Name: Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer OLIMP voor snelle analyse van plantencelwandglycostructuren met MALDI-TOF/MS. Deze methode detecteert oligosacchariden uit enzymatische vertering voor onderzoek naar biomassa en biobrandstoffen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Energy Biosciences Institute de subsidie ​​OO0G01.

De Olimp methode wordt toegelicht op de grote hemicellulose aanwezig is in de celwanden van tweezaadlobbige planten, xyloglucan, met behulp van een endoglucanase als glycosylhydrolase. De methode is gedemonstreerd met hele Arabidopsis zaailingen als een plantenweefsel bron. Enzym en extracellulaire matrix materiaal kan worden vervangen, afhankelijk van de gewenste analyse met behulp van dezelfde procedure. 1. Celwand isolatie <ol><li> Oogst vijf 5-dagen oude volledige Arabidopsis zaailingen of het equivalent bedrag van uw gewenste materiaal en breng ze in een 1,5 ml reactie buis. Zorg ervoor dat het materiaal wordt geplaatst op de bodem van de buis. </li><li> Voeg twee 3mm metalen ballen om de reactie buis op de top van het monster en snap-vries in vloeibare stikstof. </li><li> Maal het bevroren monster met behulp van een ball-mill (02:30 min, 25Hz). </li><li> Voeg 1 ml 70% waterig ethanol aan het monster. Verwijder de metalen balletjes met behulp van een magneet. Vortex grondig. </li><li> Centrifugeer steekproef bij 14.000 rpm voor de 10min te pellet de alcohol onoplosbare residu bevat de celwand materiaal. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren. </li><li> Voeg 1 ml chloroform / methanol (1:1 v / v) oplossing. Vortex grondig op de korrel resuspenderen. </li><li> Centrifugeer steekproef bij 14.000 rpm gedurende 10 min en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren. </li><li> Droog het monster met behulp van een concentrator. </li></ol> 2. Solubilisatie van oligosachariden <ol><li> Voor de solubilisatie de bijzondere polysaccharide in de vorm van de oligosacchariden resuspendeer de droge pellet in 25μl van een geschikte buffer. Voor de endoglucanase 50 mM Ammonium formate, pH4.5, wordt gebruikt. Voeg 0.2U van endoglucanase. Vortex de schorsing en de spin vloeistof naar beneden. </li><li> Incubeer het monster voor 16 uur bij 37 ° C in een incubator, schudden bij 300rpm. </li><li> Verwijder het oplosmiddel van de digest (water) met behulp van een concentrator. </li></ol> 3. MALDI-TOF analyse van de vrijgegeven oligosacchariden <ol><li> BioRex MSZ 501 kationuitwisselingshars kralen worden gebruikt om de zouten en enzym uit de verteerde monster. Staat de kralen door het plaatsen van een aliquot in een lege kolom en het wassen van de bolletjes met grote hoeveelheden water. </li><li> Voeg 50-10 BioRex kralen aan de verteerd en gedroogde monster. Voeg vervolgens 10μl water, voor kleinere hoeveelheden materiaal 5μl van het water mag worden gebruikt. Dompel de kralen in de oplossing door kort draaien van de buis. Incubeer gedurende minstens 10min bij kamertemperatuur. </li><li> Spot 2μl matrix (2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB), 10mg/ml in water) op een MALDI richtplaat. Damp het oplosmiddel onder vacuüm matrix leidt tot homogene matrix chemische kristallen. </li><li> Spot 2μl van de ontzout monsteroplossing op de top van de matrix kristallen op het doel plaat. Wilt u een groot aantal monsters spot alleen blijven spotten voor een maximum van 3 minuten. Deze keer-frame zorgt ervoor dat de eerste gespot monster niet droog is nog niet. Wachten op een extra 2min aan een grondige vermenging van opnieuw opgelost matrix en monster oligosaccharide moleculen in de laatste gespot monster te verzekeren. Dan droog het doelwit plaat onder een vacuüm. Het monster / matrix mix moet uitkristalliseren in minder dan 1min tot homogene kristallisatie mogelijk te maken. </li><li> Plaats richtplaat in een MALDI-TOF massaspectrometer. De machine moet worden ingesteld op een positieve reflectron mode met een versnelde spanning van 20000V en een vertraging van 350 nm, het geselecteerde massabereik moet worden 500-3.000 Da (kan veranderen afhankelijk van de te verwachten oligomeren). Start het afvuren van de laser en het verzamelen van 100-200 spectra per monster, die worden samengesteld om een ​​representatief gemiddelde spectrum (figuur 2A) te genereren. Ionen die specifieke oligosacchariden kunnen worden geïdentificeerd door hun massa meer dan lading (m / z) verhouding. De ionenintensiteiten (piekhoogte) van alle ionen van de rente moeten worden toegevoegd tot 100% wat resulteert in de relatieve overvloed van elk oligosaccharide in de steekproef (figuur 2B). </li></ol> 4. In situ analyse Olimp Olimp kan ook direct worden gebruikt op het weefsel het weglaten van elke muur voorbereiding stappen. Als voorbeeld geëtioleerde hypocotylen van Arabidopsis als een plantenweefsel bron worden gebruikt. Nogmaals, is een endoglucanase gebruikt om de structuur van de hemicellulose xyloglucan te bepalen. Enzym en weefsel materiaal kan worden vervangen, afhankelijk van de gewenste analyse met behulp van dezelfde procedure. <ol><li> Oogst een geëtioleerde zaailing en plaats deze op een lege MALDI richtplaat en laat de zaailing drogen. </li><li> Voeg 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, opgelost in 50 mM ammoniumnitraat formate, pH4.5) op het gedroogde zaailing op de gewenste positie. Zorg ervoor dat het enzym laten vallen deels raakt het doel plaat. </li><li> Plaats de MALDI richtplaat in een gesloten container met verzadiging van vocht te voorkomen dat het enzym vallen uitdroogt. Incubeer de plaat in de kamer voor een6h bij 37 ° C. </li><li> Droog de MALDI richtplaat met de plant weefsel en het enzym vallen onder vacuüm. </li><li> Voeg 0.5μl matrix (DHB, 10 mg / l) op de top van elke gedroogde enzym plek. Laat het staan ​​voor 2min. </li><li> Droog de MALDI richtplaat onder vacuüm. </li><li> Analyseer monsters met de MALDI-TOF. Plaats richtplaat met het weefsel en het enzym / matrix spot (s) in een MALDI-TOF massaspectrometer. De machine moet worden ingesteld op een positieve reflectron mode met een versnelde spanning van 20000V en een vertraging van 350 nm, het geselecteerde massabereik moet worden 500-3.000 Da (kan veranderen afhankelijk van de te verwachten oligomeren). </li><li> Start het afvuren van de laser op de matrix / monster kristallen NEXT om het weefsel. Zorg ervoor dat u niet het weefsel zelf getroffen, zoals in een dergelijk geval de tijd van de vlucht van de moleculen zal worden uitgeschakeld. Verzamel rond 20-50 spectra per spot, die worden samengesteld om een ​​representatief gemiddelde spectrum (figuur 3) te genereren. Ionen die specifieke oligosacchariden kunnen worden geïdentificeerd door hun massa meer dan lading (m / z) verhouding. De ionenintensiteiten (ion hoogte) kan worden gemeld en alle ionen van belang moeten worden opgeteld tot 100% wat resulteert in de relatieve overvloed van elke oligosacchariden in de steekproef. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een Olimp analyse van de hemicellulose xyloglucan aanwezig is in Arabidopsis zaailingen is weergegeven in figuur 2. Als gevolg van verschillen in de massa van de ionen en de bekende goed gekarakteriseerd enzym (endoglucanase) specificiteit van de ionen kunnen worden toegewezen aan specifieke oligosaccharide structuren (Figuur 2A). Uiteraard kunnen structurele isomeren niet te onderscheiden. Het uitgangspunt voor de bepaling van de relatieve overvloed van de verschillende oligosacchariden (figuur 2B) is dat hun massa spec respons factor is zeer vergelijkbaar voor de oligosacchariden. Zoals hier weergegeven, is de Olimp kwantificering is zeer reproduceerbaar. Houd er echter rekening mee dat de robuustheid van de methode is sterk afhankelijk van de signaal-ruis verhoudingen van de verschillende oligosaccharide ionen. Bijvoorbeeld besmetting met zouten of lagere hoeveelheden oligosacchariden kunnen afnemen die verhouding. De Olimp analyse van het weefsel zelf (in situ analyse) maakt de studie van zeer kleine en gedefinieerde gebieden en brengt heel weinig monstervoorbereiding. In het voorbeeld hier gepresenteerde (figuur 3) geen kwalitatieve (zelfde ionen), maar kwantitatieve verschillen (variatie in de ionenintensiteiten) werden waargenomen tussen de shoot en de root-weefsel van de Arabidopsis zaailing. Permutaties van de Olimp-methode kan dus leiden tot weefsel "beeldvorming". <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van de Olimp procedure met behulp van hele Arabidopsis zaailingen als een plant bron. Eerst wordt het weefsel geweekt en celwand materiaal wordt voorbereid (foto heeft gewijzigd van Fujino et al.. 10). Dan oligosacchariden van een bepaalde muur polysaccharide worden vrijgegeven met een specifieke hydrolase. Tenslotte worden de relatieve abundanties van de oplosbare oligosachariden bepaald met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Relatieve overvloed aan xyloglucan oligosacchariden in geëtioleerde zaailingen van Arabidopsis, zoals bepaald door Olimp. A) Representatieve xyloglucan oligosaccharide massaspectrum; elk ion vormt een specifieke oligosaccharidestructuur, kunnen structurele isomeren niet te onderscheiden. B) Overeenkomstige staafdiagram voor de bepaling van de relatieve oligosaccharide overvloed. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. In situ Olimp analyse met behulp van geëtioleerde zaailingen van Arabidopsis als voorbeeld. Elk enzym / spijsvertering druppel (gekleurde cirkels) kunnen onafhankelijk van elkaar worden geanalyseerd en een bijbehorende massa spectra kunnen worden verkregen en geanalyseerd. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Olimp spectrum van de hemicellulose xylaan verkregen door het verteren van Miscanthus blad materiaal met een xylanase (Megazyme).

<ol><li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li>
<li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li>
<li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xyloglucan-specific+endo-beta-1%2C4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus%3A+expression+cloning+in+yeast%2C+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li>
<li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa%3A+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation%3A+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+%22%5BJournal%5D)">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1%2C2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li>
<li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li>
<li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils%2C+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li>
<li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li>
<li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan%2C+a+major+primary+cell+wall+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li>
<li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+liquid+chromatography%2C+capillary+electrophoresis%2C+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li>
</ol>

De hier gepresenteerde methode Olimp maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van polymeren in de extracellulaire matrices. Olimp combineert de enzymatische release van oligomeren met latere MALDI-TOF-analyse. Het genereren van een MALDI-TOF spectrum duurt minder dan een minuut, vandaar Olimp is geschikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder high-throughput studies zoals mutant schermen. Olimp is niet beperkt tot plant polysacchariden, maar kan mogelijk worden toegepast op een breed scala aan polymeren, alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke hydrolytische enzymen. Echter, een beperking van Olimp is dat een absolute rijkdom van het polymeer niet kan worden verkregen. Zoals eerder vermeld Olimp kan worden gebruikt om de structuur van een verscheidenheid aan polysacchariden aanwezig zijn in de extracellulaire matrix van een diversiteit van soorten te bestuderen. Als voorbeeld, Figuur 4 geeft een Olimp spectrum van de belangrijkste hemicellulose in grassoorten, xylaan. Hier was celwand materiaal afkomstig van de gematigde gras Miscanthus verteerd met behulp van een xylanase.

<table><tbody><tr><td>2,5-dihydroxybenzoëzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL in water</td></tr><tr><td>BioRex MSZ 501(D) harsen</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>Endoglucanase</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Xylanase M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>3mm metalen kogels</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>Kogelmolen</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-targetplaat</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümmanifold</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümpomp</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

oligo mass profiling (olimp) van extracellulaire polysacchariden

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

Het directe contact van de cellen aan de omgeving wordt bemiddeld in veel organismen door een extracellulaire matrix. Een veel voorkomende aspect van de extracellulaire matrices is dat ze complexe suikers groepen in de vorm van glycoproteïnen, proteoglycanen, en / of polysacchariden bevatten. Voorbeelden hiervan zijn de extracellulaire matrix van mensen en dierlijke cellen voornamelijk bestaande uit fibrillair eiwitten en proteoglycanen of de polysaccharide gebaseerde celwanden van planten en schimmels, en de proteoglycan / glycolipide op basis van de celwanden van bacteriën. Al deze glycostructures spelen een belangrijke rol in cel-cel en cel-tot-omgeving communicatie en signalering. Een buitengewoon complex voorbeeld van een extracellulaire matrix aanwezig is in de muren van hogere planten. Hun muur is bijna helemaal gemaakt van suikers, tot 75% droog gewicht, en bestaat uit de meest voorkomende biopolymeren aanwezig zijn op deze planeet. Daarom wordt onderzoek gedaan hoe deze materialen best te gebruiken als een koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof voor petrochemische producten afgeleid van fossiele brandstoffen te vervangen. De belangrijkste uitdaging voor brandstof conversie blijft de weerspannigheid van de muren om enzymatische of chemische degradatie als gevolg van de unieke glycostructures aanwezig zijn in dit unieke biocomposite. Hier presenteren we een methode voor de snelle en gevoelige analyse van plantaardige celwand glycostructures. Deze methode Oligo Mass Profiling (Olimp) is gebaseerd op de enzymatische release van oligosachariden uit wandmaterialen faciliteren specifieke glycosylhydrolases en daaropvolgende analyse van het opgeloste oligosaccharide mengsels met behulp van matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS ) 1 (figuur 1). Olimp vereist muren van slechts 5000 cellen voor een volledige analyse, kunnen worden uitgevoerd op het weefsel zelf 2, en vatbaar is voor high-throughput-analyses 3. Hoewel het absolute bedrag van de opgeloste oligosacchariden niet kan worden bepaald door Olimp de relatieve overvloed van de verschillende oligosaccharide ionen kunnen worden afgebakend van de massa spectra geeft inzichten over het substitutie-patroon van de inheemse polysaccharide aanwezig is in de muur. Olimp kan worden gebruikt om een breed scala aan wand-polymeren, alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke enzymen 4 te analyseren. Bijvoorbeeld, voor de analyse van polymeren in de plant aanwezige celwand enzymen beschikbaar zijn voor de hemicellulose xyloglucan met behulp van een xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylaan met behulp van een endo-β-(1-4)-xylanase 6,7 analyseren , of voor pectinestoffen polysacchariden met behulp van een combinatie van een polygalacturonase en een methylesterase 8. Bovendien kan met behulp van dezelfde principes van Olimp glycosylhydrolase en zelfs glycosyltransferase activiteiten worden gecontroleerd en vastgesteld 9.

Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Het directe contact van cellen met de omgeving wordt bij veel organismen gemedieerd door een extracellulaire matrix. Eén gemeenschappelijk aspect van extracellulaire matrices is ...

De oligo massa-profilering of Olympic-experiment zoals hier getoond, maakt het mogelijk om snel inzicht te verkrijgen in de structuur van polymeren in de extracellulaire matrix of celwand van een organisme. In dit geval worden celwanden geprepareerd uit plantenzaailingen door eerst cellulaire componenten te verwijderen met 70%ethanol. Het doelwit-wandpolymeer wordt vervolgens verteerd met een specifieke hydrolase die specifieke wandcomponenten solubiliseert in de vorm van oligomeren.Een alternatieve aanpak is om de celwand direct op het weefsel te verteren met het enzym in C twee. De relatieve overvloed van de vrijgekomen ligamenten wordt bepaald via MALDI-massaspectrometrie en statistische analyse. Hallo, ik ben Marcus Polly van het Energy Biosciences Institute hier aan de University of California in Berkeley.Hallo, ik ben Marcus Re. En ik ben Asha Giller. Ook van het Energy Biosciences Institute. Organismen zijn omgeven door extracellulaire matrices die, afhankelijk van het organisme, bestaan uit complexe polymeernetwerken.Een snelle en gevoelige manier om de extracellulaire matrix te beoordelen is een methode die we oli-massaprofiel noemen (kort voor oleum), die we u vandaag zullen demonstreren. Deze procedure kan ook direct op het plantweefsel worden uitgevoerd. Laten we beginnen.Begin deze procedure door de extracellulaire matrix of de celwand van plantenweefsels te isoleren. Oogst vijf arabidopsis-zaailingen of een gelijkwaardige hoeveelheid ander plantmateriaal en breng deze over naar een reactiebuis van 1,5 milliliter. Zorg ervoor dat het materiaal onderin de buis wordt geplaatst.Voeg twee metalen kogels van drie millimeter toe aan de reactiebuis en vries deze snel in met vloeibare stikstof. Maal het bevroren monster vervolgens gedurende 2,5 minuten bij 25 hertz in een kogelmolen. Voeg na het malen van het materiaal één milliliter 70% waterige ethanol toe aan het monster.Verwijder de metalen kogeltjes met een magneet en vortex grondig. Deze behandeling solubiliseert de meeste eiwitten en celorganellen. Centrifugeer het monster bij 14.000 RPM gedurende 10 minuten om het alcohol-onoplosbare residu, dat het celwandmateriaal vertegenwoordigt, neer te slaan. Aspireer voorzichtig het supernatant, waarbij u er op let dat het pellet niet wordt verstoord.Voeg één milliliter chloroform-methanoloplossing toe aan het pellet dat in de buis is gebleven en vortex grondig. Om het pellet opnieuw te suspenderen en te centrifugeren; de chloroform-methanol extraheert hydrofobe verbindingen zoals lipiden. Verwijder na centrifugatie het supernatant en droog het pellet volledig met behulp van een vacuümcentrifuge. Hiermee is de isolatie van het celwandmateriaal voltooid, dat nu behandeld kan worden om specifieke liganden op te brengen.Het hier gedemonstreerde voorbeeld is de solubilisatie van Xlo-glucaan, de belangrijkste hemicellulose aanwezig in de celwanden van dicotyle planten zoals Arabidopsis. Xlo-glucaan is een polymeer bestaande uit een glucaan-backbone die zwaar gesubstitueerd is met andere suikerresiduen. Voor de solubilisatie van dit polymeer wordt een fungale endoglucanase gebruikt om deze hemicellulose op te lossen. Resuspendeer het droge, geïsoleerde celwandpellet in 25 µL 50 mM ammoniumformiaat pH 4.5 en voeg 0,2 units endoglucanase toe. Vortex de suspensie en centrifugeer de vloeistof.Plaats de buis in een mengapparaat en laat de celwanden 16 uur lang digesteren bij 37 °C onder schudding. Bij 300 RPM. Wanneer de digestie van de geïsoleerde celwand is voltooid, wordt het oplosmiddel verwijderd met een vacuümcentrifuge, waarna de vrijgekomen oligosachariden via massaspectrometrie worden geanalyseerd; zouten en enzymen worden uit het gedigesteerde monster verwijderd met behulp van kationenwisselharsbolletjes van Biox MSD 5 0 1.De kraaltjes worden eerst geconditioneerd door de benodigde hoeveelheid in een lege kolom te plaatsen en de kraaltjes te wassen met overvloedige hoeveelheden water. Voeg vijf tot 10 geconditioneerde biox-kationkraaltjes toe aan het gedigereerde en gedroogde monster. Voeg vervolgens 10 µL water toe voor kleinere hoeveelheden materiaal.Vijf µL water kan worden gebruikt. Dompel de kralen onder in de oplossing door de buis kortstondig te centrifugeren en laat dit ten minste 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur terwijl het digestaat samen met de kralen incubeert. Breng twee µL DHB-matrix aan op een MALDI-targetplaat.Verdampt het matrixoplosmiddel onder vacuüm tot er matrixkristallen zijn gevormd en breng vervolgens 2 µL van de ontzoute digestoplossing aan op de matrixkristallen op de targetplaat. Het oplosmiddel van de samplematrixspot wordt opnieuw onder vacuüm verdampt.Het is belangrijk om een passende mengtijd voor de vloeistof van de monstermatrix aan te houden voorafgaand aan de kristallisatie, zoals in detail beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Zodra het monster is opgedroogd, wordt de doelplaat in een MALDI-massaspectrometer geplaatst. Stel het apparaat in op de positieve modus met een versnellingsspanning van 20 000 volt en een vertraging van 350 nanometer.Het geselecteerde massa-bereik voor deze hemicellulose-ligamenten is 500 tot 3000 Daltons. Het massa-bereik moet worden aangepast aan de grootte van de verwachte ligamenten. Start de laser en verzamel 100 tot 200 spectra per monster, die worden samengesteld om een representatief gemiddeld spectrum te genereren.Dit is het hemicellulose-oly-spectrum. De oly-methode die in deze video wordt gedemonstreerd, kan ook direct op het plantweefsel worden toegepast, waarbij alle stappen voor de wandpreparatie worden overgeslagen. Deze in situ analyseprocedure wordt gedemonstreerd op Arabidopsis-zaailingen die in het donker zijn gekweekt.Het preparaat wordt direct op een targetplaat geplaatst en aan de lucht gedroogd tot de zaailing op de plaat droog is. Voeg 0,5 µL van de juiste enzymbuffer-mix toe op de gewenste posities. Zorg ervoor dat de enzymdruppel zowel het weefsel als de targetplaat gedeeltelijk raakt.Plaats de MALDI-targetplaat in een gesloten container met verzadigde luchtvochtigheid om uitdroging van de enzymdruppels te voorkomen. Incubeer de plaat 16 uur bij 37 °C. Droog na afloop van de incubatieperiode de enzymvlekken onder vacuüm en voeg 0,5 µL van de vloeibare DHB-matrix toe op elke gedroogde enzymvlek.Droog vervolgens de MALDI-targetplaat onder vacuüm. Om de NC te analyseren, worden twee monsters gebruikt. Plaats de targetplaat, inclusief de enzymmatrixspots van het weefselmonster, in een MALDI-TOF-massaspectrometer en registreer de massaspectra met dezelfde instellingen als voor het monster van de geïsoleerde celwand.Begin met het beschieten van de matrix met de laser. Neem monsters van de kristallen naast het weefsel. Zorg ervoor dat het weefsel zelf niet wordt geraakt, omdat in dat geval de vluchttijd van de moleculen onjuist zal zijn.Verzamel ongeveer 20 tot 50 spectra per spot en voeg deze samen om een representatief gemiddeld spectrum te genereren. Dit is een representatief gemiddeld spectrum van de oligosachariden afgeleid van het HemosIL-glucaan dat aanwezig is in AOP's. De intensiteiten van de ionen, of de ionhoogte van alle relevante ionen, worden opgeteld tot 100%, wat resulteert in de relatieve abundantie van de verschillende oligosachariden.De resultaten van de NC two OMP-methode zijn vergelijkbaar. Elke enzymatische digestiedruppel, aangeduid met een gekleurde cirkel, kan onafhankelijk worden geanalyseerd, waarbij de overeenkomstige massaspectra kunnen worden verkregen en geanalyseerd. Oola kan ook worden uitgevoerd op andere polymeren van de extracellulaire matrix, mits een geschikt hydrolyserend enzym beschikbaar is.Als voorbeeld is hier een oola-spectrum van de hemo cellulose cylin die aanwezig is in het bio-energiegewas. Ms.Canus verkreeg de gepresenteerde gegevens terwijl materiaal van een mecampus-blad werd gedigesteerd met xin. Raadpleeg voor de toewijzing van structuren aan de ionen het bijbehorende protocol.We hebben zojuist de procedure voor oligo mar massaprofilering op exo cellulaire metrieken getoond. Polymeren, bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de beste resultaten kunnen worden behaald wanneer homogene matrixresultaten worden verkregen voor de OV MS-analyse. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met de experimenten.

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Source: Hu, Y., et al. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of thin-layer chromatography (TLC) to assess the degradation of exopolysaccharides (EPS) by human fecal microbiota. EPS fragments in fermentation supernatants are separated based on size and polarity using TLC, then visualized as colored bands following carbohydrate-specific staining.

Performing Thin-Layer Chromatography to Assess Bacterial Exopolysaccharide Degradation

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van het reducerende einde (RE) en de interne glycosylsequenties van heteroxylanen door het RE te labelen met 2-aminobenzamide voorafgaand aan enzymatische (endoxylanase) hydrolyse en vervolgens analyse van de resulterende oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR).

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Hier worden protocollen voor de isolatie van cyanobacteriële vrijkomende koolhydraatpolymeren en isolatie van hun exoproteomes beschreven. Beide procedures belichamen belangrijke stappen voor het verkrijgen van polymeren of eiwitten met hoge zuiverheids graden die kunnen worden gebruikt voor verdere analyse of toepassingen. Ze kunnen ook eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de gebruiker.

Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten

Dit protocol beschrijft een iSCAT-gebaseerde beeldverwerking en single-particle tracking-benadering die het gelijktijdige onderzoek van de moleculaire massa en het diffusieve gedrag van macromoleculen die interageren met lipidemembranen mogelijk maakt. Stapsgewijze instructies voor monstervoorbereiding, massa-naar-contrastconversie, filmacquisitie en nabewerking worden gegeven naast aanwijzingen om mogelijke valkuilen te voorkomen.

Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Leer OLIMP voor snelle analyse van plantencelwandglycostructuren met MALDI-TOF/MS. Deze methode detecteert oligosacchariden uit enzymatische vertering voor onderzoek naar biomassa en biobrandstoffen.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Meer video's verkennen