Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek
July 26th, 2010
SELEX protocollen bestaan uit meerdere ronden van selectie, die elk vereisen regeneratie van gebonden liganden, die op hun beurt behoefte aan vaste primer sequenties aan weerszijden van de willekeurige bibliotheek regio's. Deze vaste primer sequenties kunnen interfereren met de selectieprocedure (vals positieven en negatieven). Hier presenteren wij een primer-vrij protocol.
Het algemene doel van deze procedure is om abers uit een willekeurige bibliotheek te identificeren, die specifiek binden aan een doelwiteiwit in dit geval, S 100 B eiwit. Dit wordt bereikt door eerst de bibliotheek te verteren met restrictie-endonuclease om willekeurige sequenties te bevrijden van flankerende vaste primersequenties. De tweede stap van de procedure is om de willekeurige bibliotheeksequenties aan gezuiverd S 100 B-eiwit te binden en ze te herstellen.
De derde stap van de procedure is om gebonden sequenties te herenigen met vaste primersequenties door hybridisatie en ligatie. De laatste stap van de procedure is om de geligatiseerde producten te transcriberen om R-T-P-C-R re-amplificatie van de gebonden pool van kandidaat abers mogelijk te maken, gevolgd door aanvullende rondes van deze selectieprocedure. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die specifieke binding van geselecteerde abers aan het S 100 B-eiwit laten zien.
Hier worden bijvoorbeeld sandwich-bindassays uitgevoerd met behulp van microarrays en fluorescentiegelabelde tweede abers-assays worden ook uitgevoerd met behulp van gefunctioneerde nanodraden en tweede abers gekoppeld aan 15 nanometer goudnanodeeltjes. Vandaag laten we een procedure zien voor het selecteren van optimaal, die zich binden aan S honderd B-eiwit uit een willekeurige bibliotheek van D-sequenties. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium voor verschillende doeleinden, waaronder het ontwikkelen van een sensorplatform voor de vroege detectie van kanker.
Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, genereer een primervrij of PF-DNA-bibliotheek zoals eerder beschreven. Afsplitsing van de dubbelstrengs DNA-bibliotheek gevolgd door gelzuivering met een 10% denaturerend polyacrylamidegel zal resulteren in een 32 nucleotidenfragment van vijf prime fosfaat in 30 cc, en een 30 nucleotidenfragment van vijf prime fosfaat in 30, aangeduid als respectievelijk het 32 plus- en 30 plus-fragment.
Het 32 plus-fragment bevat de 30 nucleotiden willekeurige domein met de CC minimale flankerende sequentie aan het drie prime-uiteinde, terwijl het 30 plus-fragment alleen bestaat uit de 30 nucleotiden willekeurige domeinsequentie. Om de PF-bibliotheek DNA-fragmenten voor aptr-selectie voor te bereiden, suspendeer elk van de 32 plus- en 30 plus-fragmenten opnieuw in 40 microliter 20 milli tris, HCL pH 7.4. Verwarm vervolgens de monsters gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius na incubatie.
Koel de monsters af gedurende drie minuten in een 37 graden Celsius waterbadincubator, vervolgens bij 760 microliter selectiebuffer en incubeer gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Laat het monster na drie minuten 10 minuten op kamertemperatuur staan. Na incubatie, passeer de oplossing door een kolom met nikkel NTA-agro-kralen die vooraf zijn gewassen met selectiebuffer.
Om niet-specifiek DNA te verwijderen, verzamel de PF-bibliotheek DNA-fragmenten die niet aan de kolom binden en bewaar ze voor later. Om de S 100 B-gebonden kralen eerst te bereiden, draai 400 microliter nikkel NDA-kralen gedurende drie seconden in een microcentrifuge en gooi het supernatant weg. Was vervolgens de kralen met 400 microliter bindingsbuffer door zachtjes vijf keer te pipetteren.
Draai vervolgens de kralen omlaag en gooi het supernatant weg. Herhaal dit. Was twee keer.
Giet vervolgens eerder gezuiverd histidine-gelabeld eiwit over de kralen. Hier wordt menselijk S 100 calciumbindend. Eiwit B wordt gebruikt. Pipetteer de oplossing zachtjes omlaag en omhoog vijf keer elke drie minuten gedurende een totaal van 15 minuten.
Na 15 minuten, draai op de kralen en gooi het supernatant weg. Was tenslotte de kralen gebonden S 100 B met 400 microliter selectiebuffer door zachtjes omlaag en omhoog te petten. Draai de kralen weer omlaag en gooi het supernatant weg.
Herhaal deze stap twee keer voor een totaal van drie laatste wasbeurten om S 100 B-gebonden abers te selecteren. Haal de eerder opzij gelegde 32 plus- en 30 plus-fragmenten. Voeg de fragmenten toe aan het kraal gebonden S 100 B. Bewaar vervolgens de monster gedurende 15 minuten.
Meng elke drie minuten door zachtjes omlaag en omhoog te pipetteren. Na 15 minuten, draai kort de kralen omlaag, gooi het supernatant weg en was het S 100 B DNA-complex met 800 microliter selectiebuffer door zachtjes te pipetteren. Draai vervolgens de kralen omlaag en gooi het supernatant weg. Herhaal deze wasstap twee keer.
Om de S 100 te herstellen, selecteert u de abers op 200 microliter 20 millimolair tris, HCL pH 7.4 naar de kralen. Verwarm vervolgens de slurry gedurende drie minuten bij 85 graden Celsius. Na incubatie.
Vortex de kralen gedurende één minuut en draai ze omlaag. Draag vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis. Herhaal deze stap eenmaal en combineer de supernatanten.
Zuiver ten slotte de geselecteerde DNA-fragmenten. Extraheer de PCR-producten tweemaal met een gelijkwaardig volume fenyl chloroform, isopropylalcohol. Precipiteer ze met 250 millimolair natriumchloride en 2,5 keer het volume van 100% ethanol bij min 70 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 21.000 GS bij vier graden Celsius. Gooi vervolgens het supernatant weg. Spoel de pellet efficiënt met 75% ethanol.
Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 21.000 GS bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Droog de pellet gedurende drie minuten in een speed vacuum. Na 10 selectierondes. Kloon de resulterende PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten in de PCR 2.1 topo-vector verkregen uit een vitrogen-core.
Bepaal vervolgens tussen 40 en 50 enkele kolonies voor elk van de geselecteerde N 30 cc en N 30 fragmenten met de M 13 voorwaartse primer. Lijn de geselecteerde sequenties uit met behulp van infomax vector NTI-software. Bepaal vervolgens de consensussequenties op basis van de uitlijningen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een primer-vrij protocol voor het selecteren van aptameren die specifiek binden aan het S100B-eiwit uit een willekeurige DNA-bibliotheek. De methode heeft tot doel de efficiëntie van SELEX-protocollen te verbeteren door interferentie van vaste primersequenties te elimineren.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Eiwitengineering
- Biotechnologie
Achtergrond
- SELEX-protocollen vereisen doorgaans vaste primersequenties die kunnen leiden tot valse positieven en negatieven.
- Het identificeren van specifieke binders uit willekeurige bibliotheken is cruciaal voor verschillende toepassingen, inclusief sensorontwikkeling.
- Het S100B-eiwit is een doelwit van belang vanwege zijn relevantie bij kankerdetectie.
- Traditionele methoden kunnen het selectieproces belemmeren vanwege de aanwezigheid van vaste sequenties.
Doel van het Onderzoek
- Een primer-vrije methode ontwikkelen voor het selecteren van aptameren die binden aan het S100B-eiwit.
- Het SELEX-proces stroomlijnen en de specificiteit verbeteren.
- Een gedetailleerd protocol verstrekken voor onderzoekers op het gebied.
Gebruikte Methoden
- Vertering van een willekeurige DNA-bibliotheek om vaste primersequenties te verwijderen.
- Binding van de bibliotheek aan gezuiverd S100B-eiwit.
- Hybridisatie en ligatie om gebonden sequenties met vaste sequenties weer te verenigen.
- Transcriptie en amplificatie van geselecteerde aptameren via R-T-P-C-R.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle identificatie van aptameren die specifiek binden aan het S100B-eiwit.
- Demonstratie van binding door sandwich-assays met behulp van microarrays.
- Validatie van geselecteerde aptameren met behulp van gefunctionaliseerde nanodraden en gouden nanodeeltjes.
- Mogelijke toepassingen in vroege kankerdetectie gehighlight.
Conclusies
- Het primer-vrije protocol verbetert het SELEX-proces door interferentie te verminderen.
- Geselecteerde aptameren vertonen belofte voor gebruik in biosensing-toepassingen.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende doelen buiten het S100B-eiwit.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Primer-free aptamer selection addresses a critical bottleneck in early discovery by eliminating fixed sequence interference, enabling more accurate identification of high-affinity binders. This innovation enhances predictive confidence in target validation and supports robust assay development for protein targets such as S100B. The approach is strategically relevant for biopharma portfolios seeking reliable molecular recognition tools for diagnostics and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased interrogation of molecular interactions by removing primer-induced artifacts.
- Improves functional target validation by isolating aptamers with true specificity for the protein of interest.
- Supports predictive confidence in downstream biological assays and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated aptamer libraries for high-throughput screening platforms.
- Enhances assay reproducibility by minimizing sequence-related variability.
- Delivers quantitative binding data (e.g., Kd values) for reliable compound or biomarker evaluation.
- Enables scalable and reusable assay formats, including microarrays and nanowire-based sensors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with disease-relevant protein targets such as S100B, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating robust molecular probes.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by ensuring aptamer specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This primer-free selection method integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating aptamers with minimal sequence bias.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding outputs suitable for high-throughput and multiplexed assays.
- Analytics: Provides robust Kd measurements and consensus sequence identification for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment with disease biomarkers and supports continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for aptamer selection against diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of molecular diagnostics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid chemistry and protein biochemistry.
- Needs access to instrumentation for DNA purification, amplification, and microarray or nanowire assays.
- Demands cross-team standardization of selection and validation protocols.
- Adaptation may be needed for different protein targets or sample matrices.
- Careful control of template destruction and product isolation is essential to avoid false positives.
