen zij had een totaal weefsel weerstand van ≥ 200 Ω • 2 cm en werden gelijkmatig gepigmenteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Klik hier voor een grotere figuur 1</a> . 4. Stap voor stap procedures <ol><li> Bereid 12-well plaat met meerdere oplossingen (voor elk oog vier putten nodig): <ol class="lalpha"><li> Voeg 10x antibiotica antimycotische oplossing - een goed / oog </li><li> Voeg PBS / HBSS oplossing voor het spoelen - 2 putten / oog </li><li> toe te voegen dispase oplossing - een goed / oog </li></ol></li><li> Bereid ontleden petrischaal met het uitpakken van 5 fixatie naalden en te vullen met HBSS </li><li> Pak ogen en plaats ze in antimycotische antibiotica-oplossing voor 3-5 min. (opgesteld in stap 1) </li><li> Ogen in twee putten (opgesteld in stap 1) met PBS / HBSS, dan ze naar ontleden schotel. </li><li> Trim veel spier-en bindweefsel rond de ogen </li><li> Met behulp van 27G naalden beveiligde (pin naar silicium basis) ogen in ontleden schaal afstemmen op een manier waar de cornea gezichten op. </li><li> Met behulp van SidePort mes maken incisie onder de cornea, waar de ronde cut zal beginnen </li><li> Met behulp van iris schaar maken snij je rond de ogen, vervolgens met behulp van dezelfde schaar snijden door glasvocht en til voorste deel van het oog. Opmerking: In stap 3 tot 8 voorkomen overmatige mechanische druk om oogbol. </li><li> Overdracht open oog in dispase-oplossing (bereid in stap 1) </li><li> Incubeer oogschelp voor 40-60 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2 </li><li> Vervang HBSS oplossing in ontleden schotel met verse een. </li><li> Transfer oog van dispase oplossing voor ontleden schotel. </li><li> Positie oog in petrischaal (oogbol cup naar boven) en zet met twee 27G naalden. </li><li> Voorzichtig lift gedeeltelijk gescheiden netvlies en het gebruik van het netvlies een schaar knippen netvlies uit de buurt van de oogzenuw. Gooi netvlies. </li><li> Met behulp van iris schaar maken een incisie van de periferie van het oog naar oogzenuw. </li><li> Met behulp van alle vijf de 27G naalden plat eye het maken van RPE laag netjes uitgerekt. </li><li> Met behulp van het netvlies schaar maken cirkelvormige snij je rond de oogzenuw scheiden RPE laag van gehechtheid aan de oogzenuw. Opmerking: de stappen 13-17 kan gedaan worden met een lage vergroting of zonder stereo microscoop </li><li> Stel stereomicroscoop naar 250x vergrotingof meer en vinden rand van de RPE vel dicht bij de oogzenuw langs de snede gemaakt door iris schaar. </li><li> Met behulp van twee aparte tang RPE-Bruch's membraan van de choroïdale weefsel laag. Het kan een paar pogingen om de buurt te vinden langs de rand waar de aansluiting van de RPE en choroidea het zwakst is. </li><li> Plaats RPE vellen in de koude trypsine-EDTA-oplossing in 15 ml buis </li><li> Nadat de RPE worden verzameld, cap en overdracht buizen met weefsels in trypsine-EDTA in het waterbad voor 10-15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na 10 minuten incubatie, schud krachtig 15 ml buizen aan RPE scheiden in kleine clusters. Als de scheiding niet compleet is, terug te plaatsen buizen in het water bad voor nog eens 5 minuten. </li><li> Controleer de buizen voor mogelijke niet-opgeloste gemengde cel clusters. Elke waargenomen clusters worden verwijderd met behulp van fijne getipt glas Pasteur pipet. </li><li> Spin down (1,4 rpm op klinische centrifuge voor 4 min.) hfRPE cellen te verwijderen supernatant en resuspendeer cellen in 15% RPE media (9 ml totaal) </li><li> Zet 3 ml celsuspensie in Primaria kolven voeg 2 ml vers 15% RPE media, plaatsen kolf in couveuse tot de volgende dag (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Representatieve resultaten Functionele validatie van hfRPE celkweek In eerdere experimenten hebben we gebruik gemaakt van deze primaire culturen om de uitdrukking, polarisatie en functie van plasma-membraan transport eiwitten te bepalen en specifieke signaalwegen die regelen RPE functie 1-11 Deze kenmerken te identificeren als ze zijn opgebouwd geven een validatie set eigenschappen die kunnen worden toegepast naar elke cel generatie. De experimenten hieronder samengevat identificeren van de eiwitten die transepitheliaal vloeistof transport en de integriteit van de paracellulaire pad te bepalen. Deze in vitro experimenten zijn gevalideerd in een diermodel van het netvlies opnieuw herbevestiging 6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Lokalisatie van de CFTR in hfRPE cellen Links bovenste paneel:. CFTR werd gedetecteerd in hfRPE cellen met behulp van membraan-verrijkte extracten. M, moleculair gewicht marker, baan 1, de grote rijpe (band C) en onvolwassen (banden A en B) Center onderste paneel: immunofluorescentie lokalisatie van CFTR (groen label) Top rechterkant van het scherm: vergrote doorsnede uitzicht door de Z-vlak zien.. een maximale intensiteit projectie door de z-as. ZO-1 (aangeduid als rood) fungeert als een tight junction marker afbakenen van apicale en basolaterale zijde van de RPE. DAPI (blauw) labels van de kernen dicht bij de basale membraan bevindt. ZO-1 verschijnt als geel / oranje, omdat de rode label overlappingen groene fluorescentie van CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. IFNy-geïnduceerde fysiologische veranderingen in hfRPE A:. Toevoeging van IFNy aan de basale bad toegenomen transepitheliaal vloeistof transport (J v) over monolayer van primaire, gekweekte cellen hfRPE J v is uitgezet als een functie van de tijd in de top-trace en de netto-vloeistof. absorptie (apicaal naar basaal bad) wordt aangegeven door positieve waarden; transepitheliaal potentieel (TEP) en de totale weefsel weerstand (R T) worden uitgezet als functie van de tijd in de bodem sporen. B: Toevoeging van CFTRinh-172 (5 uM) om de basale bad remde de IFNy gestimuleerde J v te verhogen. Hieronder is een voorbeeld van een diermodel experimenten bevestigen hfRPE in vitro bevindingen. In dit experiment werd kunstmatig gecreëerd netvliesloslating aanzienlijk verminderd na toevoeging van IFNg aan de buitenkant oogoppervlak (Figuur 4 A, B). Dit effect kan gedeeltelijk worden geblokkeerd door: (1) toevoeging van cAMP blokker (figuur 4D), (2) volledig geblokkeerd na toevoeging van JAK + cAMP-blokkers. Afbeeldingen hieronder zijn verkregen met behulp van oktober scanner. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. In vivo experimenten loslaten van het netvlies. De procedures voor deze in vivo experimenten zijn eerder in detail beschreven 6. In deze experimenten werden netvliesloslatingen gemaakt in rat oog door injectie van 0,5-3 pi van gemodificeerde PBS-oplossing in de subretinale ruimte (SRS), alleen of met een combinatie van JAK-STAT en PKA pad remmers. Elk experiment heeft een eerste controleperiode van 40-70 minuten na het aanmaken van de netvliesloslating. Gedurende deze tijd, was de mate van verandering van de blaar volume gemeten blaar stabiliteit te verzekeren. Optische coherentie tomografie beeldvorming (Instituut voor Toegepaste Fysica, Russische Academie van Wetenschappen, Nizhniy Novgorod, Rusland) werd gebruikt om het tijdsverloop van het volume te wijzigen in de SRS te meten. Het tijdsverloop van de re-attachment volume verandering werd gemeten door optische coherentie tomografie (OCT). Oktober beelden van vier verschillende experimenten (panelen aan de linkerkant, AD) dat een verandering in onthechting maten show (pijlen in A, B en D) na de toevoeging van IFNy op de voorste oppervlak voor 40-70 minuten. Panelen A en B laten zien dat IFNy Jv gestegen van haar controle-tarief (≈ 2 ui • 2 cm • hr -1) tot 14 en 12 ui • 2 cm • hr-1, respectievelijk. Na toevoeging van JAK-STAT pathway en PKA-remmers (C en D), de IFNy - geïnduceerde absorptie tarieven werden aanzienlijk verminderd tot 0,2 en 7,9 pl • 2 cm • hr-1, respectievelijk. Pijlen geven de grens van de blaar voor een vergelijking met het gebied binnen de stippellijn, (vanaf volume). Rechterzijde van figuur: top panel-overzicht van de gemeten Jv tarieven van een aantal experimenten, middelste paneel-film ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">klik hier</a> ), onderste paneel-3D delen van experiment samengevat in B. pseudocolor in blauw geeft aan ruimtelijke omvang van onthechting op t = 0 en 40 min na toevoeging van INFγ. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association for Research in Vision en Oogheelkunde verklaring. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de National Institutes of Health.

<ol><li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li>
<li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+184%3A+Phototransduction%3A+RPE+transport+Retina+Phototransduction%3A+RPE+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+the+Eye%22%5BJournal%5D)">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , Elsevier. 2540-2540 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+Building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li>
<li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+localization%2C+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+%28JAM-C%29+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%7Bgamma%7D+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-C+and+-D+induced+proliferation%2Fmigration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li>
<li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y%282%29+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li>
<li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204%2F211+alters+epithelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li>
<li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment%2C+migration%2C+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium%3A+relevance+for+proliferative+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li>
<li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling%2C+ion%2C+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li>
<li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%29-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li>
</ol>

In de huidige experimenten beschrijven we extra aanpassingen van onze eerder gepubliceerde technieken 3 ontworpen om de verschillende stappen die nodig zijn om een consistente hfRPE primaire culturen met een hoger aantal beschikbare cellen per oog te produceren stroomlijnen. Elke wijziging in de oorspronkelijke procedure is uitvoerig getest in meerdere fysiologie en moleculaire biologie experimenten om ervoor te zorgen dat de veranderingen geen artefacten te introduceren en wordt voortdurend getest door vele andere laboratoria met behulp van deze cellen. Ten slotte werden aanvullende experimenten uitgevoerd om de in vitro resultaten te vergelijken met soortgelijke verstoringen in diermodellen.

Instrumenten die nodig zijn voor de dissectie protocol <ol><li> Stereo Microscoop - alle beschikbare met het werken vergroting x250 die nodig is voor dissectie </li><li> Ontleden schaal - bijvoorbeeld Kimble 100 x 20mm # 23062 (een per dissectie) elke bron </li><li> Sylgard 184 - WPI Cat. # SYLG184 * * Ter voorbereiding op het ontleden van gerecht te volgen Sylgard 184 inclusief het mengen van instructies, giet gemengde vloeistof elastomeer in de petrischaal met 5-8mm laag te vormen. Laat elastomeer te genezen voor minstens 24 uur. Schaal met uitgeharde elastomeer kan worden gesteriliseerd met behulp van 70% ethanol en hergebruikt meerdere malen (~ 100 keer) </li><li> 27 G naalden van BD PrecissionGlide 1 ¼ lengte (vijf per dissectie) elke bron </li><li> HBSS 1X Oplossing bevattende Ca en Mg-zouten - GIBCO Cat # 14025 500ml (goed voor meerdere dissecties). </li><li> Iris schaar hardmetalen gekarteld lemmet, gebogen - FST Cat # 14.559-11 (een). </li><li> Retinale schaar - Katena Cat # K4-5300 (een). </li><li> Pincet - bijvoorbeeld Dumont Pincet # 5 met gepolijste tips van WPI Cat # 500085 (2 stuks). </li><li> SidePort mes - Alcon, manifeste 1mm, Dual Bevel, schuine Cat # 8065921540. </li><li> Centrifugebuis van 15 ml - (een per oog) elke bron </li><li> Pasteur glazen pipet - (een per dissectie) elke bron </li><li> Plaat 12 goed (een per dissectie) elke bron </li><li> Primaria 25cm 2 fles - (2-3 per oog) elke bron </li></ol>

experimentele modellen voor studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We hebben een celkweek procedure die kan produceren grote hoeveelheden samenvloeiende monolagen van primaire menselijke foetale retinale pigment epitheel (hfRPE) culturen met morfologische, fysiologische en genetische kenmerken van de inheemse mens RPE. Deze hfRPE celculturen vertonen zware pigmentatie en elektronenmicroscopie is uitgebreid apicale membraan microvilli. De junctional complexen werden geïdentificeerd met immunofluorescentie etikettering van diverse tight junction eiwitten. Epitheliale polariteit en de functie van deze gemakkelijk reproduceerbaar primaire culturen sterk lijken eerder bestudeerde zoogdieren modellen van inheemse RPE, inclusief de mens. Deze resultaten werden uitgebreid door de ontwikkeling van therapeutische interventies in verschillende diermodellen van het menselijk oog ziekte. Hebben we ons gericht op de strategieën voor het verwijderen van abnormale vochtophoping in het netvlies of subretinale ruimte. De extracellulaire subretinale ruimte scheidt de fotoreceptor buitenste segmenten en de apicale membraan van de RPE en is van cruciaal belang voor het onderhoud van het netvlies bijlagen en een hele reeks van RPE / netvlies interacties.

Wij bieden een reproduceerbare methode voor het kweken van samenvloeiing monolagen van de menselijke foetus retinale pigment epitheelcellen (hfRPE) cellen die vertonen morfologie, fysiologie, polariteit, en eiwit-en genexpressie-patronen van de volwassen autochtone weefsel. Dit werk is uitgebreid tot een diermodel van verschillende oogziekten.

Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

Wij hebben een kweekprocedure voor cellen ontwikkeld waarmee grote hoeveelheden convergente monolagen van primair menselijk foetaal retinaal pigmentepitheel kunnen worden geproduceerd ...

Het hoofddoel van deze procedure is het genereren van culturen van menselijk foetaal retinaal pigmentepitheel, of RPE, die als model kunnen worden gebruikt. Bij onderzoek naar menselijke oogziekten worden weefsels van donoren ontvangen in de vorm van intacte oogbollen. De eerste stap van de procedure is het wegsnijden van overtollig spier- en bindweefsel, om vervolgens het oog te openen door het hoornvlies en de lens te verwijderen.Het oog wordt behandeld met dispa en platgedrukt, waarna de RPE-monolaag van het vaatvlies wordt gepeld. De gedissecteerde RPE-cellen worden in flessen gezaaid en gedurende enkele weken gekweekt tot ze confluente monolagen vormen en pigment ontwikkelen. De celculturen worden gebruikt in in vitro functionele experimenten.Succesvolle in vitro-experimenten worden herhaald in preklinische diermodellen, waarbij RPE-responsen beter kunnen worden geëvalueerd in complexere signaleringsomgevingen. Het hier gedemonstreerde model zal leiden tot een beter begrip van de RPE-fysiologie en nieuwe therapeutische interventies voor de behandeling van oogziekten. Hallo, mijn naam is Sheldon Miller.Mijn laboratorium bevindt zich in het National Eye Institute, dat deel uitmaakt van de National Institutes of Health op de campus van Bethesda, Maryland. Hallo, ik ben Arki van het Miller Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het voorbereiden van primaire culturen van menselijke foetale retinale pigmentepitheelcellen.Deze cellen worden geprepareerd als confluente monolagen die kunnen worden gemonteerd in gemodificeerde sing chambers. We zullen deze geïsoleerde menselijke RPE-cellen ook gebruiken voor biochemische en genetische studies. We passen deze procedure in ons laboratorium toe om primaire culturen van epitheelcellen op te zetten om de functie en regulatie van fysiologische en pathofysiologische processen te bestuderen en klinische diermodellen voor ziekten te ontwikkelen.We richten ons op het retinaal pigmentepitheel of RPE, dat zich aan de achterzijde van het oog bevindt en de neurale retina scheidt van de bloedvoorziening van het choroidea. Dit schematische diagram van het oog toont de locatie van de RPE-laag aan de achterzijde van het oog, direct grenzend aan de fotoreceptoren. De inzet toont de cellen van de retina, met de fotoreceptoren aan de rechterkant en de ganglioncellen aan de linkerkant.Dit epitheel is metabolisch extreem actief. Het fagocyteert voortdurend fotoreceptoren op dagelijkse basis, en het slaat vitamine A, het visuele pigment, op, transporteert en verspreidt dit naar de fotoreceptoren. In de visuele cyclus werkt het homeostatisch om de chemische samenstelling en het volume van de omliggende extracellulaire ruimtes te handhaven.Een cruciale eigenschap van epitheel is de polariteit. De voortdurende asymmetrische levering van eiwitten naar de apicale en basolaterale membranen is een gereguleerd proces dat het epitheel in staat stelt om het vectoriële transport van metabolieten, ionen en vloeistof van de ene extracellulaire ruimte naar de andere te bewerkstelligen. Deze activiteit helpt het epitheel om de gezondheid en integriteit van het neurale retina te behouden.De in vitro preparatie die we hier beschrijven, maakt het mogelijk om transporteiwitten, receptoren en signaleringspaden te analyseren die de epitheliale polariteit en functie bepalen voordat de dissectie begint. Bereid een 12-wells plaat voor in een laminaire flowkast met oplossingen op kamertemperatuur. Voor elk oog is één well met 10 x antibioticum-antimycoticumoplossing nodig, twee wells met 1x PBS en één well met twee eenheden per milliliter disc space verdund in 5% RPE-medium met serum. Vul een met siliconen gevoerde dissectieschaal met 1x HBSS, giet de vloeistof af en breng elk oog over naar één well met antibioticum-antimycoticumoplossing.Incubeer drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Vermijd het uitoefenen van overmatige druk op de oogbol. Spoel het oog in twee opeenvolgende wells met XPBS om overtollig antibioticum te verwijderen.Gebruik vervolgens een pincet om het oog onder een dissectiestereomicroscoop over te brengen naar de dissectieschaal gevuld met één X-H-B-S-S. Gebruik irisscharen om overtollig spier- en bindweefsel rondom het oog te verwijderen. Positioneer het oog zodanig dat het hoornvlies naar boven is gericht.Gebruik twee steriele naalden van 27 gauge om het oog via het bindweefsel aan het siliconen kussen vast te pinnen zonder de sclera te beschadigen. Maak in deze positie met een zijpoortsmes een incisie door de sclera. De snede moet zich op een derde van de afstand tussen de equatoriaallijn van het oog en het voorvlak bevinden.Gebruik irisscharen om de incisie cirkelvormig rond het oog voort te zetten om beschadiging van het retinaal pigmentepitheel, afgekort RPE, door tractie van het glasachtig lichaam op de retina te voorkomen. Gebruik dezelfde scharen om door het glasachtig lichaam te knippen om de voorste oogflap van de oogkom te scheiden.Til het anterieure gedeelte van de IOA op en gooi dit weg. Gebruik een pincet om het geopende oog over te brengen naar de well met dys. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oogcup zitten.Incubeer gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 °C met 5% CO₂. Verplaats het oog vanuit de disruんte-ruimte terug naar de dissectieschaal, die is gevuld met verse 1X HBSS op kamertemperatuur. Positioneer het oog met de cup naar boven en zet het vast met twee naalden van 27 gauge.Til het gedeeltelijk gescheiden netvlies onder de dissectiemicroscoop voorzichtig op met een fijne pincet en een retinaschaar. Knip het netvlies los van de oogzenuw. Verwijder het netvlies met de irisschaar.Maak een incisie vanaf de periferie van het oog naar de oogzenuw. Zet het oog vast met 5 naalden van gauge 27. Om de RPE-laag uit te rekken, gebruikt u retinascharen om een cirkelvormige snede rond de oogzenuw te maken.Scheid de RPE-laag door over te schakelen naar een vergroting van 250x of meer. Zoek de rand van het RPE-vel langs de snede die met de irisschaar is gemaakt en dicht bij de oogzenuw. Gebruik twee paren pincetten om het RPE en het Bruchs-membraan van de choroidea-weefsellaag te scheiden.Probeer verschillende plaatsen langs de gesneden rand om te bepalen waar de verbinding tussen het RPE en het choroidea het zwakst is. Pel het membraan voorzichtig af om het volledig te verwijderen. Plaats de RPE-vellen in een conische buis van 15 milliliter gevuld met trips in EDTA op kamertemperatuur.Wanneer alle vellen zijn verzameld, sluit u de buis af en incubeert u de buizen 10 minuten in een waterbad bij 37 °C. Schud de buis krachtig om het RPE in kleine clusters te scheiden. De afwezigheid van donkere celklompen geeft aan dat de scheiding voltooid is.Plaats de buis nog eens vijf minuten terug in het waterbad. Gebruik een Pasteurpipet en voorzichtig opzuigen om alle onverteerde weefselresten te verwijderen. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 280 5G.Verwijder het supernatant. Vul het uiteindelijke volume aan tot negen milliliter met 15% RPE-medium en pipetteer om te resuspenderen. Pipetteer drie milliliter van de celsuspensie in een kolf van 25 vierkante centimeter.Voeg twee milliliters vers, op kamertemperatuur gebracht, 15% RPE-kweekmedium toe. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Naarmate de kweken rijpen, zal hun pigmentatie na drie tot vier weken toenemen.Succesvolle culturen zullen confluent zijn en een uniforme, intense pigmentatie vertonen. We hebben u zojuist laten zien hoe u primaire culturen van menselijk foetaal RP bereidt. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Dit protocol presenteert en beschrijft stappen voor de isolatie, dissectie, kweek en kleuring van retinale explantaten verkregen van een volwassen muis. Deze methode is gunstig als een ex vivo model voor het bestuderen van verschillende retinale neurovasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie.

Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een ex vivo model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten

We beschrijven een methode om retinaal pigmentepitheel (RPE) efficiënt te scheiden van het netvlies in menselijke ogen en hele RPE / choroïde flatmounts te genereren voor histologische en morfometrische analyses van de RPE.

Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

We beschrijven een eenvoudige en efficiënte methode voor het isoleren van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's. Deze procedure maakt follow-up moleculair biologisch onderzoek naar de geïsoleerde RPE mogelijk, inclusief genexpressieanalyses.

Isolatie van retinale pigmentepitheelcellen uit caviaogen

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Degeneratieve oogziekten die de retinale pigmentepitheellaag van het oog aantasten, hebben een monogene en polygene oorsprong. Verschillende ziektemodellen en een softwaretoepassing, LipidUNet, zijn ontwikkeld om ziektemechanismen te bestuderen, evenals mogelijke therapeutische interventies.

LipidUNet-Machine Learning-gebaseerde methode voor karakterisering en kwantificering van lipideafzettingen met behulp van iPSC-afgeleid retinaal pigmentepitheel

Dit protocol schetst de procedure voor het verkrijgen en kweken van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) uit lokaal geproduceerde varkensogen. Deze cellen dienen als hoogwaardig alternatief voor stamcellen en zijn geschikt voor in vitro netvliesonderzoek.

Isolatie van primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens voor in vitro modellering

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Verken een reproduceerbare methode voor het kweken van humane foetale retinale pigmentepitheelcellen die volwassen weefseleigenschappen nabootsen. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar oogziekten en therapeutische interventies.

Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

Meer video's verkennen