Name: Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer een primer-vrije methode voor aptameerselectie die specifiek bindt aan S100B-eiwit uit een willekeurige DNA-bibliotheek. Dit protocol optimaliseert SELEX door interferentie van vaste primersequenties te elimineren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Craig Paul op de Core Microarray faciliteit voor zijn hulp. Dit werk werd ondersteund door NIH / NCI subsidie ​​# CA118591 van de IMAT Program. SLD erkent ook een Pennsylvania Space Grant Consortium Fellowship voor financiële steun. Deze publicatie werd ook gesteund door de Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabrication Network en de National Science Foundation Cooperative arbeidsovereenkomst nr. 0335765, National Nanotechnology Infrastructure Network, met Cornell University.

<ol><li>Kulbachinskiy, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+selection+of+aptamers+to+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Methods for selection of aptamers to protein targets.</a> Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).</li>
<li>Mairal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+molecular+tools+for+analytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: molecular tools for analytical applications.</a> Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+--+A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolec+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).</li>
<li>Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers.</a> Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).</li>
<li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).</li>
<li>Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Escherichia+coli+RNA+with+bacteriophage+MS2+coat+protein%3A+genomic+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).</li>
<li>Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+using+a+dual+RNA+library+that+allows+primerless+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection.</a> Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).</li>
<li>Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bioactive+Spiegelmers+to+migraine-associated+calcitonin+gene-related+peptide+rapidly+identified+by+a+novel+approach%3A+tailored-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).</li>
<li>Wen, J. D., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+genomic+sequences+that+bind+tightly+to+Ff+gene+5+protein%3A+primer-free+genomic+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).</li>
<li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).</li>
<li>Pan, W. H., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-free+aptamer+selection+using+a+random+DNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer-free aptamer selection using a random DNA library.</a> Methods Mol Biol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal-Primer+and+Primer-Free+SELEX+Protocols+for+Selection+of+Aptamers+from+Random+DNA+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries.</a> BioTechniques. 44, 351-360 (2008).</li>
<li>Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrometer+metallic+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Submicrometer metallic barcodes.</a> Science. 294, 137-141 (2001).</li>
<li>JC, H. ulteen, CR, M. artin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+template-based+method+for+the+preparation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Materials+Chem%22%5BJournal%5D)">A general template-based method for the preparation of nanomaterials.</a> J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotMaster TAQ DNA-polymerase</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP-mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE-buffer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA-marker</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restrictie-enzymen</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ureum</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotografische film</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose-beads</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleenkolom</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detroit-551 cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SK-MEL-31 cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-ligase</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sp6 RNA-polymerase</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije DNase I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-remmer</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiScript reverse transcriptase</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCR-2.1-TOPO vector</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; competente cellen</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotidekinase</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primer-free aptameer selection behulp van een random dna-bibliotheek

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptameren zijn zeer gestructureerd oligonucleotiden (DNA of RNA) die kunnen binden aan doelstellingen met affiniteit die vergelijkbaar zijn met antilichamen 1. Ze zijn geïdentificeerd door middel van een in vitro selectie proces genaamd Systematische Evolutie van de liganden door de exponentiële verrijking (SELEX) om een breed scala aan doelen te herkennen, van kleine moleculen aan eiwitten en andere macromoleculen 2-4. Aptameren hebben eigenschappen die zeer geschikt zijn voor in vivo diagnostische en / of therapeutische toepassingen: Naast goede specificiteit en affiniteit, ze gemakkelijk worden gesynthetiseerd, strengere verwerking omstandigheden te overleven, ze zijn slecht immunogeen, en hun relatief geringe omvang kan resulteren in gemakkelijke penetratie van weefsels. Aptameren die zijn geïdentificeerd door middel van het standaard SELEX proces omvatten doorgaans ~ 80 nucleotiden (nt), aangezien zij meestal geselecteerd uit nucleïnezuur bibliotheken met ~ 40 nt lang gerandomiseerde regio&#39;s plus het vaste primer sites van ~ 20 nt aan elke kant. De vaste primer sequenties kan dus bijna omvatten ~ 50% van de bibliotheek sequenties, en daarom kan positief of negatief compromis identificatie van aptameren in het selectieproces 3, hoewel bioinformatica methoden suggereren dat de vaste sequenties niet significant bijdragen aan de aptameer structuur na selectie 5 . Om deze potentiële problemen, zijn primer sequenties geblokkeerd door complementaire oligonucleotiden of de overstap naar verschillende sequenties halverwege tijdens de rondes van SELEX 6, of ze zijn afgesneden tot 6-9 nt 7, 8. Wen en Gray 9 ontwierp een primer-vrije genomische SELEX methode, waarbij de primer sequenties werden volledig verwijderd uit de bibliotheek voor de selectie en werden vervolgens geregenereerd om versterking van de geselecteerde genomische fragmenten mogelijk te maken. Echter, om gebruik van de techniek, een unieke genomische bibliotheek moet worden gebouwd, die beschikt over beperkte diversiteit, en regeneratie na het ronden van selectie is gebaseerd op een lineaire reamplification stap. Als alternatief zijn pogingen om problemen veroorzaakt door vaste primer sequenties met behulp van zeer efficiënte verdeling te omzeilen een ontmoeting gehad met problemen met betrekking tot PCR-amplificatie 10. We hebben een primer-vrij (PF) selectie methode die aanzienlijk vereenvoudigd SELEX procedures en effectief elimineert primer-storingen 11, 12. De protocollen werken op een eenvoudige wijze. De centrale willekeurige gebied van de bibliotheek wordt gezuiverd, zonder overbodige flankerende sequenties en is gebonden aan een geschikt doelwit (bijvoorbeeld om een ​​gezuiverde eiwit of complexe mengsels zoals mobiele lijnen). Dan is de gebonden sequenties worden verkregen, herenigd met flankerende sequenties, en opnieuw versterkt tot geselecteerde sub-bibliotheken te genereren. Als een voorbeeld, hier zijn we geselecteerd aptameren om S100B, een eiwit marker voor melanoom. Bindingstesten liet Kd s in de 10 -7-10 -8 M serie na een paar ronden van selectie, en we laten zien dat de aptameren effectief te functioneren in een sandwich bindend formaat.

SELEX protocollen bestaan ​​uit meerdere ronden van selectie, die elk vereisen regeneratie van gebonden liganden, die op hun beurt behoefte aan vaste primer sequenties aan weerszijden van de willekeurige bibliotheek regio&#39;s. Deze vaste primer sequenties kunnen interfereren met de selectieprocedure (vals positieven en negatieven). Hier presenteren wij een primer-vrij protocol.

Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek

Aptameren zijn sterk gestructureerde oligonucleotiden (DNA of RNA) die kunnen binden aan targets met affiniteiten die vergelijkbaar zijn met die van antilichamen 1. Ze worden geïdentificeerd ...

Het algemene doel van deze procedure is om abers uit een willekeurige bibliotheek te identificeren die specifiek binden aan een doeleiwit, in dit geval het S 100 B-eiwit. Dit wordt bereikt door de bibliotheek eerst te verteren met een restrictie-endonuclease om willekeurige sequenties vrij te maken van de flankerende vaste primersequenties. De tweede stap van de procedure is het binden van de willekeurige bibliotheeksequenties aan gezuiverd S 100 B-eiwit en het vervolgens terugwinnen ervan.De derde stap van de procedure is het herenigen van gebonden sequenties met gefixeerde primersequenties door middel van hybridisatie en ligatie. De laatste stap van de procedure is het transcriberen van de geligeerde producten om R-T-P-C-R re-amplificatie van de gebonden pool van kandidaat-abers mogelijk te maken, gevolgd door aanvullende ronden van deze selectieprocedure. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een specifieke binding van geselecteerde abers aan het S 100 B-eiwit aantonen.Hier worden bijvoorbeeld sandwich-bindingsassays uitgevoerd met microarrays, en er worden ook assays met fluorescentielabelled secundaire antilichamen uitgevoerd met gefunctionaliseerde nanodraden en secundaire antilichamen gekoppeld aan gouden nanodeeltjes van 15 nanometer. Vandaag tonen we een procedure voor het selecteren van optimale binders die binden aan het S100B-eiwit vanuit een willekeurige bibliotheek van DNA-sequenties. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium voor diverse doeleinden, waaronder de ontwikkeling van een sensorplatform voor de vroege detectie van kanker.Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, genereert u een primer-vrije of PF DNA-bibliotheek zoals eerder beschreven. Splijting van de dubbelstrengse DNA-bibliotheek, gevolgd door gelzuivering met een 10% denaturerende polyacrylamidegel, resulteert in een 5'-fosfaatfragment van 32 nucleotiden in 30 cc en een 5'-fosfaatfragment van 30 nucleotiden in 30, respectievelijk aangeduid als het 32-plus en 30-plus fragment.Het 32-plus fragment bevat het willekeurige domein van 30 nucleotiden met de minimale CC-flankerende sequentie aan het drie-prime uiteinde, terwijl het 30-plus fragment uitsluitend bestaat uit de sequentie van het willekeurige domein van 30 nucleotiden. Om de DNA-fragmenten van de PF-bibliotheek voor aptr-selectie voor te bereiden, worden elk van de 32-plus en 30-plus fragmenten geresuspendeerd in 40 µL 20 mM tris, HCl pH 7.4. Verwarm de monsters vervolgens gedurende drie minuten bij 85 °C na incubatie.Koel de monsters drie minuten af in een waterbadincubator van 37 °C, voeg vervolgens 760 µL selectiebuffer toe en incubeer drie minuten bij 37 °C. Houd het monster na drie minuten 10 minuten lang op kamertemperatuur. Laat de oplossing na incubatie door een kolom lopen die bevat nikkel-NTA-agarosebeads die vooraf zijn gewassen met selectiebuffer.Om aspecifiek DNA te verwijderen, worden de PF-library DNA-fragmenten die niet aan de kolom binden opgevangen en bewaard voor later gebruik. Om de S 100 B-gebonden beads voor te bereiden, worden eerst 400 µL nikkel-NDA-beads drie seconden gecentrifugeerd in een microcentrifuge, waarna het supernatant wordt weggegooid. Vervolgens worden de beads gewassen met 400 µL bindingsbuffer door vijf keer voorzichtig te pipetteren.Centrifuge vervolgens de kraaltjes en verwijder het supernatant. Herhaal dit. Was twee keer.Giet vervolgens het eerder gezuiverde histidine-getagde eiwit over de beads. Hier is het humane S 100 calciumbindende eiwit B gebruikt. Pipetteer de oplossing voorzichtig vijf keer op en neer elke drie minuten, gedurende een totale tijd van 15 minuten.Centrifuge de kralen na 15 minuten en verwijder het supernatant. Was ten slotte de aan de kralen gebonden S 100 B met 400 µL selectiebuffer door drie keer voorzichtig op en neer te pipetteren. Centrifugeer de kralen opnieuw en verwijder het supernatant.Herhaal deze stap twee keer voor in totaal drie uiteindelijke wasbeurten om te selecteren op S 100 B-gebonden abers. Haal de eerder opzij gezette 32 plus en 30 plus fragmenten weer tevoorschijn. Voeg de fragmenten toe aan het aan de beads gebonden S 100 B. Incubeer het monster vervolgens gedurende 15 minuten.Meng elke drie minuten door voorzichtig op en neer te pipetteren. Na 15 minuten de beads kort centrifugeren, het supernatant verwijderen en vervolgens het S 100 BDNA-complex wassen met 800 microliters selectiebuffer door voorzichtig te pipetteren. Centrifugeer daarna de beads en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap tweemaal.Om de S 100 terug te winnen, voeg 200 µL 20 mM tris-HCl pH 7.4 toe aan de beads. Verwarm de suspensie vervolgens gedurende drie minuten bij 85 °C. Na incubatie.Vortex de kraaltjes gedurende één minuut en centrifugeer ze kort. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis. Herhaal deze stap één keer en voeg de supernatanten samen.Zuiver slutaan de geselecteerde DNA-fragmenten. Extraheer de PCR-producten tweemaal met een gelijk volume fenylchloroform en isopropylalcohol. Precipiteer deze met 250 millimolar natriumchloride en 2,5 keer het volume 100% Ethanol bij minus 70 °C gedurende 15 minuten.Centrifuge bij 21.000 GS bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens de supernatant. Spoel het pellet efficiënt met 75% ethanol.Centrifuge op 21.000 GS bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Droog de pellet drie minuten in een speedvac. Na 10 selectierondes worden de resulterende PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten gekloond in de PCR 2.1 topo-vector verkregen van een vitrogen core.Sequenceer vervolgens tussen de 40 en 50 enkelvoudige kolonies voor elk van de geselecteerde N 30 cc en N 30 fragmenten met de M 13 forward primer. Lijn de geselecteerde sequenties uit met behulp van infomax vector NTI-software. Bepaal vervolgens de consensussequenties op basis van de alignments.Zodra de consensussequenties zijn geïdentificeerd, dienen de consensus-abers te worden gekocht zoals beschreven in het geschreven protocol. Suspendeer de eerste gesynthetiseerde aptameer met een five prime Amin C six-groep in printbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 15 µM. Spot vervolgens de aptameeroplossing op code link-geactiveerde slides met behulp van een Apogen Discoveries microgrid-array.Volg de aanbevolen protocollen via de codelink. Print elke slide met 12 arrays. Gebruik een formaat van twee bij acht.Microarray-hybridisatiecassette voor hybridisatie. Verdun het S 100 B-eiwit tot de juiste concentratie in 70 µL PBS. Breng de oplossing vervolgens aan in de putjes van de microarray-cassette.Verzegel de microarray-cassette met nucleasevrije kleeffolie om verdamping te voorkomen. Laat het eiwit een uur lang bij kamertemperatuur binden aan de op de codelink geprinte antilichamen door middel van incubatie.Was de wells van de cassette drie keer met PBS met vijf millimol magnesiumchloride of PBSM. Verdun vervolgens de fluorescentielabelled secundaire antilichamen tot 0,125 micromol in 70 microliter PBSM. Verwarm het mengsel gedurende drie minuten bij 85 °C.Laat de gelabelde ABERS vervolgens afkoelen op ijs. Breng de ABERS gedurende drie minuten aan op de wells van de microarraycassette. Seal de cassette opnieuw met de kleeffolie en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur.Herhaal dit opnieuw, individueel. Was de wells drie keer met PBSM na het wassen. Demonteer de cassette en spoel de gehele slide af met PBSM.Droog vervolgens de slide grondig door middel van centrifugatie. Scan tenslotte de slide met een Packard Biosciences scan array. De binding van 4.000 XL werd bepaald voor gamma P 32 A TP vijf-prime eindgelabelde aptameren aan het S 100 B-eiwit en uitgezet tegen de concentratie voor de bepaling van de KD.Representatieve Kd-waarden na ongeveer zeven selectierondes liggen doorgaans in de orde van 10⁻⁷ M. 5'-geëindigde eerste aptameren werden gekoppeld aan code link-microarrays; gezuiverd S100B-eiwit werd gebonden aan de eerste aptameren en LOR 546-gelabelde tweede aptameren werden gebonden aan de S100B-complexen van de eerste aptameren.Fluorescentie werd gekwantificeerd met een scan array scanner. De middelste rij toont sandwichbinding, gekenmerkt door additieve binding in de KD-assays in de rijen erboven en eronder. Er is geen sandwichbinding voor abers; vijf prime thiol-gederivatiseerde eerste abers werden gekoppeld aan goudnanodraden met behulp van standaard thiolchemie.Tweede aptameren werden op dezelfde wijze gekoppeld aan 50 nM goud-nanodeeltjes. Gezuiverd S100B-eiwit werd vervolgens eerst gebonden aan de gefunctionaliseerde nanodraden. Vervolgens werden 50 nM goud-nanodeeltjes met de tweede aptamer gebonden aan de S100B-complexen op de nanodraden met de eerste aptamer. De gebonden sandwichcomplexen werden gevisualiseerd met behulp van FE-SEM.Een negatieve controle kan worden gezien voor een bindingsassay die is uitgevoerd met het HTRA1-eiwit in plaats van het S100B-eiwit. Een van de belangrijkste aspecten van de procedure is dat we een primer-vrije benadering gebruiken, waarbij we geen vaste sequenties hebben die fout-positieve en fout-negatieve resultaten kunnen veroorzaken doordat de sequenties zelf de willekeurige regio overstemmen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het DNA-template wordt afgebroken voorafgaand aan elke reverse transcriptie-reactie, en om zorgvuldig het specifieke RT-PCR-product te isoleren na elke re-amplificatie.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

primer-free-aptamer-selection-using-a-random-dna-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Leer een primer-vrije methode voor aptameerselectie die specifiek bindt aan S100B-eiwit uit een willekeurige DNA-bibliotheek. Dit protocol optimaliseert SELEX door interferentie van vaste primersequenties te elimineren.

Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek

Meer video's verkennen