Name: Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe je menselijke embryonale stamcellen in vivo differentieert via teratoomvorming onder de nierkapsel van een immuungecompromitteerde muis. Deze methode volgt het lot van genetisch gemarkeerde cellen gedurende 8 tot 12 weken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een uitgebreid onderzoek Grant van het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RC1-00104), een Public Health Service Grant (HL085377) van NHLBI, en een geschenk van de Pollin Stichting HSB

De schriftelijke protocol hieronder is gebaseerd op gepubliceerde parameters gerapporteerd door de auteurs, met enkele wijzigingen. Het protocol wordt uitgevoerd met toestemming van de UCSF Institutional Animal Care en gebruik (IACUC) en Stem Cell Research Oversight (SCRO) comites. I. Cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) <ol><li> Groeien hESC 's in standaard 6-well (3,5 cm diameter putten) platen. </li><li> Tenminste 12 uur voorafgaand aan de passage cellen, zaad muis embryonale fibroblasten (MEF, verkregen uit CF1 dag e12.5 timed-gekoppeld muizen, bestraald op 1000 Ci) feeder-cellen op platen bekleed met 1% gelatine (6,7). MEF moet worden uitgeplaat op 50-60% confluentie, of 4 x 10 5 cellen per 3,5 cm diameter goed (figuur 1). </li><li> Passage-cellen wanneer kolonies hebben ~ 70% confluentie (figuur 2) bereikt. </li><li> Om de passage van de cellen, aspireer KSR groeimedium (6) van de putten en te vervangen door 0,5 ml medium dat Collagenase IV in KSR bij een concentratie van 1 mg / ml. </li><li> Incubeer de platen met Collagenase IV bij 37 ° C / 5% CO 2 gedurende 5 minuten of tot de randen van kolonies beginnen op te heffen van de plaat. </li><li> Verwijderen Collagenase IV van de plaat, voeg 0,5 ml van KSR aan elk putje, en handmatig schraap cellen volledig te verwijderen van de plaat. </li><li> Verzamel de celsuspensie uit elk putje, plaats in een 15 ml conische buis, en laat cellen door de zwaartekracht rusten gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de tube, waardoor de cellen en medium in een totaal volume van ~ 300μl. </li><li> Met behulp van een 200 ul micro-pipet ingesteld op vol volume, voorzichtig pipet de celsuspensie 5-6 keer te breken de koloniën. </li><li> Breng de celsuspensie tot een totaal volume van 9 ml per originele bron van cellen met behulp van KSR medium (dat wil zeggen, als een goed wordt geoogst, de buis moet 9 ml bevatten). Aanvulling op het medium met recombinant humaan basic fibroblast groeifactor (bFGF) tot een concentratie van 12,5 ng / ml. </li><li> Na het wassen van de nieuwe putten met MEF-cellen (zie stap 2) met fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (DPBS) om alle serum te verwijderen, 3 ml van de celsuspensie toe te voegen aan elk putje en de platen incubeer bij 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Verandering KSR medium met bFGF 24 uur na de passage, en iedere 24-48 uur totdat cellen zijn klaar om opnieuw te worden gepasseerd. </li></ol> II. De voorbereiding van hESC pellet voor transplantatie <ol><li> Na 24 uur voor het enten, voeg ROCK-remmer aan de KSR medium tot een uiteindelijke concentratie van 10μM levensvatbaarheid van de cellen (8) te verhogen. Een bron van cellen op ~ 70% confluentie (5 x 10 5 cellen) zal leiden tot twee korrels, met twee pellets ingebracht per nier capsule. </li><li> Ter voorbereiding celpellets voor het enten (9), incubeer de ROCK-remmer behandelde culturen met Collagenase IV gedurende 5 minuten bij 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Zuig het Collagenase IV uit de put en te vervangen door 1 ml DPBS met 10% penicilline / streptomycine (pen / strep). </li><li> Handmatig de koloniën schrapen van de plaat, spoel het goed met een extra 1 ml DPBS met pen / STREP, en breng elke 1 ml aliquot van celsuspensie om een ​​1,5 ml microfugebuis. </li><li> Kort Spin microfuge buizen op 8000 x g, zuig het supernatant en resuspendeer de pellets in 500μl DPBS met pen / strep. </li><li> Om u te helpen bij elkaar te binden de cellen voor transplantatie, voeg 100μl 1 mg / ml Phaseolus vulgaris lectine (PHA) in DPBS aan elke buis. </li><li> Incubeer de cel / PHA schorsing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en draai gedurende 2 minuten bij 8000 x g. Draai de buizen 180 ° binnen hun rotor putten en spin nogmaals gedurende 2 minuten bij 8000 x g. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans het verlaten van de pellet intact. </li><li> Verjagen de cel pellets uit de buizen door zachtjes te pipetteren 200μl KSR naast de rand van de pellet totdat het langzaam verheft. </li><li> Eenmaal verdreven, onmiddellijk overdracht van de pellets aan 0.4μm MILLICELL inserts geplaatst in 3,5 cm diameter putjes die 3 ml KSR, en incubeer gedurende 2 uur om 's nachts bij 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> III. Nier-capsule enten <ol><li> Voer alle dierlijke procedures in overeenstemming met de institutionele richtlijnen met geschikte aseptische techniek. </li><li> Verdoven SCID beige muizen (CB17.Cg-Prkdc SCID Lyst bg / CRL), in de leeftijd 8-12 weken, met behulp van een combinatie van inhalatiecorticosteroïden 3% isoflurane/0.5% O2 en intraperitoneale tribroomethanol (Avertin, 25 mg / kg vers bereid). Twee celpellets per muis zal worden geënt met beschreven technieken (10). </li><li> Na het plaatsen van de muis op een verwarmingselement om onderkoeling te voorkomen, de incisie gebied scheren, daarna desinfecteren met chloorhexidine. Maak een 2.5 cm incisie door de huid net uit het midden, maar parallel aan de wervelkolom. </li><li> Het houden van de incisie gebied vochtig met steriel Saline, maak een kleinere incisie door de spier, net onder de ribben en ~ 1 cm van de wervelkolom. De incisie moet net groot genoeg zijn om de nieren te trekken door, maar klein genoeg dat de nier niet zal terug glijden in de buikholte, zonder kracht. </li><li> Trek de nier door de spier incisie met een glazen pipet Pasteur die is getrokken in de vorm van een stompe, licht gebogen haak. </li><li> Nat de nier met steriele DPBS om de capsule niet uitdrogen. Dit kan nodig zijn om te herhalen gedurende de hele procedure, omdat de capsule is zeer fragiel. </li><li> Met behulp van Dumont # 5 tang, trekt u de capsule op van de nieren en maak een 2 mm incisie met behulp van Vannas voorjaar schaar. </li><li> Met een andere glazen pipet die is getrokken in een zeer fijne, afgestompte sonde, maak een klein zakje tussen de capsule en de nieren. </li><li> Met behulp van een grote opening pipetpunt geplaatst op een wegwerp overdracht Pipetteer een enkele cel pellet van de MILLICELL te voegen. Zorg ervoor dat u zo weinig extra media mee te nemen als mogelijk, omdat teveel media kunnen interfereren met de pellet transfer. </li><li> Terwijl de rand van de incisie aan de zak te creëren, plaats voorzichtig het pellet naast de opening en duw hem in de zak in de richting van een pool van de nier met de pipet getrokken. </li><li> Herhaal dit proces met een tweede pellet. Plaats dit onder de capsule van de dezelfde nier, maar de richting van de tegenovergestelde pool. </li><li> Plaats voorzichtig de capsule terug naar de pellets. De pellets moeten blijven binnen de pocket, en er geen hechtingen nodig zijn om de capsule te sluiten. </li><li> Voorzichtig terug te duwen de nier in de buikholte en sluit de spier muur met 4-0 zijde hechtingen (of kleiner) met daaraan reverse-cutting naald. De incisie moet klein genoeg dat slechts een enkele hechting nodig is. </li><li> Sluit de huid met een reeks van 4-5 onderbroken steken, met dezelfde hechtmateriaal. </li><li> Voor het plaatsen van de muis terug in zijn kooi, toedienen 0,05 mg / kg buprenorfine (11,12) en 5 mg / kg ketoprofen (12,13) ​​als op korte termijn en lange termijn analgetica, respectievelijk. Gereguleerde stoffen mag alleen worden gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. </li><li> Zet het dier zijn kooi en laat het herstellen van narcose op een verwarmingselement. Dit duurt ongeveer 20-30 minuten. </li><li> Zodra de muis volledig ambulant is, kan het worden teruggestuurd naar de stallen faciliteit. </li></ol> IV. Teratoma oogst, fixatie en snijden <ol><li> Op 8-12 weken na de operatie, moet er een nauwelijks voelbaar teratoom de buurt van de nier. Grote, met vloeistof gevulde cysten zal vaak te ontwikkelen en, te beginnen bij 6-8 weken. Deze kan het nodig een eerdere oogst als ze leed veroorzaken voor het dier. Sinds teratomen groeien langzamer dan cysten, maar wil je zo lang mogelijk wachten om een teratoom van voldoende grootte voor analyse (dat wil zeggen, ten minste 8 weken) te verkrijgen. </li><li> Verwijder de nieren, teratoom, en alle omringende cysten als een blok van weefsel uit de buikholte met behulp van dezelfde chirurgische benadering waarbij de nier oorspronkelijk was benaderd (zie hoofdstuk III, de stappen 1-4 hierboven). </li><li> Plaats het hele blok van weggesneden weefsel in een buisje met 10% formaline gebufferd. </li><li> Laat de teratoma een nacht vast te stellen op 4 ° C. </li><li> De volgende dag, verwijder de teratoom van de buis. Ontleden weg te werken en zo veel cysten nieren mogelijk zonder beschadiging van de teratoma zelf (figuur 3). Grotere teratomen kan worden gesneden in de helft tot dissectie en verankering te vergemakkelijken. </li><li> Verwerk de teratoma behulp van een standaard paraffine-fixatie techniek. Geautomatiseerde units zijn beschikbaar (bijvoorbeeld Shandon Hypercenter): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% Flex alcohol </td><td> 2 uur </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% Flex alcohol </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% Flex alcohol </td><td> 1,5 uur </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% Flex alcohol </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% Flex alcohol </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% Flex alcohol </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% Flex alcohol </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Paraffine (TissuePrep) </td><td> 2 uur </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Paraffine (TissuePrep) </td><td> 2 uur </td></tr></tbody></table></li></ol> V. Immunohistochemie en analyse <ol><li> Eenmaal ingebed in paraffine, sectie teratoom in 5 urn seriële plakjes met behulp van een roterende microtoom, en zweven secties op dia's. </li><li> Voor de kleuring, bak de dia's voor ten minste een uur. </li><li> Vlekken op de dia's met hematoxyline en eosine met behulp van standaard methoden om weefsel structuren vertegenwoordiger van elk van de drie embryonale kiemlagen (figuur 4) te identificeren: <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Xyleen wassen </td><td> 3-5 minuten </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xyleen </td><td> 3-5 minuten </td></tr><tr><td> III. </td><td> 100% alcohol </td><td> 3-5 minuten </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 100% alcohol </td><td> 3-5 minuten </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% alcohol </td><td> 3-5 minuten </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% alcohol </td><td> 3-5 minuten </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Water wassen (diverse wijzigingen) </td><td> 2 minuten </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Gill's Hematoxylin # 3 </td><td> 2-5 minuten </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Water wassen (diverse wijzigingen) </td><td> tot het water helder </td></tr><tr><td> X. </td><td> Scott's water (naar blauw kernen) </td><td> 3 minuten of meer </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Water wassen (diverse wijzigingen) </td><td> 1-2 minuten </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosine Y </td><td> 1 minuut </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Water wassen (diverse wijzigingen) </td><td> 30 seconden </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% alcohol </td><td> 1 minuut </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% alcohol </td><td> 2 minuten </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% alcohol </td><td> 2 minuten </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> 100% alcohol </td><td> 3 minuten </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% alcohol (schoon) </td><td> 3 minuten </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xyleen </td><td> 2 minuten of meer </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xyleen </td><td> 2 minuten of meer </td></tr></tbody></table></li><li> Monteer een dekglaasje op elke dia met Permount. </li></ol> VI. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Plating van bestraalde CF1 muis embryonale fibroblasten als een feeder-laag voor het kweken van ongedifferentieerde hESC 's. MEFs zijn verguld op ~ 50% confluentie, zoals hier getoond, of 4 x 10 5 cellen per 3,5 cm diameter goed in een 6-well cultuur schotel. Bar, 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeeld van subconfluent cultuur van ongedifferentieerde hESC 's op een MEF feeder-laag. HESC' s worden geteeld op MEF feeder lagen tot ~ 70% confluent, zoals hier, dan passage zoals beschreven. Bar, 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voorbeeld van geëxplanteerde teratomen. Na explantatie, de teratoma, nier, en een accessoire weefsel worden vastgesteld als een blok in formaline, dan is de nier en accessoires weefsel worden zorgvuldig weggesneden voordat inbedding in paraffine. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Teratomen afgeleid van ongedifferentieerde hESC 's bevatten weefsels representatief is voor alle drie de kiembladen in vivo. A teratoma, zoals een afgebeeld in figuur 3, werd in secties en gekleurd met hematoxyline en eosine om embryonale weefsels te identificeren. hESC 's aanleiding geven tot weefsels die van alle drie de embryonale kiembladen (ectoderm (A, B), mesoderm (C), endoderm (D). (A) Nascent neurale buis structuur. (B) Primitive plaveiselepitheel. (C) Kraakbeen, omgeven door kapsel van gecondenseerde mesenchym. (D) klieren intestinale structuur. Bar, 100 urn. Afbeeldingen herdrukt met toestemming van de auteur. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Teratoom analyse kan worden gebruikt om het lot van de gelabelde, ongedifferentieerde hESC 's kaart. Zoals al eerder gepubliceerd (9), een mengsel van specifiek gelabeld hESC' s met gecodeerde hESC 's kunnen gebruikt worden om het lot van de gelabelde cellen in een teratoom formatie assay kaart. Zoals hier afgebeeld, waren ongedifferentieerde hESC 's uiting van de oppervlakte marker, CD133, en gelabeld met verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP), gemengd met niet-gecodeerde, ongedifferentieerde hESC' s. Deze werden gebruikt om teratomen formulier door renale capsule enten. Immunohistochemische analyse van hematoxyline en eosine gekleurd teratoom secties met anti-eGFP antilichaam toont de neuro-ectodermale lot van de CD133 + hESC 's. Teratomen werden verwerkt zoals in figuur 4 en tegengekleurd met anti-eGFP antilichaam (bruin) te lokaliseren derivaten van CD133 + GFP + cellen in weefsels. CD133 +-afgeleide cellen (pijlen) werden waargenomen in de weefsels die voortkomen uit embryonale ectoderm, in het bijzonder neurale epitheel (links) en ontluikende neurale buis-achtige structuren (rechts). Bar, 100 urn. Afbeeldingen herdrukt met toestemming van de auteur. Gelatine <ul><li> 0,1% Porcine gelatine </li><li> 99,9% DPBS <ul><li> Voeg gelatine aan DPBS, incuberen bij 37 ° C gedurende een uur of totdat alle gelatine in oplossing gaat, en het filter steriliseren (0.22μm) voor gebruik. </li></ul></li></ul> MEF medium <ul><li> 10% foetaal runderserum (Qualified) </li><li> 90% Dulbecco's Modified Essential Medium (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Filter steriliseren voor gebruik. </li></ul></li></ul> KSR (Knockout Serum Replacement) medium <ul><li> 20% KnockOut Serum Vervanging </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x niet-essentiële aminozuren </li><li> 0,1 mM β-mercapto-ethanol / </li><li> 12,5 ng / ml bFGF <ul><li> Filter steriliseren. </li><li> Bewaren bij 4 ° C, maar warm tot 37 ° C voor het toevoegen aan cellen. </li><li> Voeg bFGF onmiddellijk voor gebruik. </li></ul></li></ul> Collagenase IV <ul><li> Los 1 mg / ml in KSR medium door het plaatsen bij 37 ° C gedurende 1-2 uur of totdat alle poeder in oplossing gaat. </li><li> Filter steriliseren. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-tribroomethanol </li><li> 0,25 ml 2-methyl-2-butanol <ul><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht op 100% oplossing te vormen. </li><li> Enkele uren voor de operatie, verdund tot 2,5% werkende oplossing met behulp van DPBS en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur. </li><li> Filter steriliseren en aliquot deel. </li><li> Tribroomethanol is zeer licht-gevoelig, dus bescherming tegen licht in alle stadia van bereiding en het gebruik. </li><li> Bereid niet meer dan 12-24 uur voor gebruik. </li></ul></li></ul> Buprenorfine <ul><li> 1 mg / ml stockoplossing in methanol <ul><li> Verdun tot 0,015 mg / ml werkoplossing met behulp van steriele H 2 O. </li><li> Bewaren bij -20 ° C tot 1 maand. </li></ul></li></ul> Ketoprofen <ul><li> 0,5 mg / ml werkoplossing in DPBS <ul><li> Voeg DPBS, 's nachts bij 37 ° C incubeer gedurende 1-2 uur of totdat alle poeder in oplossing gaat. </li><li> Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. </li></ul></li></ul>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li>
<li>Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases.</a> J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).</li>
<li>Safinia, N., Minger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).</li>
<li>Nury, D., Neri, T., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac cell fate.</a> J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).</li>
<li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li>
<li>Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 2, 455-463 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+human+embryonic+stem+cells+with+distinct+tissue-specific+fates+can+be+selected+from+pluripotent+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures.</a> Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+in+primordial+gland+structures+which+become+responsive+to+androgenic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation.</a> Anat Rec. 172, 179-195 (1972).</li>
<li>Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+evaluation+and+response+to+buprenorphine+in+rats+subjected+to+sham+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion.</a> Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).</li>
<li>Lee-Parritz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analgesia+for+rodent+experimental+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Isr+J+Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Analgesia for rodent experimental surgery.</a> Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).</li>
<li>Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+pharmacological+and+toxicological+studies+on+ketoprofen%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen.</a> Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).</li>
</ol>

We hebben zich aangepast een zeer efficiënte teratoom formatie test voor het doel in kaart brengen van het lot van differentiatie hESC &#39;s in een in vivo omgeving. Een klein aantal speciaal geselecteerde hESC &#39;s wordt gemengd met ongedifferentieerde wild type hESC&#39; s en Phaseolus vulgaris lectine in een cel pellet te vormen. Dit is geënt onder de nier capsule in een immunodeficiënte muis. Het lot van de oorspronkelijk geselecteerde hESC &#39;s kan dan worden bepaald door immunohistochemie (figuur 5), zoals eerder gerapporteerd (9). Deze methode biedt een waardevol instrument voor het identificeren en het genereren van weefsel-specifieke reagentia voor cel-gebaseerde therapie.

<table><tbody><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>4-0 zijden hechtdraad</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dupont #5 pincet</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Nierkapsel</td></tr><tr><td>Eosine Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (gekwalificeerd)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Flex alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Gill&amp;rsquo;s hematoxyline #3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat, recht</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Algemene chirurgie</td></tr><tr><td>Iris-pincet</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Algemene chirurgie</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut serumvervanger</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>MILLICELL inserts</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Operatieschaar</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Algemene chirurgie</td></tr><tr><td>Paraffine (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Varkensgelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-inhibitor</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>SCID beige muizen</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Wash</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>Vannas-veerscharen</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Nierkapsel</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom formation

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) hebben een onbeperkte capaciteit voor zelf-vernieuwing, en de mogelijkheid om te differentiëren in cellen, afkomstig van alle drie de embryonale kiembladen (1). Geregisseerd differentiatie van hESC &#39;s in specifieke celtypen heeft gegenereerd veel belangstelling op het gebied van regeneratieve geneeskunde (bv., (2-5)), en methoden voor het bepalen van de<em&gt; In vivo</em&gt; Lot van geselecteerd of gemanipuleerd hESC &#39;s zijn essentieel voor dit streven. We hebben zich aangepast een zeer efficiënte teratoom formatie test voor dit doel. Een klein aantal speciaal geselecteerde hESC &#39;s wordt gemengd met ongedifferentieerde wild type hESC&#39; s en Phaseolus vulgaris lectine in een cel pellet te vormen. Dit is geënt onder de nier capsule in een immunodeficiënte muis. Zo weinig als 2,5 x 10<sup&gt; 5</sup&gt; HESC &#39;s zijn nodig om een ​​16 cm vorm<sup&gt; 3</sup&gt; Teratoom binnen 8-12 weken. Het lot van de oorspronkelijk geselecteerde hESC &#39;s kan dan worden bepaald door immunohistochemie. Deze methode biedt een waardevol instrument voor het karakteriseren van weefsel-specifieke reagentia voor cel-gebaseerde therapie.

Geregisseerd differentiatie van hESC &#39;s in de specifieke cellen heeft gegenereerd veel belangstelling voor regeneratieve geneeskunde. Wij bieden een beknopte, stap-voor-stap protocol voor het bepalen van de<em&gt; In vivo</em&gt; Lot van geselecteerde hESC &#39;s die een waardevol instrument voor het karakteriseren van weefsel-specifieke reagentia voor cel-gebaseerde therapie biedt.

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) hebben een onbeperkt vermogen tot zelfvernieuwing en de capaciteit om te differentiëren in cellen afgeleid van alle drie de ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane embryonale stamcellen in vivo te differentiëren en hun weefselspecifieke lot te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst een pellet te vormen van genetisch gemarkeerde cellen van belang. De tweede stap van de procedure is het chirurgisch plaatsen van de pellet onder het nierkapsel van een immuungecompromitteerde muis.De derde stap van de procedure is om het celpellet acht tot 12 weken te laten differentiëren onder het kapsel van de muiernier. De laatste stap van de procedure is het oogsten van het resulterende teratoom, het fixeren in formaline en het analyseren van het lot van de gemerkte cellen via immunohistochemie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat de gemerkte cellen zich ontwikkelen tot één of meer van de drie kiembladlagen door middel van histologie en immunohistochemie van de resulterende teratomen.Hallo, ik ben Carissa Ritner van het laboratorium van Dr. Harold Bernstein in het Cardiovascular Research Institute aan de University of California in San Francisco. Vandaag laten we u een procedure zien voor het ontwikkelen van teratomen via transplantatie in het nierkapsel. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de differentiatie van embryonale stamcellen te bestuderen, zowel om er zeker van te zijn dat elke lijn waarmee we werken zich kan ontwikkelen tot elk van de drie kiembladen, als om het lot van genetisch gemarkeerde stamcellen in vivo te volgen.Alle procedures die we zullen tonen zijn uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de UCSF. Daarnaast is al het werk met menselijke embryonale stamcellen uitgevoerd met goedkeuring van de Stem Cell Research Oversight Committee van de UCSF. Laten we beginnen.Raadpleeg voor het voorbereiden van menselijke embryonale stamcelculturen het tekstgedeelte van dit protocol. Voor handelingen in een laminaire flowkast: behandel de met ROCK-inhibitor behandelde menselijke embryonale stamcelculturen met 1 mg/mL collagenase IV, incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C en 5% CO2, en aspireer vervolgens de collagenase IV uit de well. Vervang dit door 1 mL DPBS op kamertemperatuur, aangevuld met 10% penicilline-streptomycine.Gebruik een platte celkrasper om de kolonies van de plaat te schrapen en breng 0,5 milliliters van de celsuspensie over naar elk van de twee microcentrifugebuisjes. Spoel het wel uit met één milliliter DPBS en breng 0,5 milliliters van het spoelmiddel over naar elk buisje. Centrifugeer de buisjes 20 seconden bij 8,000 ×g, aspireer het supernatant en resuspendeer elk pellet in 500 µL verse DPBS bij 100 µL van één mg/mL.Voeg Fasi vulgaris lectine in DPBS toe aan elke buis om de cellen te helpen binden voor transplantatie. Incubeer de celsuspensie vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de cellen 2 minuten bij 8.000 ×g om de pellet te egaliseren.Draai de buisjes 180 graden binnen hun rotorhouders. Centrifugeer vervolgens opnieuw bij 8 000 ×g gedurende twee minuten.Aspire zorgvuldig het SUP nasin, waarbij de pellets intact blijven om de pellets los te maken uit de buis. Pipetteer voorzichtig 200 microliters KSR medium naast de rand van de pellet tot deze langzaam omhoog komt. Zodra de pellet is losgekomen, trek je het medium onmiddellijk in een 0,4 micrometer milli cell.Voeg in een well drie milliliter KSR.Medium toe. Incubeer gedurende twee uur tot overnacht bij 37 °C en 5% CO2. Plaats een geanestheseerde immuundeficiënte muis op een warmtemat om hypothermie te voorkomen.Gebruik een operatieschaar en irispincetten om een incisie van 2,5 centimeter door de huid te maken, parallel aan de wervelkolom, maar net buiten het midden. Maak een kleinere incisie door de spier net onder de ribben en ongeveer één centimeter van de wervelkolom.De incisie moet groot genoeg zijn om de nier doorheen te trekken, maar klein genoeg zodat de nier zonder kracht niet terug in de buikholte glijdt. Trek de nier voorzichtig door de spierincisie met een pastapipet die in de vorm van een stompe haak is getrokken. Bevochtig de nier periodiek met steriele DPBS met een fijne pincet om te voorkomen datHet fragiele kapsel uitdroogt.Trek het kapsel voorzichtig weg van de nier. Gebruik Venice Spring Scissors om een incisie van twee millimeter in het kapsel te maken. Steek in het centrum van de nier een pasta-pipet, die is uitgetrokken tot een zeer fijne stompe probe, tussen het kapsel en de nier en wiebel voorzichtig om een klein zakje te maken; herhaal dit aan de andere kant van de nier, zodat er twee zakjes zijn.Eén op elke pool van de nier. Gebruik een pipetpunt met een grote opening op een wegwerptransferpipet. Til hiermee een enkel pellet uit de milli cell-insert.Neem zo weinig mogelijk medium, aangezien overtollig medium de overdracht van het pellet kan bemoeilijken. Gebruik een pincet om de rand van de pocket in de nier omhoog te houden. Plaats het pellet voorzichtig naast de opening en gebruik de uitgetrokken pipetpunt om het in de pocket richting één pool van de nier te duwen.Plaats een tweede pellet in de pocket richting de tegenovergestelde pool. Plaats de capsule voorzichtig terug over de pellets. Er zijn geen hechtingen nodig om de capsule te sluiten.Gebruik een gebogen pipette om de nier voorzichtig terug in de buikholte te duwen. De spiersnede moet klein genoeg zijn om met een enkele zijden hechting te worden gesloten. Sluit de huid met een serie van vier tot vijf onderbroken hechtingen en laat het dier herstellen van de operatie voordat het acht tot 12 weken na de ingreep wordt teruggebracht naar de dierfaciliteit.Verwijder het nieteratoom en eventuele omliggende cysten als een enkel weefselblok uit de buikholte. Plaats het gehele blok uitgesneden weefsel in een polypropylene buis van 50 milliliter met 10% gebufferde formaline. Laat het teratoom een nacht fixeren bij vier graden Celsius.Verwijder het teratoom uit de buis en plaats het op een onderlegger. Gebruik een scalpel om eventuele cysten en zoveel mogelijk nierweefsel weg te snijden zonder het teratoom zelf te beschadigen. Grotere teratomen kunnen in tweeën worden gesneden om de dissectie en het inkapselen te vergemakkelijken.Verwerk het teratoom met de standaard paraffinefixatietechniek en kleur en monteer coupes op objectglazen voor analyse en beeldvorming. Raadpleeg de opmerkingen in het tekstgedeelte van het protocol voor details. Hier tonen we weefselcoupes van een typisch teratoom.Dit teratoom is gekleurd met hematoxyline en eosine om embryonale weefsels te identificeren, representatief voor alle drie de kiemblaadjes, en vertoont een beginnende neurale buisstructuur die representatief is voor vector derm. Deze sectie biedt een ander voorbeeld van vector derm, in dit geval primitief plaveiselpitheel. Hier vertegenwoordigt kraakbeen, omringd door een kapsel van gecondenseerd mesenchym, weefsels afgeleid van het embryonale mesoderm.Ten slotte demonstreert deze sectie, die een klierachtige darmstructuur laat zien, endodermaal weefsel binnen het teratoom. Om het lot van genetisch gemarkeerde stamcellen in kaart te brengen, werden de teratomen gezaaid met een mengsel van wild-type en CD 1 33 positieve menselijke embryonale stamcellen. De afgeleide CD 1 33 positieve cellen, aangegeven door de pijlen, werden waargenomen in weefsels afkomstig van de embryonale ectoderm, specifiek in neuro-epitheel en beginnende neurale buisachtige structuren. Ik ben Dr. Harold Bernstein.Carissa heeft zojuist gedemonstreerd hoe teratomen kunnen worden gevormd uit menselijke embryonale stamcelculturen om een in vivo ontwikkelingsassay te verkrijgen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met de cellen en strikt vast te houden aan de aseptische techniek. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

fate-mapping-of-human-embryonic-stem-cells-by-teratoma-formation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebravis celtransplantatie maakt de combinatie van genetica en embryologie aan het weefsel specifieke hersenschimmen te genereren. Deze video toont gastrula geënsceneerde cel transplantaties die hebben onze lab naar de rol van astroglial bevolking en de specifieke begeleiding signalen tijdens commissuur vorming in de voorhersenen te onderzoeken.

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Genetische Induceerbare Fate Mapping (GIFM) merken en tracks cellen met fijne ruimtelijke en temporele...

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben het potentieel om een ​​groot aantal verschillende ziekten te behandelen. Het nut van deze cellen gelegen in het feit dat ze differentiëren naar elk celtype in het lichaam. Hier beschrijven teratoma assay, welke wordt gebruikt om de pluripotence van hPSCs tonen.

Teratoom Generation in de testis Capsule

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

In deze studie presenteren we een in vitro celtest voor het identificeren van teratogene chemicaliën. De dynamiek van fibroblastgroeifactor (FGF)/serumresponsfactor (SRF)-signalering werd gemeten in door mensen geïnduceerde pluripotente stam (iPS) reportercellen, en het risico op teratogeniciteit werd geëvalueerd door chemische verstoring van deze signaalroute te kwantificeren.<br...

Ontwikkelingstoxiciteitstest op basis van real-time monitoring van signaalverstoring van de groeifactor van fibroblasten in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Leer hoe je menselijke embryonale stamcellen in vivo differentieert via teratoomvorming onder de nierkapsel van een immuungecompromitteerde muis. Deze methode volgt het lot van genetisch gemarkeerde cellen gedurende 8 tot 12 weken.

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Meer video's verkennen