Name: Dechorionation van Medaka Embryos en Cell Transplantation voor de generatie van chimaeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer dechorionatie en celtransplantatie in medaka-embryo's voor genetisch onderzoek. Deze methode maakt chimaeraproductie mogelijk om genautonomie in ontwikkelingsbiologie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een subsidie ​​van de MRC aan M. FS.

1. Ontwikkeling van de embryo's <ol><li> Als ze zijn gelegd, worden de eieren geclusterd vanwege de gehechtheid filamenten op het chorion. Te laten embryo's normaal ontwikkelen, is het noodzakelijk te scheiden eieren. Tangle en snijd bevestiging filamenten door houden de bijlage filamenten met twee tang. </li><li> Na unclustering, zijn eieren gescheiden van uitwerpselen en algen en overgebracht naar verse embryo medium bij een maximale dichtheid van 40 eieren per 6cm petrischaal. </li><li> Medaka embryo's te ontwikkelen iets langzamer dan de zebravis bij 27 ° C. De timing van het uitbroeden is verschillend tussen de twee soorten; medaka embryo luik van het chorion in 7 dagen en direct aan de slag om te zwemmen en te eten, terwijl de zebravis embryo's uitkomen in 2 dagen, maar beginnen om te zwemmen en te eten in 5-6 dagen. De ontwikkeling van medaka is georganiseerd volgens de enscenering Iwamatsu's 4. </li><li> De ontwikkeling van medaka embryo's kunnen gemakkelijk worden aangepast aan de experimentele plannen door het selecteren van de juiste temperatuur. Ontwikkeling van medaka embryo's kan worden gestopt bij 4 ° C in de vroege ontwikkeling. Na etappe 24 als hartslag begint, kan de ontwikkeling worden vertraagd met behulp van een minimum temperatuur van 18 ° C. </li><li> De timing van het verschijnen van organen / weefsels is iets anders in medaka in vergelijking met zebravissen, dat wil zeggen in medaka somitogenesis optreedt na het begin van de ontwikkeling van de hersenen terwijl in zebravis somitegenesis vooraf ontwikkeling van de hersenen. </li></ol> 2. Het verwijderen van de chorion Het chorion van medaka bestaat uit twee beschermende lagen met een harde binnenste laag en een zachte buitenkant. Zo, een twee-staps protease behandeling in dienst pronase en broedeieren enzym is nodig om deze verwijderen chorion. Eenmaal dechorionated, embryo's moet worden bewaard in 1X BSS. Semi-steriele omstandigheden zal de succesvolle cultuur van dechorionated embryo's, vooral als langere periodes van observatie nodig zijn. Deze omvatten het gebruik van steriele oplossingen (bijv. gesteriliseerd 1x BSS met antibiotica) en hulpmiddelen gesteriliseerd met 70% ethanol gevolgd door spoelen met 1X BSS. Als dechorionated medaka embryo's worden zachter en kwetsbaarder dan dechorionated zebravis embryo's, moet extra zorg worden genomen om te garanderen dat ze niet de lucht of bellen in de pipet contact, omdat dit meteen instorten veroorzaken. Om ervoor te zorgen minimale schade aan embryo's, moet een grote mond warmte geslepen glazen pipet met een pipet pomp worden gebruikt voor het overbrengen van embryo's en een haar lus moet worden gebruikt om embryo's voor observatie oriënteren. Niet-klevende petrischaaltjes moeten worden gebruikt om embryo's te voorkomen die verbonden zijn aan oppervlakken. <ol><li> Voorafgaand aan de dechorionation dient te worden gecontroleerd dat de eieren voldoende zijn gescheiden en gereinigd-up. </li><li> Aangezien zowel pronase en broedeieren enzymen proteïnasen, moeten ze worden bewaard op ijs en het minimaliseren van de blootstelling van embryo's voor deze enzymen. </li><li> Overdracht eieren schuurpapier (P2000 korrel, waterdicht) geplaatst in het deksel van een 9cm petrischaal. Verwijder overtollig medium, maar zorgen voor een voldoende volume blijft om uitdroging te voorkomen van embryo's. </li><li> Zachtjes rollen embryo's voor ongeveer 45-60 seconden tot enkele van de buitenkant haartjes te verwijderen en licht het oppervlak van het chorion (Figuur 1) score. Transfer terug naar de oorspronkelijke embryo's petrischaal en te onderzoeken. Bij het rollen embryo's op schuurpapier de wijsvinger te gebruiken, het toepassen van minimale druk en houden de vinger parallel aan het oppervlak van schuurpapier. Niet rollen meer dan 5-7 embryo's in een keer. Deze voorzorgsmaatregel wordt het risico van verbrijzeling embryo's onder elkaar. </li><li> Vervang ei medium in schotel met 20mg/ml pronase en incubeer embryo's voor 40-60 minuten bij 27 ° C. Zorg ervoor dat embryo's worden voldoende gedekt door pronase en een deksel aanwezig is op de schotel. Ongebruikte pronase worden bewaard op ijs tijdens deze stap zelf-vergisting te minimaliseren en kan worden hergebruikt totdat activiteit verloren (ongeveer 1-2 weken). </li><li> Recover pronase voor hergebruik en was embryo's 5X in embryo medium om sporen van pronase te verwijderen omdat dit het uitkomen enzym te inactiveren worden toegevoegd. </li><li> Verwijder de embryo medium en bedek embryo's met arceringen enzym, waardoor embryo's zitten als een monolaag in de schaal. Als de eieren zitten op de top van elkaar in de schotel, zullen deze aan de onderkant worden verpletterd als de chorion oplost. Bewaar ongebruikte uitkomen enzym op ijs. </li><li> Incubeer embryo's bij 27 ° C en na 15 minuten periodiek de voortgang van het uitbroeden met behulp van een stereomicroscoop. Het zal worden gezien dat een aantal van de maan krater-achtige gaten beginnen te verschijnen in de binnenste laag van het chorion, die al snel oplost na deze verlaten van de zachte buitenste laag van de chorion gemakkelijk verwijderd manually. Het hele proces van het uitkomen kan nemen 15-60 minuten. </li><li> Zodra embryo's afkomstig zijn uit het chorion, overdracht embryo's een petrischaal met 1X BSS. Zorg ervoor dat niet uitkomen enzym naar de 1X BSS door het aanraken van de punt van de pipet op het oppervlak van de BSS waardoor de embryo's om voorzichtig uitrollen. </li><li> Als alle embryo's worden overgebracht van het uitkomen enzym, een definitieve overplaatsing naar een andere verse schotel van 1X BSS. Dit zorgt voor embryo's zijn niet blootgesteld aan resten van het uitbroeden enzym, omdat dit schade aan blootgesteld embryo's. Eenmaal in dit laatste gerecht een embryo's nog steeds het bezit van de buitenste laag van de chorion kan handmatig worden bevrijd met behulp van gesteriliseerde micro-pincet onder de stereomicroscoop. Als embryo's moeten worden ontwikkeld na dechorionation, moet penicilline / streptomycine worden toegevoegd aan de BSS om bacteriële groei te voorkomen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vergelijking van gewalst en uitgerold embryo's tijdens dechorionation. Observeer hoe de opgerolde embryo's in paneel B de haren te zien op de uitgerold embryo's in paneel A. gebrek aan 3. Montage dechorionated embryo's Agarose inbedding is handig voor langere periodes van beeldvorming (bv. time-lapse imaging) voor levende embryo's en voor gedetailleerde observaties van vaste embryo's. Tijdens de gastrulatie en de vroege organogenese (stadium 14 tot en met stap 28), medaka embryo's vertonen golven van ritmische bewegingen over de contractiele periderm, een tissue laag die zowel de ontwikkelende embryo en de dooier 5. Embryo's worden behandeld met 3,5 mm 1-heptanol om te stoppen met contractiele bewegingen 6. Om te stoppen met verplaatsing van embryo's na etappe 28 (64hpf), de embryo's worden verdoofd door het toevoegen van druppels tricaïne mesilaat (TMS) voor de inbedding. TMS wordt ook toegevoegd aan de agarose (voeg slechts een minimale hoeveelheid, deze dosis moet worden geoptimaliseerd, ongeveer een 1:25 verdunning). <ol><li> Dooi een kleine hoeveelheid van 3% een lage temperatuur geleermiddel agarose (in 1X BSS) door verhitting tot 37 ° C en op deze temperatuur gehouden. </li><li> De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de agarose niet stollen voordat oriënteren het embryo. Met behulp van een brede mond glazen pipet overdracht genoeg gesmolten agarose aan de dop depressie van een eppendorfbuisje te vullen. </li><li> Overdracht een dechorionated embryo aan de dop depressie te minimaliseren over te dragen BSS met de embryo. Onmiddellijk de opname van de agarose en embryo uit de dop depressie en over te dragen aan een petrischaal cultuur kamer. Een 3.5cm petrischaal met een glazen venster op de bodem wordt gebruikt. Voor beeldvorming met behulp van een omgekeerde microscoop, de embryo's zijn gericht het lichaam naar beneden en plaatste de buurt van de dekglas. Voor beeldvorming met behulp van een microscoop rechtop, is de dikte van agarose geminimaliseerd. </li><li> Breng de 3.5cm petrischaal in een 14cm diameter Petri schaaltje met ijs en water (water gevuld tot ongeveer 1 / 3 totale diepte van de grote schotel). Terwijl u de kamer naar beneden stevig op de bodem van de petrischaal 14cm, gebruik maken van een lus om haar voorzichtig oriënteren het embryo als gewenst in het gesmolten agarose en houd het embryo tot aan de agarose stolt door zachtjes te verhogen en verlagen van de kleinere schaal in de oorspronkelijke stand in het ijskoude water. </li></ol> 4. Celtransplantatie in medaka embryo's Het doel van deze procedure is om te bepalen of het gen van belang cel-autonoom (binnen een cel) of niet cel-autonoom (tussen de cellen) handelingen. Donor cellen kunnen worden gelabeld met een tracer kleurstof, zoals rhodamine-dextran voorafgaand aan de transplantatie (zoals beschreven in "micro-injectie van Medaka Embryo's 'de bijbehorende Jupiter protocol) of een transgeen stam met GFP expressie kan worden gebruikt, waardoor transplantatie beoordeling. Een combinatie van beide technieken de etikettering is vaak handig om auto-fluorescentie die kan worden ondervonden te overwinnen. Voor time-lapse studies na transplantatie, GFP expressie is bijzonder nuttig. Gebruik een brede mond glazen pipet met pipet pomp tijdens de gehele procedure en steriliseren alle tools (inclusief dia's) van tevoren met 70% EtOH, gevolgd door een grondige spoeling met steriel 1X BSS. De ontvanger embryo's worden meestal ontwikkeld rond het podium 12 aangezien dit discriminatie van de ventrale en dorsale palen bij het uitvoeren van de transplantatie. <ol><li> Beginnen dechorionating embryo's 1,5 uur voorafgaand aan de transplantatie en setup injectie apparaat tijdens enzym incubaties. </li><li> Plaats een holte microscoopglaasje in een 9 cm diameter petrischaal. </li> Voeg een kleine hoeveelheid van 3% methylcellulose naar het midden van de holte schuiven met behulp van een steriele pipet tip en de verspreiding in dunne plakjes. <li> Droge methylcellulose voor ongeveer 1-2 minuten. </li><li> Voeg 350μl van steriele 1X BSS te glijden depressie te vullen. </li><li> Overdracht een donor embryo en tot vier ontvanger embryo's om de dia met een glazen pipet. </li><li> Oriënteren embryo's met behulp van een haar lus, zodat de blastoderm van het embryo naar boven is gericht. Embryo's kunnen worden leunde tegen elkaar om verder te verhogen stabiliteit. </li><li> Steek de micro-naald in donor blastoderm en langzaam opname 10-20 cellen. </li><li> Steek de naald in vereiste oppervlakte van de ontvanger embryo blastoderm en langzaam verdrijven van de cellen. Grote zorgvuldigheid moet worden genomen bij het plaatsen van cellen in de ontvanger blastoderm om te voorkomen dat de cel-dooierzak grens verstoren omdat dit zal resulteren in de dood van het embryo. </li><li> Giet gesteriliseerd 1X BSS in de petrischaal. Giet voorzichtig de BSS in de schaal als aan de zijkant van de schotel zo dicht mogelijk, zodat er geen de embryo's te verstoren. Nooit rechtstreeks giet de BSS op de embryo's en voeg voldoende BSS zodanig dat de glijbaan en de embryo's ondergedompeld. </li><li> Voeg 100μl van penicilline / streptomycine aan het gerecht en de te dekken. Zorgvuldig overdragen schotel naar een 27 ° C incubator voor normale ontwikkeling mogelijk te maken. </li><li> Embryo's kunnen periodiek worden waargenomen zoals gewenst. Bij het gebruik van de transplantatie uit te voeren gain-of-functie en / of fenotype te redden experimenten, kunnen sommige waargenomen morfologische veranderingen te wijten zijn aan effecten van de transplantatie. Dus meerdere transplantaties nodig zijn. Na 2-3 dagen, moet melanoforen aanwezig zijn op de dooierzak, hoofd, ogen en romp. Indien aanwezig op de getransplanteerde embryo's vervolgens een succesvolle hersenschim is het meest waarschijnlijk is geproduceerd (figuur 3). </li></ol> Indien nodig, genotype donor embryo (s) door de overdracht aan PCR tube (s) met 25μl van 20mg/ml proteinase K. Incubeer bij 55 ° C gedurende 4 uur gevolgd door 10 minuten bij 94 ° C en uit te voeren PCR. 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeeld positie van een agarose-embedded embryo. Anterior wordt getoond aan de rechterkant en te bekijken is dorsale. Panel B: endotheelcellen kan worden gezien aan beide zijden van het embryo lichaam en worden aangeduid met behulp van GFP aangestuurd door de FLI promotor. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Beelden van na de transplantatie embryo's. Een afbeelding toont een donor en ontvanger embryo onmiddellijk na de transplantatie. De donor embryo wordt getoond aan de rechterkant met een volledig rode blastoderm (pijl). De ontvanger embryo wordt getoond aan de linkerkant en is gemakkelijk te herkennen door de kleine massa van de rode getransplanteerde cellen zichtbaar in de blastoderm (pijlpunt). Afbeelding B toont twee ontvanger embryo's ongeveer 7 uur na de transplantatie (geïncubeerd bij 27 ° C). Let op de getransplanteerde cellen zijn gemigreerd van de site van de transplantatie en zijn nu verspreid over de blastoderm (pijlen). Afbeelding C toont een ontvanger embryo bij st.29 (ongeveer 74hpf). Let op de pigmentatie in het oog en de aanwezigheid van melanoforen in de romp en de hersenen regio (pijlen). De rhodamine-gelabelde cellen kunnen worden gezien als koloniseren veel van de embryonale structuren met vermelding van de succesvolle productie van een hersenschim.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

In deze video laten we zien hoe dechorionate en uit te voeren cel transplanataion op medaka embryo&#39;s. Dit is een krachtige techniek om embryo&#39;s te produceren chimere voor de studie van gen / eiwit-functie tijdens de ontwikkeling, evenals voor het ophelderen van de autonomie van het gen / eiwit in kwestie. Medaka zijn een nuttige vertebrate modelsysteem voor deze techniek te wijten aan gevestigde lot kaarten en de transparantie lenen ze goed in vivo real-time beeldvorming. Transplantatie kan worden gecombineerd met micro-injectie (zoals aangegeven in &quot;micro-injectie van Medaka Embryo&#39;s &#39;de bijbehorende Jupiter-protocol), zodat het gedrag van de getransplanteerde cellen kunnen gemakkelijk worden waargenomen.

<table><tbody><tr><td>Embryo medium</td><td>Reagens</td><td>In-house gemaakt</td><td>N/A</td><td>200ml 50X stockoplossing, 1ml 1% methyleenblauw in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 liter RO-water (50X stockoplossing: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2.4g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4.0g/1 liter RO-water.)</td></tr><tr><td>Micro-dissectiepincet</td><td>Instrumenten</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;amp;FILS</td><td>N/A</td><td>Zeer scherpe fijne punten voor het verwijderen van het chorion.</td></tr><tr><td>Fijn waterbestendig schuurpapier - korrelgrootte p2000</td><td>Instrumenten</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/A</td><td>Zeer fijne korrelgrootte voor het rollen/reinigen van embryo's met chorion.</td></tr><tr><td>3% methylcellulose</td><td>Reagens</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Hoge viscositeit om embryo's op hun plaats te houden tijdens transplantatie.</td></tr><tr><td>1X BSS</td><td>Reagens</td><td>In-house gemaakt</td><td>N/A</td><td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, en 10mg Fenolrood in 1L MilliQ-water en autoclaveren; 500mM Hepes in MilliQ-water geautoclaveerd. Voeg 25ml 20XBSS en 15ml 500ml Hepes pH 7.0 toe, aanvullen tot 500ml en filtersteriliseren voor gebruik.</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Reagens</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Toegevoegd aan BSS bij incubatie van gedechorionerde embryo's.</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Reagens</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Voor dechorionatie.</td></tr><tr><td>Hatching enzym</td><td>Reagens</td><td>In-house gemaakt</td><td>N/A</td><td>Voor dechorionatie.</td></tr><tr><td>Tricaine mesylaat (TMS)</td><td>Reagens</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400mg tricaine in 97.9ml gedestilleerd water en 2.1ml 1M Tris, pH aangepast op 7; 4.2ml van deze oplossing in 100ml schoon tankwater.</td></tr><tr><td>3% agarose met ultra-lage geleringstemperatuur</td><td>Reagens</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Type IX-A. Gebruikt tijdens het inbedden van embryo's voor observatie.</td></tr><tr><td>Petrischaal kweekkamer</td><td>Instrument</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Iwaki glazen bodemschaal 35mm met 12mm venster. Gebruikt tijdens het inbedden van embryo's voor observatie.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Apparatuur</td><td>Narishige</td><td>N/A</td><td>Model MN151. Voor het verwijderen en inbrengen van cellen tijdens transplantatie.</td></tr><tr><td>Borosilicaatglas capillairen</td><td>Instrument</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Voor het maken van transplantatienaalden.</td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipet-puller</td><td>Apparatuur</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Voor het maken van transplantatienaalden.</td></tr></tbody></table>

dechorionation van medaka embryo&#39;s en cell transplantation voor de generatie van chimaeren

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is een klein ei-leggen zoetwatervis dat zowel genetische en embryologische analyses mogelijk maakt en is een van de drie gewervelde model organismen waarvan het genoom-brede fenotype aangedreven mutant schermen werden uitgevoerd 1. Divergentie van de functionele overlap van gerelateerde genen tussen medaka en zebravis maakt identificatie van nieuwe fenotypen die niet identificeerbaar zijn in een enkele soort twee, dus medaka en zebravissen zijn complementair voor genetische dissectie van de gewervelde genoom functies. Manipulatie van medaka embryo&#39;s, zoals dechorionation, montage embryo&#39;s voor imaging-en celtransplantatie, zijn de belangrijkste procedures op beide medaka en zebravis werken in een laboratorium. Celtransplantatie onderzoekt cel autonomie van medaka mutaties. Hersenspinsels worden gegenereerd door het transplanteren van gelabelde cellen van donor embryo&#39;s in niet-gelabelde ontvanger embryo&#39;s. Donor cellen kunnen worden getransplanteerd op specifieke gebieden van de ontvanger embryo&#39;s op basis van het lot kaarten 3, zodat klonen van getransplanteerde cellen kunnen worden geïntegreerd in het weefsel van belang tijdens de ontwikkeling. Door de harde chorion en zachte embryo&#39;s, manipulatie van embryo&#39;s medaka is meer betrokken dan in de zebravis. In deze video laten we zien gedetailleerde procedures voor het medaka embryo&#39;s te manipuleren.

Door de harde chorion en zachte embryo&#39;s, manipulatie van embryo&#39;s medaka is meer betrokken dan in de zebravis. Deze video laat stap-voor-stap procedures voor hoe medaka embryo&#39;s te manipuleren, waaronder dechorionation, montage in agarose voor de beeldvorming en de cel transplantatie voor de productie van hersenspinsels. Deze procedures zijn essentieel voor medaka en zebravis gebruik in een laboratorium ten volle te profiteren van hun complementaire eigenschappen te nemen voor de genetische dissectie van gewervelde genoom functies.

Dechorionation van Medaka Embryo&#39;s en Cell Transplantation voor de generatie van chimaeren

Medaka is een kleine, eierleggende zoetwatervis die zowel genetische als embryologische analyses mogelijk maakt en is een van de drie vertebrale modelorganismen in ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van klonen in een embryo om de autonomie van een specifiek gen of eiwit te onderzoeken. Dit wordt bereikt door donorembryo's te labelen met Rod Domine dextran via micro-injectie in het ééncelstadium, zoals getoond in de begeleidende video van deze video, micro-injectie van Maka-embryo's. De tweede stap van de procedure is het laten ontwikkelen van zowel de donor- als de recipientembryo's tot het juiste stadium.De derde stap van de procedure is het coaten van zowel de embryo's van de donor als die van de ontvanger. De laatste stap van de procedure is het transplanteren van cellen van de gelabelde donorembryo's naar de embryo's van de ontvanger. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen door de distributie, proliferatie en differentiatie van klonen van getransplanteerde cellen te analyseren, door de getransplanteerde cellen te detecteren aan de hand van hun fluorescentie of lineage tracers.Hoi, ik ben Sean Brazinski van het lab van Dr. Makoto Fki van de afdeling Biologie en Biochemie aan de Universiteit van Bath. Ik ben ook verbonden aan het Zeki-lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor celtransplantatie in donkere visembryo's.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen of een gen of mutatie van belang een celautonome of niet-celautonome functie heeft. Laten we beginnen. Gebruik bij het coaten van maka-eieren steriele oplossingen en instrumenten om het succes van langetermijnobservatie en kweek te verbeteren.Plaats een stuk waterbestendig schuurpapier met korrelgrootte P 2000 in het deksel van een niet-klevende Petrischaal van negen centimeter. Gebruik een gepolijste pasta-pipet met een brede opening om tot 10 vers ontklonterde, gereinigde en gelabelde eitjes over te brengen van een schaal met ei-medium naar het schuurpapier.Verwijder het overtollige medium, waarbij net genoeg in de schaal achterblijft om te voorkomen dat de eieren uitdrogen. Gebruik een met een handschoen bedekte vingertop om telkens 10 eieren gedurende 45 tot 60 seconden voorzichtig over het schuurpapier te rollen. Om de buitenste oppervlakteharen te verwijderen en het Corian-oppervlak te scoren, dient er minimale druk te worden uitgeoefend en moet de vingertop parallel aan het schuurpapier worden gehouden.Breng de eitjes over naar de oorspronkelijke schaal met medium. Verwijder het medium en bedek de eitjes met een oplossing van 20 mg/mL prone. Dek de schaal af en incubeer deze gedurende 60 minuten bij 27 °C.Zorg ervoor dat de schaal onder een hoek wordt geplaatst, zodat de embryo's voldoende in het enzym zijn ondergedompeld. Om de benodigde hoeveelheid enzym te minimaliseren, kan een plastic transferpipet worden gebruikt om de pronase terug te winnen voor hergebruik, waarna deze op ijs wordt geplaatst. Was de eieren vijf keer met een embryo-medium om alle sporen van pronase te verwijderen en te voorkomen dat het het uitbroedenzym afbreekt.Voeg voldoende uitbroedingsenzym toe om de gewassen eieren te bedekken. Zorg ervoor dat de eieren in een enkele laag op de bodem van de schaal blijven liggen om beschadiging te voorkomen terwijl het Corian oplost. Incubeer de eieren bij 27 °C.Zorg ervoor dat de schaal onder een hoek wordt geplaatst, zodat de embryo's voldoende in het enzym zijn ondergedompeld. Om de benodigde hoeveelheid enzym te minimaliseren, dient de voortgang onder een dissectiestereomicroscoop te worden gecontroleerd; er zullen vergelijkbare gaatjes verschijnen in de binnenste laag van het chorion voordat deze volledig oplost. Het proces kan tot 60 minuten duren, afhankelijk van de enzymactiviteit.Zodra een klein deel van het chorion is opgelost, wordt het individuele ei onmiddellijk met een pipet opgezogen om digestie van het embryo door het uitbroedingsenzym te voorkomen. Breng het ei over naar een schoon schaaltje met 1× BSS door de tip van de pipet voorzichtig tegen een schoon schaaltje met 1× BSS te drukken en het ei eruit te laten rollen, om de overdracht van het uitbroedingsenzym te minimaliseren. Gebruik een pincet om de rest van het chorion te verwijderen wanneer alle eieren zijn overgebracht vanuit het uitbroedingsenzym.Voer een laatste overdracht uit naar een nieuwe schaal met één keer BBSS. Voeg antibiotica toe als de embryo's naar een later stadium van embryonale ontwikkeling moeten worden gebracht. Begin na de voorbereiding voor deze procedure 1,5 uur voor transplantatie met het verwijderen van de coating van stadium 12 embryo's. Gebruik een pipetpunt om een kleine hoeveelheid 3% methylcellulose in het midden van een microscoopholte toe te voegen.Schuif een petrischaal van negen centimeter erin. Verspreid de vloeistof in een dunne laag over het oppervlak van de inkeping. Laat de methylcellulose twee minuten drogen.Vul de verdieping van het objectglas met 350 µL steriele eenvoudige BSS onder een dissectiemicroscoop. Gebruik een breedmondige, vuurgepolijste glaspipet om één donor- en maximaal vier recipiëntenembryo's over te brengen naar het objectglas. Gebruik een haarlus om de embryo's zo te oriënteren dat de blastoderm naar boven is gericht.Leun de embryo's indien nodig tegen elkaar aan voor stabiliteit. Voer voorzichtig een micronaald in de donor blastomeer in. Neem langzaam 10 tot 20 cellen op.Voer nu voorzichtig de naald in het betreffende gebied van het ontvangende embryo-blastoderm in en drijf de donorcellen langzaam naar buiten. Verstoor de grens van de celzak niet. Vul de Petrischaal voorzichtig met ongeveer 30 milliliters steriele 1× BSS om de embryo's onder te dompelen en ze los te maken van de methylcellulose.Giet langs de wand van de schaal om de embryo's niet te verstoren. Voeg 100 µL penicilline-streptomycine toe aan de schaal voor een geschatte concentratie van 0,3%. Dek de schaal af. Observeer de embryo's periodiek indien nodig.Voor langere beeldvormingsstudies, zoals time-lapse en gedetailleerde observaties, worden levende gecoate embryo's ingebed in agarose. Anestheseer levende embryo's om beweging te voorkomen door een geschikt anestheticum toe te voegen aan het medium waarin de embryo's zich bevinden. Smelt ongeveer 1 mL 3% low melting point agarose in 1x BSS en houd dit op 37 °C. Voeg indien nodig een passende hoeveelheid anestheticum toe aan de agarose om trekkingen te voorkomen. Gebruik, terwijl u snel werkt om stolling te voorkomen, een wide-mouth Pasteurpipet om de kapvormige bodem van een microcentrifugebuis te vullen met agarose.Gebruik een pipet met een brede opening om één gecoat en geanestheseerd embryo in de aros in de dop te plaatsen. Draag zo min mogelijk medium over samen met het embryo. Actualiseer onmiddellijk de aros en het embryo en verplaats ze naar een glazen Petri-schaal met een bodem van 3,5 centimeter.Verplaats de schaal naar een schaal van 14 centimeter die voor een derde is gevuld met een mengsel van ijs en water. Houd de kleinere schaal stevig op de bodem van de grotere schaal onder een dissectiestereomicroscoop. Gebruik een haarlus om het embryo snel in de gewenste positie te oriënteren.Houd het embryo stil totdat het agar stolt. Het embryo kan nu worden afgebeeld. Afbeelding A toont een donor- en een recipientembryo direct na transplantatie.Het donorembryo is rechts afgebeeld met een volledig rood gelabelde blaster derm. Het recipientembryo is links afgebeeld en is gemakkelijk te identificeren aan de kleine massa rood getransplanteerde cellen die zichtbaar is in de blaster derm afbeelding B toont twee recipientembryo's ongeveer zeven uur na transplantatie. Let op dat de getransplanteerde cellen vanuit de transplantatieplaats zijn gemigreerd en nu verspreid zijn over de blaster.Derm afbeelding C toont een embryo van de ontvanger in stadium 29. Let op de pigmentatie in het oog en de aanwezigheid van mefor in de romp en de hersenregio. De gemarkeerde rod domine-cellen zijn te zien terwijl ze vele embryonale structuren koloniseren, wat duidt op de succesvolle productie van een chimeera.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u zebrafish-embryo's gebruikt en celtransplantatie uitvoert in een vroeg embryonaal stadium. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de donorcellen in het juiste gebied van de blastula van de ontvanger worden getransplanteerd. Dit stelt de donorcellen in staat om te differentiëren tot het juiste celtype.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een stap-voor-stap handleiding voor gerichte chimerisch zebravis embryo's genereren door transplantatie op de blastula of gastrulastadium.

Het genereren van Chimère zebravis embryo&#39;s door transplantatie

Zebravis celtransplantatie maakt de combinatie van genetica en embryologie aan het weefsel specifieke hersenschimmen te genereren. Deze video toont gastrula geënsceneerde cel transplantaties die hebben onze lab naar de rol van astroglial bevolking en de specifieke begeleiding signalen tijdens commissuur vorming in de voorhersenen te onderzoeken.

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

Medaka en zebravissen zijn complementair voor genetische dissectie van gewervelde genoom functies. Dit protocol worden de belangrijkste punten voor een succesvolle micro-injectie in medaka embryo's, een belangrijke techniek voor de embryologische en genetische analyse met behulp van medaka en zebravis in een laboratorium.

Micro-injectie van Medaka embryo&#39;s voor gebruik als een model organisme Genetische

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Kleine laboratoriumvissen zijn populaire modellen geworden voor botonderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke botaandoeningen en voor het screenen van botmodulerende geneesmiddelen. In dit rapport beschrijven we een protocol om het effect van alendronaat op botcellen bij medaka-larven met osteoporose-laesies te beoordelen.

Drug Treatment en<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van Osteoblast osteoclasten Interacties in een Medaka Fish Osteoporosis Model

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Hier presenteren we een protocol ter verhoging van de productie van de chimera zonder het gebruik van nieuwe apparatuur. Een verandering van de eenvoudige oriëntatie van het embryo voor injectie kan verhogen van het aantal embryo's geproduceerd, en potentieel het reduceren van de tijdlijn tot germline transmissie.

Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt

Dit doel van dit protocol is het produceren van chimerische axolotls met haploïde voorpoten afgeleid van Cas9-mutagenized donorweefsel met behulp van embryonale weefsel enten technieken.

Generatie chimeric Axolotls met Mutant Haploid Ledematen door embryonale grafting

Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.

Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

Leer dechorionatie en celtransplantatie in medaka-embryo's voor genetisch onderzoek. Deze methode maakt chimaeraproductie mogelijk om genautonomie in ontwikkelingsbiologie te bestuderen.

Dechorionation van Medaka Embryo's en Cell Transplantation voor de generatie van chimaeren

Meer video's verkennen