Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

Het algemene doel van het volgende experiment is om de mate van colockalisatie van geïnternaliseerde bacteriën, RIA Meningitidis, met het cytoskeletal eiwit Alpha Actinin te beoordelen. Dit wordt bereikt door gecultiveerde humane hersenmicrovasculaire cellen te infecteren met een overnachtelijke kweek van bacteriën gedurende drie tot acht uur om de bacteriën toegang te geven tot de doelcellen. Als tweede stap worden cellen met intracellulaire bacteriën gewassen, gefixeerd en vervolgens gepermeabiliseerd, wat de geïnfecteerde kweek voorbereidt op immunokleuring van geïnternaliseerde bacteriën en intracellulair alfa-actinine.

Na de confocale beeldvorming en toepassing van colockalisatiesoftware kunnen beelden van de intracellulaire colockalisatie worden waargenomen en gekwantificeerde resultaten worden verkregen die aantonen dat Meninga Croci OPC tot expressie brengt en ook membraaneiwit specifiek kan interageren met intracellulair alfa-actinine op basis van confocale microscopische visualisatie en door kwantitatieve colockalisatieanalyse. Hallo, ik ben Isel Maria van Professor Mata TI Lab bij het Department of Cellular Molecular Medicine aan de Universiteit van Bri. Vandaag laten we u een procedure zien voor de schatting van het niveau van col, de verhouding van intracellulaire bacteriën met cytoskeletal eiwitten.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om een interactie te bestuderen van mycelium meningitis die een auto membraaneiwit OPC tot expressie brengt met het cytoskeletal eiwit alfa-actinine. Dus laten we beginnen. Dit werk moet worden uitgevoerd in een voldoende veilig laboratorium.

Twee dagen vóór de immunokleuringsprocedure, inoculeer de belangrijke bacteriestam op hersenhartinfusie. Agar platen aangevuld met 10% verwarmd paardenbloed worden een nacht lang gekweekt bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide op de dag vóór immunokleuring. Gebruik een kweeklus van 10 microliter om een suspensie van de overnachtelijke bacteriekweek te maken.

In twee milliliters PBSB, laat de suspensie vijf minuten staan bij kamertemperatuur om grote bacterie-aggregaten te laten bezinken. Breng vervolgens de bovenste één milliliter van de suspensie over in een steriele buis zonder de pellet te verstoren, solubiliseer bacteriën. Voeg één milliliter van 1%SDS 0,1 molair natriumhydroxide toe aan twee flesjes met 20 microliter bacteriesuspensie en draai de buis om te mengen. Om het aantal bacteriën te schatten.

Meet de nucleïnezuurinhoud door de absorptie van de oplossing te bepalen. Bij 216 anters pas de bacteriesuspensie aan tot de vereiste dichtheid in infectiemedium voor het infecteren van humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen. Humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen of H-B-M-E-C-A gezaaid twee dagen vóór immunokleuring plaats 16 millimeter glazen dekjes in de putjes van een 12-putjesplaat en zaai HBME op 50%Confluence op de dekjes. Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide op de volgende dag.

Infecteer cellen met de versbereide bacteriesuspensie in ons laboratorium. Een infectieratio van 200 tot 300 kolonievormende eenheden per doelcel wordt routinematig gebruikt. Incubeer gedurende drie tot acht uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide aan het einde van de infectieperiode.

Was cellen drie keer met PBS en fixeer 500 microliter van 2%para formaldehyde gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur. Na het afwassen van de para formaldehyde, perme de paraldehyde gefixeerde cellen door incubatie in 0,1%Triton X 100 verdund in PBS gedurende 10 minuten. Was de monsters vervolgens drie keer met PBS en ga verder met de immunokleuring zoals getoond. Vervolgens kan kleuring van intracellulaire bacteriën en dfor-actinine gelijktijdig worden uitgevoerd.

In 12-putjes platen blokkeer de dekjes met de permeabele cellen met 500 microliter van 3%B-S-A-P-B-S-T gedurende 30 tot 60 minuten. Bij kamertemperatuur na het wassen met PBS breng elk dekje over naar een nieuw droge put in de 12-putjesplaat. Bij de primaire antilichamen tegen bacteriën en alfa-actinine tegelijkertijd is 80 tot 100 microliter antilichaam per dekje voldoende, indien voorzichtig toegevoegd om het oppervlak van het dekje te bedekken, incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, voeg 200 microliter PBS toe aan de put, til het dekje op en plaats het in een nieuwe put met 500 microliter PBS. Na vijf minuten, verwijder het PBS door te pipetteren en voeg vervolgens vers PBS toe. Herhaal twee keer en breng dekjes over naar een nieuwe droge put.

Voeg vervolgens de geschikte secundaire antilichamen toe, geconjugeerd met verschillende fluorochromen, verdund in 1%B-S-A-P-B-S-T. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie wordt eerder getoond, kleed DNA vervolgens tegen met DPI gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van deze incubatie, was de dekjes in PBS eenmaal en bevestig vervolgens met een druppel montagemedium. Gemonteerde dekjes moeten in het donker worden bewaard totdat ze klaar zijn voor observatie. Onder de microscoop observeren en vastleggen we beelden van onze immunogelabelde monsters met behulp van een confocale laserscanningmicroscoop die is gekoppeld aan een omgekeerde epi-fluorescentiemicroscoop.

Om de CLSM-procedure te beginnen bij een druppel immersalis op het objectief en plaats de monsterglijplaatdekjes omlaag op de microscooptafel, stel de microscoop in op een visuele modus en zoek het gebied van belang met behulp van de oogstukken van de microscoop. We zijn nu klaar om de Leica-software te gebruiken. Selecteer de XY zed-acquisitiemodus. Selecteer het formaat van vijf bij vijf 12 voor colockalisatiestudies.

Hoe hoger de resolutie, hoe nauwkeuriger het beeld. Selecteer vervolgens de bidirectionele X-modus, die de scansnelheid zal verhogen en helpen bij het verminderen van fotobleken. Stel de instellingen voor