Name: Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer calpaïne-activiteit meten in vaste en levende cellen door flowcytometrie met fluorescerende substraten. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van protease-functie in leukemie en lymfoom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research, de leukemie en lymfoom Society van Canada en de Stichting Lymfoom van Canada.

Reagentia voor te bereiden Opmerking: Alle PBS bevat Ca 2 + en Mg 2 + <ol><li> Detectie Reagens Voeg 20μM 7-amino-4-chloormethyl coumarine, t-BOC-Leucine-methionine amide (BOC-LM-CMAC) op kamertemperatuur PBS. Elke cel schorsing vereist 2 ml detectie reagens. </li><li> 1% Paraformaldehyde (vaste cellen) Verdunnen 4% paraformaldehyde stockoplossing bij kamertemperatuur PBS. Aliquot 1 ml 1% paraformaldehyde aan elke FACS buis. Drie FACS buizen zijn nodig voor elke experimentele conditie (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 nodig 9 FACS buizen) </li><li> PD150606 (calpaïne-remmer) Reconstrueren PD150606 in DMSO bij een uiteindelijke concentratie van 100 mm. Bescherm dit reagens en alle cellen behandeld met het tegen licht voor de duur van dit experiment. </li><li> PD98059 (MEK1-remmer) Reconstrueren PD98059 in DMSO bij een uiteindelijke concentratie van 50 mm. </li></ol> Cellen voor te bereiden <ol><li> Grow 32Dkit cellen op 5 x 10 5 tot 1 x 10 6 cellen per ml bij Opti-MEM media aangevuld met 5% foetaal runderserum, WEHI-3 supernatant als een bron van IL-3 (of een andere bron voor IL-3 van dergelijke als recombinant eiwit), 0,1% 2-mercapto-ethanol en antibiotica. </li><li> Verzamel 12 x 10 6 32Dkit cellen in drie 15ml Falcon buizen (4 x 10 6 cellen per buis). </li><li> Pellet de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten bij 15 ° C. </li><li> Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 2 ml PBS kamertemperatuur. </li><li> Behandel een celsuspensie met 50μM PD150606. Zorg ervoor dat het monster is beschermd tegen licht door het bedekken van de Falcon buis met aluminium folie. Vortex kort daarna incubeer gedurende twintig tot dertig minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Behandel het tweede celsuspensie met 20μM PD98059. Het bord van de cellen in een 35-mm weefselkweek schotel en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li></ol> Calpaïne Assay in vaste cellen <ol><li> Terwijl de monsters worden incubatie met PD150606, beginnen met het calpaïne test op de onbehandelde monsters. Begin door het toevoegen van 2 ml detectie reagens voor elke celsuspensie. Onmiddellijk toevoegen 1 ml van de celsuspensie / detectie reagens mengsel aan de vooraf bereide FACS buizen met 1% paraformaldehyde (0 minuten tijd punt). </li><li> Incubeer celsuspensies met detectie reagens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 ml van de celsuspensie op een FACS buis met 1 ml 1% paraformaldehyde. </li><li> Ga door het incuberen van de celsuspensies met detectie mengsel voor nog eens 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 ml van de celsuspensie op een FACS buis met 1 ml 1% paraformaldehyde. </li><li> Herhaal calpaïne test op 32Dkit cellen die zijn behandeld met remmers. </li><li> Fix-cellen 's nachts in het donker bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag pellet de cellen bij 1800 tpm gedurende 5 minuten bij 15 ° C. </li><li> Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 750uL PBS. Plaats cellen op ijs en te houden in het donker. </li></ol> Acquire Gegevens voor vaste cellen <ol><li> Analyseer de cellen met behulp van een LSR II (BD Bioscience). Filters zijn ingesteld voor de Lightwave Xcyte (UV) laser, excitatie lijn 355nm en laser 25mW vermogen, emissie van 405 en 450 nm voor substraat en product respectievelijk. Band pass filters voor substraat en product zijn 405/20 en 450/50. Lange pass filters voor substraat en product zijn 405 en 450. Het PMT voltage is ingesteld op 350-375 voor de ondergrond en 325-350 voor het product. </li><li> Set-up een BD FACSDiva experiment met de volgende parameters: voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing, Indo-1 blauw (log), Indo-1 Violet (log). Op het werkblad het instellen van de volgende grafieken: voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing dot plot met een hek op levende cellen (figuur 1a), Indo-1 blauw histogram, Indo-1 Violet histogram, Indo-1 blauw versus Indo-1 Violet dot plot. </li><li> Kalibreer het LSR II met AlignFlow en AlignFlow plus fluorescerende beads (Invitrogen). De PMT spanning moet worden aangepast aan de top van de kraal fluorescentie histogram plaats in hetzelfde kanaal voorafgaand aan elk experiment. </li><li> Begin het verwerven van gegevens met behulp van de 32Dkit cellen op het 0 minuten tijdstip. Stel parameter spanningen als nodig is. Verwerven en op te nemen 10.000 gebeurtenissen per monster. </li><li> Herhaal aanwinst voor elk monster, het spoelen van de machine met FACS buffer tussen elke buis. </li><li> De gegevens exporteren. Zorg ervoor dat LSR II wordt gereinigd volgens de richtlijnen instituut. </li></ol> Calpaïne Assay in levende cellen <ol><li> Bereid de celsuspensies als hierboven, met geen PD150606. Breng de monsters naar het LSR II en het opzetten van filters en parameters zoals hierboven. Stel het werkblad zoals hierboven. Omvatten een grote dot plot toont Indo-1 blauw versus tijd. Stel het programma om het maximum aantal te verwervenBER van gebeurtenissen (geen stop gate). </li><li> Voeg 50μM PD150606 aan een celsuspensie van 32Dkit cellen. Houd het monster in het donker en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten. </li><li> Begin het verwerven van gegevens over de 32Dkit celsuspensie met geen PD150606. Gebruik een laag debiet van 200-300 gebeurtenissen per seconde. Na 30 seconden tot 1 minuut te verwijderen van de slang uit de machine. Voeg 20μM BOC-LM-CMAC naar de cellen. Vortex kort dan verder het verwerven van de gegevens. </li><li> Verkrijgen gegevens voor 10-20 minuten of tot de calpaïne activiteit plateaus. </li><li> Herhaal stap 3 en 4 met 32Dkit cellen behandeld met PD150606. </li><li> De gegevens exporteren. Zorg ervoor dat LSR II wordt gereinigd volgens de richtlijnen instituut. </li></ol> Calpaïne Assay in complexe (Mixed) celpopulaties * Dit experiment zal identificeren 32Dkit cellen in een celsuspensie geoogst uit een muis-milt. <ol><li> Oogst de milt van elke muis. Lyse de rode bloedcel met NH 4 Cl gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid enkele cel suspensies in 2 ml PBS. </li><li> Verdeel elke cel suspensie in twee. Behandel een celsuspensie met 50μM PD150606 gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Ga te werk zoals hierboven voor de calpaïne test in vaste cellen (Stappen 1-6) </li><li> Zuig het supernatant. Was de cellen in 500μL PBS. Zuig het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen in 200μL kleuring buffer met 2% BSA. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid de primaire antilichaam (FITC anti-muis CD117). Het antilichaam moet worden gebruikt bij een 1:200 verdunning in vlekken buffer. Zorg ervoor dat het antilichaam wordt bewaard in het donker. </li><li> Voeg 200μL primaire antistof naar de cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 400μL PBS om het volume voor flowcytometrie te verhogen. Plaats de cellen op ijs en te houden in het donker. </li><li> Ga te werk zoals beschreven in Acquire gegevens voor vaste cellen. Voeg FITC om de parameters en omvatten een histogram voor FITC op het werkblad. </li></ol> Analyse en representatieve resultaten <ol><li> Analyseren van gegevens met behulp van FlowJo (Treestar). Gate op levende cellen op basis van voor-en zijwaartse verstrooiing profiel (figuur 1a). Bepaal de gemiddelde fluorescentie voor de Indo-Blue van de levensvatbare cel poort (Figuur 1b). </li><li> a) Voor het Gemengd celpopulatie <ul><li> gebruik van FITC fluorescentie op histogrammen en dot plots aan de 32Dkit populatie </li><li> Bepaal de gemiddelde fluorescentie voor de Indo-Blauw van de bevolking 32Dkit </li></ul></li><li> Gebruik Microsoft Excel de grafiek van de gemiddelde fluorescentie (Figuur 2a). Bereken de helling van de lijn tussen de 5 en 10 minuten. Grafiek de helling als een staafdiagram te calpaïne activiteit te bepalen in de cellen (Figuur 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figuur 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1a"> Figuur 1a. Bepaling van levende cellen op basis van voor-en zijwaartse verstrooiing profiel. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figuur 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1b"> Figuur 1b. De gemiddelde fluorescentie veranderen in de loop 10 minuten de tijd natuurlijk. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figuur 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2a"> Figuur 2a. Vertegenwoordiger grafiek van de gemiddelde fluorescentie. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figuur 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2b"> Figuur 2b. Calpaïne activiteit in 32Dkit cellen met remmers.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

De calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen 32Dkit is bepaald in deze video protocol. Behandeling van de cel lijn met de calpaïne remmer PD150606 resulteerde in complete remming van calpaïne activiteit in de cellen. Daarnaast is behandeling met de remmer MEK1 PD98059 resulteerde in complete remming van calpaïne activiteit in de cellen. ERK is een belangrijke activator van calpaïne-2 3. Deze resultaten suggereren dat calpaïne-2 activiteit is overheersend in de 32Dkit cellen. Huidige werk in ons labora...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Los 4 g paraformaldehyde op in 100 mL PBS. Verwarm het monster in een zuurkast onder roering totdat de oplossing helder is.&lt;br/&gt;Laat afkoelen en bewaar vervolgens bij 4 °C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gebruik vers gereconstitueerd PD150606 voor maximale calpaïne-inhibitie.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescente beads FACS-buisjes</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;Supernatant van WEHI-3-cellen wordt in deze experimenten gebruikt als bron van IL-3. Elke batch WEHI-3-supernatant wordt getitreerd om de optimale concentratie voor de groei van 32Dkit-cellen te bepalen. </td></tr></tbody></table>

het meten van calpaïne activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains zijn alomtegenwoordig intracellulaire, calcium-gevoelige, neutrale cysteine ​​proteases<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains spelen een cruciale rol in vele fysiologische processen, met inbegrip van seinen, cytoskelet remodeling, regulatie van genexpressie, apoptose en voortgang van de celcyclus<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains zijn betrokken bij tal van pathologieën waaronder spierdystrofieën, kanker, diabetes, de ziekte van Alzheimer en multiple sclerose<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaïne regelgeving is complex en onvolledig begrepen. mRNA en eiwit-concentraties zijn gecorreleerd slecht met de activiteit, beperking van het gebruik van gen-of eiwitexpressie technieken om calpaïne activiteit te meten. Deze video protocol details ontwikkelde een flowcytometrische analyse in ons laboratorium voor het meten van calpaïne activiteit in vaste en levende cellen. Deze methode maakt gebruik van de fluorescent substraat BOC-LM-CMAC, die specifiek wordt gesplitst door calpaïne, op maat calpaïne activiteit.<sup&gt; 2</sup&gt; In deze video, is calpaïne activiteit in de vaste en levende muizen 32Dkit leukemie cellen, alleen of als onderdeel van een splenocyten bevolking gemeten met behulp van een LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cellen blijken te hebben verheven activiteit in vergelijking met normale splenocyten.

Dit artikel zal detail het protocol voor het meten van calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen met behulp van flow cytometrie.

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpaïnen zijn alomtegenwoordige intracellulaire, calciumgevoelige, neutrale cysteïneproteasen 1. Calpaïnen spelen een cruciale rol in veel fysiologische processen, ...

Calpïnes zijn alomtegenwoordige, intracellulaire calciumgevoelige, neutrale cysteïneproteasen die cruciale rollen spelen in veel fysiologische processen, waaronder signalering, remodellering van het cytoskelet, regulatie van genexpressie, apoptose en celcyclusprogressie. Om de calpaïne-activiteit in gefixeerde en levende cellen te meten, wordt het fluorescente substraat BUC, LMC MAC toegevoegd. Buc LMC MAC wordt specifiek gesplitst door calpaïne, wat resulteert in een toename van de fluorescentie. De verandering in fluorescentie wordt gemonitord via flowcytometrie, waaruit een verhoogde calpaïne-activiteit in 30 2D kit-cellen blijkt in vergelijking met normale cytes.Hallo, ik ben Christina Farr van het laboratorium van Dr. Stewart Berger aan de Universiteit van Toronto, verbonden aan de afdeling Immunologie en het University Health Network. Vandaag laat ik u zien hoe u calpain-activiteit in gefixeerde en levende cellen kunt meten met behulp van een assay op basis van flowcytometrie. Wij gebruiken deze assay in ons laboratorium om de calpain-activiteit in leukemie- en lymfoomcellen te bestuderen.Laten we beginnen. Bereid vóór aanvang van de experimenten de benodigde reagentia voor,

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the labeling of neuronal cells with antibodies for mitochondrial respiratory chain complexes, mitochondrial DNA-associated protein, and mitochondrial outer membrane protein, followed by flow cytometry to quantify their levels.

Measurement of Multiple Mitochondrial Parameters in Neurons using Flow Cytometry

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Verstrekken van eencellige gevoeligheid, is real-time stroom cytometry uniek geschikt voor het kwantificeren van multimodale receptor functies van levende culturen. Met behulp van neurale volwassen voorlopercellen, de P2X7 receptor functie evalueerden via calcium toestroom gedetecteerd door calcium indicator kleurstof, transmembraan porie vorming door ethidium bromide opname en fagocytose met behulp van fluorescerende latex kralen.

Real-Time Live-cel Stroom Cytometry te onderzoeken Calcium toestroom, porie vorming en fagocytose door P2X7 receptoren in volwassen neurale voorlopercellen

Hier beschrijven we een reeks methoden voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met membranen van cellen of microvesicles.

Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Hier presenteren we een protocol om de overleving na stress in gistmonsters te kwantificeren. De test maakt gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen, SYTO 9 en propidiumjodide (PI), om de integriteit van het plasmamembraan te kwantificeren. Het maakt gebruik van flowcytometrie om kwantitatieve en reproduceerbare schattingen te geven van de levende, dode en beschadigde celfracties voor monsters na oxidatieve stress.

Een geoptimaliseerde LIVE/DEAD-test in combinatie met flowcytometrie voor het kwantificeren van overleving na stress in gistcellen

Leer calpaïne-activiteit meten in vaste en levende cellen door flowcytometrie met fluorescerende substraten. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van protease-functie in leukemie en lymfoom.

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Meer video's verkennen