Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek

Het algemene doel van deze procedure is om abers uit een willekeurige bibliotheek te identificeren die specifiek binden aan een doeleiwit, in dit geval het S 100 B-eiwit. Dit wordt bereikt door de bibliotheek eerst te verteren met een restrictie-endonuclease om willekeurige sequenties vrij te maken van de flankerende vaste primersequenties. De tweede stap van de procedure is het binden van de willekeurige bibliotheeksequenties aan gezuiverd S 100 B-eiwit en het vervolgens terugwinnen ervan.

De derde stap van de procedure is het herenigen van gebonden sequenties met gefixeerde primersequenties door middel van hybridisatie en ligatie. De laatste stap van de procedure is het transcriberen van de geligeerde producten om R-T-P-C-R re-amplificatie van de gebonden pool van kandidaat-abers mogelijk te maken, gevolgd door aanvullende ronden van deze selectieprocedure. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een specifieke binding van geselecteerde abers aan het S 100 B-eiwit aantonen.

Hier worden bijvoorbeeld sandwich-bindingsassays uitgevoerd met microarrays, en er worden ook assays met fluorescentielabelled secundaire antilichamen uitgevoerd met gefunctionaliseerde nanodraden en secundaire antilichamen gekoppeld aan gouden nanodeeltjes van 15 nanometer. Vandaag tonen we een procedure voor het selecteren van optimale binders die binden aan het S100B-eiwit vanuit een willekeurige bibliotheek van DNA-sequenties. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium voor diverse doeleinden, waaronder de ontwikkeling van een sensorplatform voor de vroege detectie van kanker.

Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, genereert u een primer-vrije of PF DNA-bibliotheek zoals eerder beschreven. Splijting van de dubbelstrengse DNA-bibliotheek, gevolgd door gelzuivering met een 10% denaturerende polyacrylamidegel, resulteert in een 5'-fosfaatfragment van 32 nucleotiden in 30 cc en een 5'-fosfaatfragment van 30 nucleotiden in 30, respectievelijk aangeduid als het 32-plus en 30-plus fragment.

Het 32-plus fragment bevat het willekeurige domein van 30 nucleotiden met de minimale CC-flankerende sequentie aan het drie-prime uiteinde, terwijl het 30-plus fragment uitsluitend bestaat uit de sequentie van het willekeurige domein van 30 nucleotiden. Om de DNA-fragmenten van de PF-bibliotheek voor aptr-selectie voor te bereiden, worden elk van de 32-plus en 30-plus fragmenten geresuspendeerd in 40 µL 20 mM tris, HCl pH 7.4. Verwarm de monsters vervolgens gedurende drie minuten bij 85 °C na incubatie.

Koel de monsters drie minuten af in een waterbadincubator van 37 °C, voeg vervolgens 760 µL selectiebuffer toe en incubeer drie minuten bij 37 °C. Houd het monster na drie minuten 10 minuten lang op kamertemperatuur. Laat de oplossing na incubatie door een kolom lopen die bevat nikkel-NTA-agarosebeads die vooraf zijn gewassen met selectiebuffer.

Om aspecifiek DNA te verwijderen, worden de PF-library DNA-fragmenten die niet aan de kolom binden opgevangen en bewaard voor later gebruik. Om de S 100 B-gebonden beads voor te bereiden, worden eerst 400 µL nikkel-NDA-beads drie seconden gecentrifugeerd in een microcentrifuge, waarna het supernatant wordt weggegooid. Vervolgens worden de beads gewassen met 400 µL bindingsbuffer door vijf keer voorzichtig te pipetteren.

Centrifuge vervolgens de kraaltjes en verwijder het supernatant. Herhaal dit. Was twee keer.

Giet vervolgens het eerder gezuiverde histidine-getagde eiwit over de beads. Hier is het humane S 100 calciumbindende eiwit B gebruikt. Pipetteer de oplossing voorzichtig vijf keer op en neer elke drie minuten, gedurende een totale tijd van 15 minuten.

Centrifuge de kralen na 15 minuten en verwijder het supernatant. Was ten slotte de aan de kralen gebonden S 100 B met 400 µL selectiebuffer door drie keer voorzichtig op en neer te pipetteren. Centrifugeer de kralen opnieuw en verwijder het supernatant.

Herhaal deze stap twee keer voor in totaal drie uiteindelijke wasbeurten om te selecteren op S 100 B-gebonden abers. Haal de eerder opzij gezette 32 plus en 30 plus fragmenten weer tevoorschijn. Voeg de fragmenten toe aan het aan de beads gebonden S 100 B. Incubeer het monster vervolgens gedurende 15 minuten.

Meng elke drie minuten door voorzichtig op en neer te pipetteren. Na 15 minuten de beads kort centrifugeren, het supernatant verwijderen en vervolgens het S 100 BDNA-complex wassen met 800 microliters selectiebuffer door voorzichtig te pipetteren. Centrifugeer daarna de beads en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap tweemaal.

Om de S 100 terug te winnen, voeg 200 µL 20 mM tris-HCl pH 7.4 toe aan de beads. Verwarm de suspensie vervolgens gedurende drie minuten bij 85 °C. Na incubatie.

Vortex de kraaltjes gedurende één minuut en centrifugeer ze kort. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis. Herhaal deze stap één keer en voeg de supernatanten samen.

Zuiver slutaan de geselecteerde DNA-fragmenten. Extraheer de PCR-producten tweemaal met een gelijk volume fenylchloroform en isopropylalcohol. Precipiteer deze met 250 millimolar natriumchloride en 2,5 keer het volume 100% Ethanol bij minus 70 °C gedurende 15 minuten.

Centrifuge bij 21.000 GS bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens de supernatant. Spoel het pellet efficiënt met 75% ethanol.

Centrifuge op 21.000 GS bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Droog de pellet drie minuten in een speedvac. Na 10 selectierondes worden de resulterende PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten gekloond in de PCR 2.1 topo-vector verkregen van een vitrogen core.

Sequenceer vervolgens tussen de 40 en 50 enkelvoudige kolonies voor elk van de geselecteerde N 30 cc en N 30 fragmenten met de M 13 forward primer. Lijn de geselecteerde sequenties uit met behulp van infomax vector NTI-software. Bepaal vervolgens de consensussequenties op basis van de alignments.

Zodra de consensussequenties zijn geïdentificeerd, dienen de consensus-abers te worden gekocht zoals beschreven in het geschreven protocol. Suspendeer de eerste gesynthetiseerde aptameer met een five prime Amin C six-groep in printbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 15 µM. Spot vervolgens de aptameeroplossing op code link-geactiveerde slides met behulp van een Apogen Discoveries microgrid-array.

Volg de aanbevolen protocollen via de codelink. Print elke slide met 12 arrays. Gebruik een formaat van twee bij acht.

Microarray-hybridisatiecassette voor hybridisatie. Verdun het S 100 B-eiwit tot de juiste concentratie in 70 µL PBS. Breng de oplossing vervolgens aan in de putjes van de microarray-cassette.

Verzegel de microarray-cassette met nucleasevrije kleeffolie om verdamping te voorkomen. Laat het eiwit een uur lang bij kamertemperatuur binden aan de op de codelink geprinte antilichamen door middel van incubatie.

Was de wells van de cassette drie keer met PBS met vijf millimol magnesiumchloride of PBSM. Verdun vervolgens de fluorescentielabelled secundaire antilichamen tot 0,125 micromol in 70 microliter PBSM. Verwarm het mengsel gedurende drie minuten bij 85 °C.

Laat de gelabelde ABERS vervolgens afkoelen op ijs. Breng de ABERS gedurende drie minuten aan op de wells van de microarraycassette. Seal de cassette opnieuw met de kleeffolie en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Herhaal dit opnieuw, individueel. Was de wells drie keer met PBSM na het wassen. Demonteer de cassette en spoel de gehele slide af met PBSM.

Droog vervolgens de slide grondig door middel van centrifugatie. Scan tenslotte de slide met een Packard Biosciences scan array. De binding van 4.000 XL werd bepaald voor gamma P 32 A TP vijf-prime eindgelabelde aptameren aan het S 100 B-eiwit en uitgezet tegen de concentratie voor de bepaling van de KD.

Representatieve Kd-waarden na ongeveer zeven selectierondes liggen doorgaans in de orde van 10⁻⁷ M. 5'-geëindigde eerste aptameren werden gekoppeld aan code link-microarrays; gezuiverd S100B-eiwit werd gebonden aan de eerste aptameren en LOR 546-gelabelde tweede aptameren werden gebonden aan de S100B-complexen van de eerste aptameren.

Fluorescentie werd gekwantificeerd met een scan array scanner. De middelste rij toont sandwichbinding, gekenmerkt door additieve binding in de KD-assays in de rijen erboven en eronder. Er is geen sandwichbinding voor abers; vijf prime thiol-gederivatiseerde eerste abers werden gekoppeld aan goudnanodraden met behulp van standaard thiolchemie.

Tweede aptameren werden op dezelfde wijze gekoppeld aan 50 nM goud-nanodeeltjes. Gezuiverd S100B-eiwit werd vervolgens eerst gebonden aan de gefunctionaliseerde nanodraden. Vervolgens werden 50 nM goud-nanodeeltjes met de tweede aptamer gebonden aan de S100B-complexen op de nanodraden met de eerste aptamer. De gebonden sandwichcomplexen werden gevisualiseerd met behulp van FE-SEM.

Een negatieve controle kan worden gezien voor een bindingsassay die is uitgevoerd met het HTRA1-eiwit in plaats van het S100B-eiwit. Een van de belangrijkste aspecten van de procedure is dat we een primer-vrije benadering gebruiken, waarbij we geen vaste sequenties hebben die fout-positieve en fout-negatieve resultaten kunnen veroorzaken doordat de sequenties zelf de willekeurige regio overstemmen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het DNA-template wordt afgebroken voorafgaand aan elke reverse transcriptie-reactie, en om zorgvuldig het specifieke RT-PCR-product te isoleren na elke re-amplificatie.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.