Name: Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Leer hoe je colocalisatie van Neisseria meningitidis met α-actinine in humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen visualiseert en kwantificeert met behulp van confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De studies werden gefinancierd door de Wellcome Trust en meningitis Verenigd Koninkrijk. HBMEC cellijn werd verzorgd door dr. KS Kim. Confocale beeldvorming en elektronenmicroscopie werden uitgevoerd in de Wolfson BioImaging Facility, Universiteit van Bristol. We willen ook graag aan de heer Alan Leard, dr. Mark Jepson (Universiteit van Bristol), en de heer Alan Tilley (PerkinElmer) bedanken voor hun hulp en advies.

1. Immunofluorescentie Protocol Zaaien, Infectie &amp; immuno-kleuring De volgende procedures vereisen geschikt veiligheidsniveau weefselkweek en microbiologische laboratoria. DAG 1 A. Bereiding van target cellen voor infectie <ol><li> Zaad HBMECs op 50% confluentie (~ 1.5x10 4 cellen / cm 2) op glas dekglaasjes (16 mm diameter) geplaatst in een 12-well plaat (3,8 cm 2 groeigebied / putje). Groeimedium: RPMI 1640 aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U / ml penicilline / streptomycine, 1% (v / v) MEM niet-essentiële aminozuren zuren oplossing en 1% MEM vitaminen oplossing. </li><li> Cultuur 's nachts (O / N) bij 37 ° C, in een 5% CO 2 incubator. </li></ol> B. bacteriecultuur <ol><li> Groeien de stam van belang O / N (16-18 uur) op het gewenste medium zoals Brain Heart Infusion (BHI) agar platen aangevuld met 10% verwarmd paard bloed bij 37 ° C in 5% CO 2 atmosfeer 4. </li></ol> DAG 2 A. Bereiding van Bacteriële (N. meningitidis) Suspension <ol><li> Met behulp van een 10 pi cultuur loop, maak een schorsing van de nacht bacteriecultuur in 2 ml PBSB (PBS met calcium en magnesium). </li><li> Laat grote bacteriële aggregaten om zich te vestigen door het verlaten van de schorsing te staan ​​voor 5 min bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Zonder de pellet te verstoren, overdracht van de top 1 ml van de suspensie (stock inoculum) in een steriele buis. </li><li> In te schatten hoeveelheid bacteriën in de voorraad inoculum, voeg aliquots (20-50 pi) om buizen die 1 ml volumes van 1% SDS in 0,1 M NaOH toe en meng voorzichtig op te lossen. </li><li> Meet het nucleïnezuur inhoud van de oplossing door het bepalen van de absorptie bij 260nm (A260). In onze handen, A260 van 1 komt overeen met 5x10 8 kolonievormende eenheden / ml (cfu / ml). Dit kan worden geverifieerd door de voorbereiding van een reeks van verdunningen van de voorraad inoculum in PBSB, plating op agar platen en het tellen van kolonies na O / N incubatie. </li><li> Verdun een aliquot van de voorraad inoculum in de infectie medium [(M199 aangevuld met 2% decomplemented (56 ° C, 30 min) normaal menselijk serum (NHS)] om de gewenste bacteriële dichtheid voor de infectie van target cellen te verkrijgen. <ol><li> In ons laboratorium is een infectie verhouding van 200-300 bacteriën per doelcel routinematig gebruikt. </li></ol></li></ol> B. Cel Cultuur Infectie <ol><li> Was de dekglaasjes met gekweekte doelcellen drie keer met medium Hank om eventuele sporen van antibiotica te verwijderen. </li><li> Cellen infecteren met vers bereide bacteriële suspensies (hierboven beschreven) voor 3 uur tot 8 uur bij 37 ° C, in 5% CO 2. </li><li> Aan het einde van de infectie periode, wassen cellen drie keer met PBS en in 500 uL van 2% paraformaldehyde (PFA) vast gedurende 30-45 min bij RT of O / N bij 4 ° C. <ol><li> Paraformaldehyde fixatie op de concentratie en de tijd hierboven weergegeven werd geschikt bevonden voor het behoud van bacteriële en cellulaire morfologie. </li></ol></li><li> Na het wassen af ​​paraformaldehyde, permeabilise de paraformaldehyde-vaste cellen door incuberen in 0,1% Triton X-100 in PBS verdund gedurende 10 minuten. </li><li> Was de monsters 3 keer met PBS. </li><li> Ga verder met immuno-vlekken of, als alternatief, monsters in 500 ul van 1% BSA / PBST O / N 4 vertrekken ° C. </li></ol> DAG 3 Immuno-kleuring Kleuring van intracellulaire bacteriën en α-actinine kunnen opeenvolgend of gelijktijdig worden uitgevoerd door middel van passende primaire en secundaire antilichamen als volgt: alle procedures kunnen worden uitgevoerd in 12-well platen. <ol><li> Blokkeer de dekglaasjes met de permeabilised cellen met 500 pi van 3% BSA / PBST (PBS met 0,05% Triton X-100) voor 30-60 min bij RT </li><li> Na het wassen met PBS, breng elke dekglaasje naar een nieuwe droge goed in de 12-well plaat. </li><li> Voeg de primaire antilichamen tegen bacteriën en α-actinine; tachtig tot 100 ul van antistof per dekglaasje is het voldoende als toegevoegd aandachtig naar het oppervlak van het dekglaasje te dekken. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. <ol><li> We gebruikten konijn polyklonaal antiserum tegen Neisseria meningitidis (laboratorium-verhoogd) en de muis monoklonaal antilichaam (mAb) tegen α-actinine (Abcam) tegelijk. In sommige experimenten, in plaats van anti α-actinine, waren mAbs tegen actine of vimentine gebruikt (Sigma). </li></ol></li><li> Aan het eind van de incubatie, voeg 200 ul PBS naar de bron, tilt u de dekglaasje en leg in een nieuw putje met 500 pi PBS. </li><li> Na 5 minuten, verwijder PBS door pipetteren en voeg dan verse PBS. Tweemaal herhalen. Overdracht coverslips naar eennieuwe droge goed. </li><li> Voeg de juiste secundaire antilichamen geconjugeerd aan verschillende fluorochromen verdund in 1% BSA / PBST; incuberen bij KT 1u in het donker. <ol><li> Voor bacteriële detectie, gebruikten we anti-konijn Ig geconjugeerd aan TRITC en voor α-actinine en andere cytoskelet eiwit detectie, gebruikten we anti-muis Ig geconjugeerd om ofwel FITC-(Sigma) of Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Aan het eind van de incubatie, was net als in stap 4 en 5. </li><li> Teller vlek met 0,6 ug / ml DAPI in PBS (DNA vlek) gedurende 5 min bij RT in het donker. </li><li> Spoelen met PBS. </li><li> Mount dekglaasjes (cellen naar beneden gericht) op dia's met een daling van montage medium (e, g Mowiol of Vectashield) </li><li> Bewaren in het donker bij 4 ° C. </li><li> Monsters staan ​​klaar voor observatie onder de microscoop. </li></ol> 2. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Observeren en foto's maken van intracellulaire bacteriën en cytoskelet-elementen, gebruikten we immunolabelled samples en vastgelegde beelden met behulp van een Leica SP5-AOBS confocale laser scanning microscoop gekoppeld aan een Leica DM I6000 omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Alle beelden werden verzameld met behulp van een 63x NA 1,4 olie-immersie objectief en proces met Leica software. CLSM procedure: <ol><li> Om te beginnen de CLSM procedure, voeg een druppel immersie olie aan de doelstelling en plaats het monster glijbaan, dekglaasje-kant naar beneden, op de microscoop podium. </li><li> Stel de microscoop om een ​​visuele modus en vinden op het gebied van belang met het oog stukken van de microscoop. </li><li> Met behulp van Leica software, kies de xyz overname mode. </li><li> Selecteer de 512 x 512 formaat (frame formaat). Voor colocalisation studies, de hogere resolutie, hoe nauwkeuriger het beeld, rekening houdend met de resolutie limiet van de microscoop. Selecteer vervolgens de bidirectionele X-modus, die de scansnelheid zal toenemen en bijdragen tot het verminderen foto-bleken. </li><li> Stel opeenvolgende scaninstellingen. Klik in de "volgende" functie en kies een van de scanmodi. We maken gebruik van 'tussen de lijnen "-modus. </li><li> Selecteer laserstralen volgens de fluorochromen geconjugeerd aan de secundaire antilichamen: 405 nm voor DAPI (blauw), 488 nm voor Alexa Fluor 488 (groen) en 561 nm voor TRITC (rood). Activeer Fotomultiplicatorbuizen Tube (PMT) 1, 2 en 3, respectievelijk. Pas PMT de instellingen om de juiste emissie golflengte te detecteren. </li><li> Stel top ('begin') en onderkant ("end") van de z-stacks of serie. Stel vervolgens de gewenste "z-step size". <ol><li> Neisseria meningitidis is een diplokokken (figuur 1G), en aangezien iedere kokken heeft een geschatte diameter van 0,5 micrometer, de z-stapgrootte van 0,20 um werd gekozen om de waarschijnlijkheid van het scannen van elk coccus minstens twee keer te verbeteren. Het is ook binnen de stapgrootte voor een optimale resolutie van 0,1 - 0,2 micrometer. </li></ol></li><li> Stel de uiteindelijke scan parameters door het selecteren van lijn gemiddelde van 3 tot en met de signaal-ruisverhouding te verbeteren. </li><li> Door te klikken op "start" dubbel-of triple-gekleurde beelden worden verkregen door opeenvolgende scannen met verschillende golflengten om overspraak tussen verschillende chromoforen te elimineren. </li><li> Voor een indicatie van colocalisation van twee fluorochromen, selecteert u de "overlay"-functie om de geselecteerde kanalen samen te voegen tot een enkel beeld, bijvoorbeeld als beide Alexa 488 (groen) en TRITC (rood) fluorochromen colocalise, gele kleur wordt weergegeven in de afbeelding bedekt . </li><li> Compile z-stacks of series met behulp van de "maximale projectie"-functie voor de bouw van een 2D-afbeelding die nodig is voor het visualiseren van mogelijke colocalisation. Meer gedetailleerde analyse van colocalisation kan worden verkregen door analyse van elk optische gedeelte. </li><li> Na de overname van de z-stacks of reeks, het verwerken van uw gegevens naar een orthogonale afbeelding voor een visualisatie van intracellulaire lokalisatie van de verschillende elementen (figuur 1E) te verkrijgen. </li></ol> 3. Kwantificering van Colocalisation Statistische analyses van de confocale scanning microscoop beelden zijn uitgevoerd met Volocity software (Improvisation, PerkinElmer). Deze software biedt een hulpmiddel dat specifiek is ontworpen voor colocalisation analyse zoals beschreven door Manders et al.. (1993) 5. Colocalisation in het kader van de digitale fluorescentie beeldvorming kan worden omschreven als de detectie van een signaal op dezelfde voxel (pixel volume) locatie in elk kanaal. De twee kanalen zijn samengesteld uit beelden van twee verschillende fluorochromen uit hetzelfde monster gebied (Volocity handleiding). Statistische analyses zijn uitgevoerd met Volocity software (Improvisation, PerkinElmer) met behulp van kwantitatieve analyse Colocalisation hieronder beschreven. Kwantitatieve analyse Colocalisation <ol><li> Maak een bibliotheek met CLSM beelden met behulp van Volocity software. </li><li> Selecteer "uitgebreide focus" van beeld in de bovenste balk. Deze tool zal compileren z-stacks in een 2D-afbeelding te analyseren. </li><li> Selecteer "Colocalization" tool. De twee kanalen te analyseren moeten dezelfde kleurdiepte. </li><li> Selecteer het gebied dat het gaat worden gekwantificeerd. Stel de drempel om een ​​achtergrond te verwijderen. </li><li> Maak de colocalisation worden weergegeven door "het genereren van colocalization". Colocalisation statistieken worden gegenereerd voor de gebieden van belang vooraf geselecteerd. </li><li> Selecteer Manders 'coëfficiënten R (overlap coëfficiënt) en Mijn (colocalisation coëfficiënt). <ol><li> Manders 'coëfficiënten zijn niet gevoelig voor de intensiteit van de vlekken zoals ze zijn genormaliseerd tegen totaal aantal pixels intensiteit; waardoor ze kunnen worden ingezet wanneer de kleuring van een antigeen is sterker dan de andere. </li><li> Overlap coëfficiënt R volgens Manders 5,6 vertegenwoordigt de ware mate van colocalisation, dwz het aantal pixels dat colocalise in vergelijking met het totaal aantal pixels. </li><li> Aan de andere kant, de colocalisation coëfficiënt, My, de fluorescentie bijdrage van de meer overvloedige groep (in dit geval α-actinine, groen) om de minder overvloedig groep (in dit geval bacteriën, rood) beschrijft, dat wil zeggen het aantal rode pixels die overlappen met groene pixels in vergelijking met het totaal aantal rode pixels. </li><li> Manders 'coëfficiënten variëren tussen 1 en 0, waarbij 1 een hoge colocalisation, 0 is niet, maar ze kunnen worden uitgedrukt als een percentage voor eenvoudiger interpretatie. </li></ol></li><li> Export-statistieken waarden naar een Excel-document voor de presentatie van gegevens. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Intracellulaire lokalisatie van OPC-expressie Neisseria meningitidis en α-actinine Confocale beeldvorming van het menselijk brein microvasculaire endotheelcellen geïnfecteerd zijn met Nm voor de 3 en 8 uur zoals hierboven beschreven is aangegeven colocalisation van α-actinine en Nm die kennelijk minder frequent worden in 3 uur infectie experimenten (niet afgebeeld) in vergelijking met culturen besmet voor 8 uur ( Figuur 1 AF). Een aantoonbare colocalisation van α-actinine met OPC-expressie meningokokken werd waargenomen iedere keer in&gt; 5 repliceren experimenten. Statistische analyse van het gebruik van meerdere colocalisation confocale beelden werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Over het geheel genomen in HBMEC die besmet zijn met OPC-uitdrukken meningokokken,&gt; 25% overlap van de groene (α-actinine) en rood (Nm) pixels werd verkregen (Figuur 2B, Overlap coëfficiënt R). In tegenstelling tot α-actinine, experimenten waarbij de etikettering van geïnternaliseerde bacteriën en ofwel actine-of vimentine werd uitgevoerd, werd af en toe colocalisation waargenomen met actine, maar dat met vimentine was zeldzaam (Figure. 2B). De gegevens werden ook geanalyseerd met behulp van de coëfficiënt My, die rekening houdt met de relatieve rijkdom van elk deel. Mijn is een maat voor de frequentie van voorkomen van de meer overvloedige signaal (in dit geval groen, α-actinine) elke keer dat de minder overvloedig signaal (in dit geval rood, bacteriën) optreedt. Deze maatregel toont een opvallende mate van voorkomen van α-actinine in de buurt van geïnternaliseerde meningokokken (Figuur 2A en C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Confocale laser scanning microscopie tot intracellulaire interacties van N. te beoordelen meningitidis met α-actinine. AH. Confluente endotheliale monolagen geteeld op dekglaasjes werden geïnfecteerd met de OPC-expressie (AF) N. meningitidis. Na 8 uur, niet-hechtende bacteriën werden afgewassen, cellen gefixeerd met paraformaldehyde en permeabilised met 0,1% Triton X-100. Vervolgens werden bacteriën en α-actinine gekleurd zoals hierboven beschreven (α-actinine, groen, bacteriën, rood). AC. Een veld met xy beelden van de locatie van de Nm (A) of α-actinine (B). De overlay-afbeelding in (C) geeft een aantal regio's waarin geel-oranje kleur verschijnt suggereert colocalisation. Pijlen in (A) en (B) tonen aan regio's waar een hoge mate van α-actinine accumulatie lijkt te hebben plaatsgevonden rond bacteriën. D. Optische dissectie van een geïnfecteerde HBMEC monolaag aangeeft colocalisation rond intracellulaire bacteriën gelegen aan de voet van een cel. Nogmaals, dit colocalisation is niet het gevolg van toevallige nabijheid van α-actinine, als de generaal van α-actinine vlek in dit gebied is laag. E en F. Drie-dimensionale beelden van de besmette HBMEC monolagen verwerkt zoals hierboven. Een schuin oog op de apicale oppervlak (E) toont aanhanger bacteriën gekleurd rood (rode pijl), terwijl een aantal bacteriën zich naar de basale oppervlak van endotheelcellen (gele pijl) zijn duidelijk oranje / geel van kleur. Basale locatie kan meer duidelijk te zien in (F), die een einde-on XZ doorsnede. G. Een negatief gekleurde elektronenmicroscoop beeld van N. meningitidis met haaroverheersende diplococcal uit. Elke coccus is ongeveer 0,5 micrometer in diameter. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Lokalisatie en distributie van α-actinine, actine en vimentine in HBMEC cellen. A. Geïnfecteerde monolagen van HBMEC werden behandeld als beschreven in de legende hierboven, maar in aanvulling op α-actinine, sommige dekglaasjes werden gebruikt voor de detectie van actine of vimentine naar procedure vergelijkbaar met die van α-actinine. Zoals hierboven, α-actinine geconcentreerd rond een aantal geïnternaliseerd bacteriën (witte pijlen). Vimentin en actine niet colocalise met bacteriën, merkbaar niveaus. Bar vertegenwoordigt 20 urn. B. &amp; C. De waarden voor de coëfficiënten R en My werden verkregen van meer dan drie experimenten met Volocity software zoals hierboven beschreven.

<ol><li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells%3B+the+role+of+integrins+in+apical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells%3A+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li>
<li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li>
<li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li>
</ol>

De mogelijkheid van binding van geïnternaliseerde Opc-expressie Neisseria meningitidis aan α-actinine werd onderzocht met behulp van HBMEC door het onderzoek van de colocalisation van bacteriën en het cytoskelet eiwit in geïnfecteerde cellen na 3 en 8 uur incubatie periode. Door confocale microscopie, kan colocalisation van Neisseria meningitidis met α-actinine worden aangetoond. Name, hoewel bacteriën werden geïnternaliseerd op 3 uur, was er weinig colocalisation met α-actinine op dit tijdstip. Bacteriële associatie met het cytoskelet eiwit bleek een langere periode van intracellulaire woonplaats nodig als na 8 uur infectie periode, grote aantallen bacteriën had α-actinine blijkbaar in nauwe samenwerking. Alpha-actinine is een multifunctioneel eiwit, en bacteriële interacties met het cytoskelet element zou kunnen hebben grote invloed op de doelcel functie die een onderwerp van de huidige studies. Kwantificering van colocalisation zoals hierboven beschreven vergt zorgvuldige prepareren. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de monster fixatie, het blokkeren van periode en antilichaam verdunningen. Voor de beste signaal-ruisverhouding, moet elke primaire en secundaire antilichaam worden getitreerd in voorlopige experimenten om de optimale concentratie te bepalen. In onze ervaring, de montage medium Mowiol geproduceerd betere beelden.

1. Confocale laser scanning microscopie (CLSM): Leica SP5 confocale imaging-systeem: Dit systeem, met behulp van een combinatie van AOTF (akoestisch-optische afstembare filter) en een AOBS (akoestisch-optische beam splitter), vereenvoudigt de excitatie met specifieke golflengten. 2-Software: Leica confocale software LCS, Leica Microsystems, Duitsland. Volocity 5, Improvisatie, PerkinElmer, USA.

visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van neisseria meningitidis en human α-actinine door confocale imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

De OPC-eiwit van Neisseria meningitidis (Nm, meningokok) is een oppervlakte-integraal uitgedrukt buitenste membraan eiwit, dat kan fungeren als een adhesine en een effectieve invasin voor de menselijke epitheliale en endotheelcellen. We hebben endotheeloppervlak gelegen integrinen als belangrijke receptoren voor Opc, een proces dat OPC stelt zich eerst binden aan integrine-liganden zoals vitronectine en via deze aan de cel-receptoren tot uitdrukking 1. Dit proces leidt tot bacteriële invasie van endotheelcellen 2. Meer recent, zagen we een interactie van OPC met een 100kDa eiwit dat voorkomt in heel cellysaten van menselijke cellen 3. We in eerste instantie waargenomen deze interactie als gastheercel eiwitten gescheiden door elektroforese en geblot op nitrocellulose waren bedekt met OPC-expressie Nm. De interactie was direct en niet te betrekken tussenliggende moleculen. Met behulp van massaspectrometrie, hebben we de identiteit van het eiwit als α-actinine. Aangezien er geen oppervlakte uitgedrukt α-actinine werd gevonden op een van de acht onderzochte cellijnen, en als Opc interacties met endotheliale cellen in de aanwezigheid van serum leiden tot bacteriële binnenkomst in de doelcellen, onderzochten we de mogelijkheid van de twee eiwitten interactie intracellulair. Hiervoor werden gekweekt menselijk brein microvasculaire endotheelcellen (HBMECs) besmet met OPC-expressie Nm voor langere periodes en de locaties van de geïnternaliseerde bacteriën en α-actinine werden onderzocht door confocale microscopie. We zagen de tijd-afhankelijke stijging van de colocalisation van Nm met het cytoskelet eiwit, dat aanzienlijk was na een periode van acht uur van bacteriële internalisering. Daarnaast is het gebruik van kwantitatieve imaging software ons in staat om een ​​relatieve maatstaf van de colocalisation van Nm krijgen met α-actinine en andere cytoskelet eiwitten. Hier presenteren wij een protocol voor visualisatie en kwantificering van de colocalisation van de bacterie met de intracellulaire eiwitten na bacteriële binnenkomst in humane endotheelcellen, hoewel de procedure is ook van toepassing op menselijke epitheelcellen.

Neisseria meningitidis (Nm), een gram negatieve mens-specifieke respiratoire pathogeen, kan binden aan menselijke α-actinine. Hier presenteren wij een protocol voor de visualisatie van colocalisation van de bacterie met de intracellulaire α-actinine na bacteriële binnenkomst in menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen (HBMECs).

Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

Het Opc-eiwit van Neisseria meningitidis (Nm, meningokok) is een op het oppervlak tot expressie gebracht integraal buitenmembraaneiwit, dat kan fungeren als een adhesine en een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het beoordelen van de mate van colocalisatie van geïnternaliseerde bacteriën, RIA Meningitidis, met het cytoskeletproteïne Alpha Actinin. Dit wordt bereikt door gekweekte menselijke hersenmicrovasculaire cellen gedurende drie tot acht uur te infecteren met een overnachtkweek van bacteriën, zodat de bacteriën de doelcellen kunnen binnendringen. In een tweede stap worden de cellen met intracellulaire bacteriën gewassen, gefixeerd en vervolgens gepermeabiliseerd, waardoor de geïnfecteerde kweek wordt klaargemaakt voor immunokleuring van de geïnternaliseerde bacteriën en het intracellulaire alpha actinin.Na de confocale beeldvorming en de toepassing van colocalisatiesoftware kunnen beelden van de intracellulaire colocalisatie worden waargenomen en worden gekwantificeerde resultaten verkregen waaruit blijkt dat Meninga Croci-expresserende OPC en ook membraaneiwitten specifiek kunnen interageren met intracellulair alpha-actinine, op basis van confocale microscopische visualisatie en kwantitatieve colocalisatieanalyse. Hallo, ik ben Isel Maria van het laboratorium van professor Mata TI bij de afdeling Cellulaire Moleculaire Geneeskunde aan de Universiteit van Bri. Vandaag laten we u een procedure zien voor het schatten van het colocalisatieniveau, de ratio van intracellulaire bacteriën met cytoskeletproteïnen.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de interactie tussen mycelium meningitis dat een auto membraaneiwit OPC tot expressie brengt en het cytoskelet-eiwit alfa actin te bestuderen. Laten we beginnen. Dit werk moet worden uitgevoerd in een adequaat veiligheidslaboratorium.Inoculeer twee dagen vóór de immunokleuringsprocedure de gewenste bacteriële stam op brain heart infusion-agarplaten, aangevuld met 10% verhit paardenbloed. Laat deze platen de dag vóór de immunokleuring gedurende de nacht groeien bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2. Gebruik een entlus van 10 µL om een suspensie te maken van de overnight bacteriële cultuur.Laat de suspensie in twee milliliter PBSB vijf minuten bij kamertemperatuur staan zodat grote bacteriële aggregaten kunnen bezinken. Draag vervolgens de bovenste ene milliliter van de suspensie over naar een steriele buis zonder het pellet te verstoren. Solubiliseer de bacteriën door ene milliliter 1% SDS 0,1 molar natriumhydroxide toe te voegen aan twee vials die 20 microliters bacteriële suspensie bevatten en keer de buis om om te mengen. Om de bacteriële aantallen te schatten.Meet het nucleïnezuurgehalte door de absorbentie van de oplossing te bepalen. Stel de bacteriële suspensie bij 216 aan om de vereiste dichtheid in het infectiemedium te verkrijgen voor het infecteren van de humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen. Plaats, twee dagen voorafgaand aan de immunokleuring, glazen dekglasjes van 16 millimeter in de wells van een 12-wells plaat en zaai humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen (H-B-M-E-C-A) uit op de dekglasjes tot 50% confluentie; incubeer deze overnacht bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 tot de volgende dag.Infecteer de cellen met de vers bereide bacteriële suspensie in ons laboratorium. Er wordt routinematig gebruikgemaakt van een infectieratio van 200 tot 300 colony forming units per doelcel. Incubeer gedurende drie tot acht uur bij 37 °C in 5% CO2 aan het einde van de infectieperiode.Was de cellen drie keer met PBS en fixeer deze met 500 microliters 2% paraformaldehyde gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur. Na het uitwassen van het paraformaldehyde worden de met paraformaldehyde gefixeerde cellen gepermeabiliseerd door incubatie in 0,1% Triton X 100 verdund in PBS gedurende 10 minuten. Was de monsters tot slot drie keer met PBS en ga over tot de immunokleuring zoals beschreven. Vervolgens kunnen de kleuring van intracellulaire bacteriën en voor actinine gelijktijdig worden uitgevoerd.Blokkeer in 12-wells platen de dekglasjes met de permeabiliseerde cellen met 500 µL 3% B-S-A-P-B-S-T gedurende 30 tot 60 minuten. Na het wassen met PBS bij kamertemperatuur wordt elk dekglasje overgebracht naar een nieuwe droge well in de 12-wells plaat. Voeg gelijktijdig de primaire antilichamen tegen bacteriën en alfa-actinine toe; 80 tot 100 µL antilichaam per dekglasje is voldoende indien dit voorzichtig wordt toegevoegd om het oppervlak van het dekglasje te bedekken. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 200 µL PBS toe aan de well, til het dekglasje op en plaats het in een nieuwe well met 500 µL PBS. Verwijder na vijf minuten de PBS met een pipet en voeg vervolgens verse PBS toe. Herhaal dit tweemaal en breng de dekglasjes over naar een nieuwe droge well.Voeg vervolgens de passende secundaire antilichamen toe, geconjugeerd aan verschillende fluorochromen en verdund in 1% B-S-A-P-B-S-T. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie wordt er gewassen zoals eerder beschreven. Kleur daarna het DNA tegen met DPI gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was aan het einde van deze incubatie de dekglasjes één keer in PBS en monteer ze vervolgens met een druppel monteermedium. De gemonteerde dekglasjes moeten in het donker worden bewaard totdat ze klaar zijn voor observatie. Onder de microscoop observeren en leggen we beelden vast van onze immunogelabelde monsters met behulp van een confocale laser-scanning microscoop gekoppeld aan een geïnverteerde epifluorescentiemicroscoop.Om te beginnen met de CLSM-procedure, breng een druppel immersievloeistof aan op het objectief, plaats het preparaatglas op de microscooptafel, zet de microscoop in de visuele modus en zoek het gebied van belang via de oculairs van de microscoop; we kunnen nu de Leica-software gebruiken. Selecteer de XYz-acquisitiemodus. Selecteer het 512 bij 512-formaat voor colocalisatiestudies.Hoe hoger de resolutie, hoe nauwkeuriger het beeld. Selecteer vervolgens de bidirectionele X-modus, wat de scansnelheid verhoogt en helpt bij het verminderen van fotobleken. Stel de instellingen voor sequentiële scanning in.Klik op de SEC-functie en selecteer vervolgens tussen de lijnen. Selecteer de laserstralen op basis van de fluorochromen die gekoppeld zijn aan de secundaire antilichamen. 405 nanometers voor DPI, 488 nanometers voor Alexa Fluor 488 en 561 nanometers.Activeer voor trixy respectievelijk fotomultiplicatorebuis één, twee en drie. Stel de boven- en onderkant van de Z-stapel of -reeks in. Stel vervolgens de Z-stapgrootte in op 0.2 micrometers.RIA Mencius is een diplococcus en aangezien elke coccus een benaderde diameter heeft van 0.5 micrometers, vergroot een Z-stapgrootte van 0.2 micrometers de kans dat elke coccus ten minste twee keer wordt gescand. Stel de uiteindelijke scanparameters in door een lijnmiddeling van drie te selecteren om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en klik vervolgens op start. Dubbel- of drievoudig gekleurde beelden worden verkregen door sequentiële scanning bij verschillende golflengten en door de 'between lines'-modus voor elk kanaal te gebruiken om crosstalk tussen de verschillende chromoforen te elimineren.Voor een indicatie van colocalisatie van twee fluorochromen selecteert u de overlay-functie om geselecteerde kanalen samen te voegen tot één enkel beeld. Wanneer bijvoorbeeld zowel Alexa 488 als trissy Fluor Chromes colocaliseren, verschijnt er een gele kleur in het overlay-beeld. Voor een 2D-reconstructie die nodig is voor het visualiseren van mogelijke colocalisatie, stelt u een Z-stack of serie samen met behulp van de maximumprojectiefunctie. Verwerk na het verkrijgen van de Z-stack of serie uw gegevens om een orthogonaal beeld te verkrijgen voor de visualisatie van de intracellulaire lokalisatie van diverse elementen.De kwantificering van colocalisatie wordt uitgevoerd met de Vol City-software van IMP provision. Maak eerst een bibliotheek aan met CLSM-beelden en selecteer 'extended focus' bij het beeld in de bovenbalk. Deze tool combineert z-stacks in een 2D-beeld dat geanalyseerd kan worden.Select nu de COLOCALISATIE-tool. De twee te analyseren kanalen moeten dezelfde kleurdiepte hebben. Selecteer het gebied dat gekwantificeerd zal worden.Stel de drempelwaarde in om eventuele achtergrondruis te verwijderen. Genereer de colocalisatie-output door te selecteren op 'generate colocalization'. Colocalisatiestatistieken worden gegenereerd voor de eerder geselecteerde regio's van interesse.Select vervolgens de Mander-coëfficiënten R en ny. Exporteer ten slotte de statistische waarden naar een Excel-document voor de datapresentatie; hier worden representatieve resultaten van confocale beeldvorming getoond van menselijke cerebrale endotheelcellen die acht uur lang zijn geïnfecteerd met Neisseria meningitidis. De locatie van de bacteriën is in het rood weergegeven.Terwijl de locatie van alpha actinin wordt getoond, geven groene pijlen regio's aan waar een hoge mate van alpha actinin-accumulatie lijkt te zijn opgetreden rond bacteriën. In deze overlay-afbeelding zijn er verschillende regio's waarin een geel-oranje kleur verschijnt, wat wijst op colocalisatie tussen meninga occi en alpha actinin. In de volgende afbeelding geeft optische dissectie van een geïnfecteerde H-B-M-E-C-monolaag colocalisatie aan rond intracellulaire bacteriën die zich aan de basis van een cel bevinden.Wanneer driedimensionale beelden van geïnfecteerde H-B-M-E-C-monolagen werden verwerkt, toont een schuin aanzicht van het apicale oppervlak een rood gekleurde Durant-bacterie, aangegeven door de rode pijl, terwijl verschillende bacteriën zich naar de basale oppervlakken van de endotheelcellen bevinden, aangegeven door de gele pijl. Een duidelijk oranje-gele basale lokalisatie is helderder te zien in deze endon XZ-dwarsdoorsnede. In tegenstelling tot afar, actinine-experimenten waarbij labeling van geïnternaliseerde bacteriën en ofwel menton of actine werd uitgevoerd, onthullen incidentele colocalisatie met actine, maar zeldzame colocalisatie met fermenterend in H-B-M-E-C-cellen.Zoals waargenomen in de vorige experimenten, was Retin geconcentreerd rond verschillende geïnternaliseerde bacteriën, aangegeven door de witte pijlen. De gegevens werden ook geanalyseerd om de relatieve overlap te bepalen. Coëfficiënt R, die volgens Manda de werkelijke graad van colocalisatie vertegenwoordigt, oftewel het aantal pixels dat colocaliseert vergeleken met het totale aantal pixels en NY-waarden voor alpha-actinine, menting en actine in het algemeen in H-B-M-E-C geïnfecteerd met OPC-expresserende meningokokken, resulteerde in een overlap van meer dan 25% van rein in een meningokok.De coëfficiënt Y is een maat voor de frequentie waarmee het meer voorkomende rein-signaal optreedt telkens wanneer het minder voorkomende meninga cocoa-signaal voorkomt. Deze maat vertoont een opvallende mate van aanwezigheid van alpha actinin in de nabijheid van geïnternaliseerde meninga cockeye. We laten u zien hoe u de co-lokalisatie van geïnternaliseerde bacteriën met cytoskeletelementen binnen dit experiment kunt visualiseren en kwantificeren.Het is belangrijk om te onthouden dat de protocollen voor fixatie en immunokleuring strikt moeten worden gevolgd om de integriteit van de structuren te behouden en een hoge achtergrondruis te voorkomen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.

Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Dit protocol beschrijft expressie en kwantificatie van neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van de zoogdier-Neuro-2a-cellijn. pH-gevoelige fluorescentielabels en confocale microscopie maken een nauwkeurige evaluatie mogelijk van receptorlokalisatie bij het plasmamembraan ten opzichte van die in pH-neutrale intracellulaire compartimenten, wat de studie van nAChR-transport en farmacologische modulatie vergemakkelijkt.

Lokalisatie van plasmamembraan en intracellulaire neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van kwantitatieve beeldvorming in zoogdiercellen

Leer hoe je colocalisatie van Neisseria meningitidis met α-actinine in humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen visualiseert en kwantificeert met behulp van confocale microscopie.

Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging (Video) | JoVE Journal

Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

Meer video's verkennen