Name: Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer hoe u recombinant griepvirus genereert uit plasmide-DNA door transfectie in 293T- en MDCK-cellen. Deze methode is essentieel voor virologisch onderzoek en vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen heden en verleden leden bedanken de Adolfo García-Sastre en Peter Palese laboratoria voor de ontwikkeling van influenza reverse genetics technieken en plasmiden. Onderzoek in AG-S laboratoria wordt gedeeltelijk gefinancierd door CRIP, een NIAID gefinancierde Center of Excellence voor de Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700010C) en door NIAD beurzen R01AI046954, U01AI070469 en P01AI058113. Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gedeeltelijk gefinancierd door NIAID verlenen RO1AI077719.

1. Influenza virus te redden transfectie Influenza A-virus behoort tot de familie van negatieve Orthomyxoviridae-stranded RNA-virussen met een envelop. De influenza A-virus genoom bestaat uit acht verschillende RNA-genen van negatieve polariteit die coderen, op zijn minst, 11 virale eiwitten (figuur 1) 4. We zullen, focus in dit rapport, over de redding van een van de meest voorkomende laboratorium stam, influenza A/PR/8/34, 5 met behulp van ambisense plasmiden (PDZ) met de acht influenza A/PR/8/34 virale segmenten ( Figuur 2). Voor de redding van recombinante influenza virussen van plasmide DNA, raden we aan drie onafhankelijke transfecties per elk recombinant virus. Als er meer dan een recombinant virus te redden is geprobeerd, overeenkomstig aan de schaal van de volgende stappen uit om het aantal virussen worden gered. De volgende transfectie en infectie-protocol is vastgesteld voor 6-well-platen. Een schematische weergave van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mengsel: Bereid 250 pi OptiMEM media en 6-8 pi LPF2000 per transfectie. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Ondertussen bereiden de plasmide transfectie mengsel. </li><li> Plasmide transfectie mengsel: Bereid het plasmide transfectie cocktail in 50 ul van OptiMEM media. We gebruiken meestal 1 ug van elk influenza DNA-plasmide per redden. Voeg 1 ui van de PDZ plasmiden (bij 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, en NS om een ​​buisje met 50 ul van OptiMEM media. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmide mengsel: Voeg 250 ul van stap 1.1 in de griep-DNA-plasmide transfectie-mengsel (stap 1.2). Incubeer dit mengsel gedurende 20-30 minuten bij RT. Ondertussen bereiden suspensies van 293T en MDCK cellen voor transfectie. </li><li> Voorbereiding van 293T/MDCK co-cultuur: Voordat u begint, de PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS media, en EDTA-trypsine mengsel te brengen tot 37 ° C. De dichtheid van de cellen moet worden op 80-90% confluentie de dag van de transfectie. Meestal kan een samenvloeiende 100 mm gerecht van 293T en een samenvloeiing 100 mm schaal van MDCK cellen die worden gebruikt voor 10-12 reddingen. We gaan tot 250 pi cellen per goed gebruiken. Beide cellijnen zullen worden gesuspendeerd in een totaal van 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS. <ul><li> Zorgvuldig mengen elke cellijn in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 15 ml centrifugebuis. U heeft een buis voor 293T cellen en een buis voor MDCK cellen. </li><li> Resuspendeer de 293T-cellen in 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS en wanneer geresuspendeerd, de 3 ml leveren aan de MDCK cellen om die cellen mengen. Dit geeft je het mengsel van 293T en MDCK cellen worden gebruikt voor uw co-cultuur. </li><li> Voeg 250 ul van de 293T/MDCK cellen per well (10-12 6-well putten). </li></ul></li><li> Na 20-30 minuten RT incubatie (stap 1.3), voeg 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS aan de OptiMEM-LPF2000-influenza-DNA-plasmide mengsel. </li><li> Voeg de 1,3 ml (stap 1.5) in de putten met de 250 pi 293T/MDCK cellen (stap 1.4). </li><li> Schud de 6-well-plaat en 's nachts laat de transfectie incubeer (ON) in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> De volgende dag, ongeveer 16-24 uur na transfectie, verandert u de transfectie media en incubeer de getransfecteerde cellen in DMEM 0,3% BA 1% PS met 1 ug / ml van TPCK-trypsine gedurende 48 uur. </li><li> Na 48 uur van het veranderen van de media, overdracht van de supernatans van de getransfecteerde cellen in een microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de weefselkweek supernatant in een microcentrifuge voor 1-2 minuten, 13000 rpm. </li><li> Infecteren verse MDCK cellen in 6-well platen (plated de dag ervoor) of 10-dagen-oude kip bevruchte eieren met 200 ul van gecentrifugeerd weefsel kweeksupernatanten vanaf stap 1.10. Incubeer de cellen en / of eieren bij 37 ° C gedurende 2-3 dagen. <ol><li> Infectie van de 10-dagen oude kippen bevruchte eieren: Alle procedures om kippen bevruchte eieren infecteren worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. <ol><li> Kaarsen de 10-dagen-oude eieren met behulp van een licht-schouwing box om de interface tussen de luchtzak en de allantoïsholte te zien. Maak een potlood teken op de interface grens. </li><li> Met een 5 ml injectienaald maken een gat in de eierschaal. </li><li> Met een 1 ml spuit, besmetten elk ei met 200 ul van het weefsel kweeksupernatanten vanaf stap 1.10. </li><li> Bedek het gat in de eischaal met gesmolten was met behulp van een wattenstaafje. </li><li> Incubeer de besmette eieren op 37οC voor 2-3 dagen. </li></ol></li><li> Infectie van verse MDCK cellen: De dag voor passage van de weefselkweek supernatant uit de 293T/MDCK co-culturen, prePare 6-wells plaat gerechten met MDCK-cellen tot 80-90% confluentie bereiken de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm weefselkweek plaat op te splitsen in 6-8 putten. Was de cellen, tweemaal met PBS 1X, trypsinize en de voorbereiding van de 6-well platen. Schud de hand van de platen om een ​​geüniformeerde verdeling van de cellen. Cultuur van de cellen, ON, in de 37 ° C incubator, 5% CO 2. Voor infectie, controleer dan de cellen onder de microscoop om een ​​monolaag te bevestigen, vandaar verder met de infectie: <ul><li> Was de cellen, twee keer, met 1 ml PBS 1X. </li><li> Infecteren met de 200 ul van gecentrifugeerd weefsel kweeksupernatanten gedurende 1 uur bij RT. Niet laten de cellen drogen. Rock de 6-well-plaat elke 10 minuten. </li><li> Na 1 uur van virale absorptie, verwijdert u de infectie media van de MDCK cellen en voeg 2 ml DMEM 0,3% BA 1% PS met 1 ug / ml van TPCK-trypsine. </li><li> Op 48-72 uur na de passage, afhankelijk van de transfectie-efficiëntie en het virus load, zal een cytopathogeen effect (CPE) worden waargenomen in de MDCK geïnfecteerde cellen. CPE suggereert een succesvolle redding. Toch moet een HA-assay (deel 2) nog steeds worden uitgevoerd om de aanwezigheid van het virus in het weefsel kweeksupernatanten te bevestigen. </li></ul></li></ol></li><li> Oogst allantoïsvocht van geïnfecteerde kippen bevruchte eieren: Alle procedures om de allantoïsvocht oogst van besmette eieren worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Ongeveer 8-12 ml van allantoïsvocht geoogst kan worden van iedere 10-dagen-oud-geïnfecteerde ei. Voorafgaand aan het oogsten van de allantoïsvocht, incubeer de kip eieren voor 2 uur (of ON) bij 4 ° C om de kip embryo te doden en stollen van het bloed. <ul><li> Was de eierschalen met 70% ethanol tot steriele omstandigheden vast te stellen. </li><li> Open het ei, voorzichtig, via de ether holte door te tikken met een lepel. Verwijder de gebroken eierschaal met behulp van pincet. </li><li> Met een 1 ml naald, verwijder het allantoïs membraan zonder het breken van de eieren van de dooier. </li><li> Het stabiliseren van de kippenembryo met een spatel als je een 10 ml pipet gids in de allantoïsvocht. Verzamel zoveel allantoïsvocht mogelijk in een 15 ml centrifugebuis op ijs in een ijsemmer zonder te breken of het verzamelen van een van eigeel het ei's. Gebruik een 15 ml centrifugebuis voor elk ei. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C en breng de allantoïsvocht (zonder rekening te gepelleteerd rode bloedcellen), om een ​​frisse 15 ml centrifugebuizen. </li><li> Bewaar de buisjes met de gecentrifugeerd allantoïsvocht bij 4 ° C tot ze gecontroleerd op de aanwezigheid van geredde virus met een hemagglutinatie (HA) test. </li></ul></li></ol> 2. HA-test aan de redding van recombinante influenza virussen te bevestigen Hemagglutinatie assay (HA) wordt routinematig gebruikt om de aanwezigheid van geredde virus in MDCK weefsel kweeksupernatanten en / of de allantoïsvocht geoogste eieren op te sporen. Als alternatief kunnen immunofluorescentie assays (IFA) ook worden uitgevoerd. Zodra een test geeft de aanwezigheid van geredde virus, moet het virus worden plaque gezuiverd en de genetische samenstelling van het virus zal bevestigd door RT-PCR en sequencing worden. De aanwezigheid van het virus in de MDCK weefsel kweeksupernatanten en / of in de allantoïsvocht van besmette eieren kan worden bepaald met behulp van macroscopisch HA van kip (of een andere bron) rode bloedcellen (RBC). De aanwezigheid van het virus induceert hemagglutinatie van RBC, terwijl de afwezigheid van het virus kan de vorming van een rode pellet in de bodem van de put (figuur 4). In het geval van influenza virus, wordt aangenomen dat ongeveer 10 3 -10 4 plaque-vormende eenheden (PFU) zijn verplicht om een positief signaal in de HA-test te geven, daarom een IFA kan worden uitgevoerd in parallel met de HA-test om te bevestigen een echte negatief resultaat. IFA met primaire anti-influenza-antilichamen is gevoeliger dan de HA-test, omdat minder dan 103-104 virussen kunnen worden gedetecteerd met deze techniek. Het is mogelijk dan supernatant of allantoïsvocht die HA-negatief zijn positief door de IFA. In dit geval moet het virus worden versterkt door passage, opnieuw, in MDCK cellen of in eieren. Allantoïsvocht en / of weefsel kweeksupernatanten van de tweede passage moet nu duidelijk positief zijn in de HA-test. HA testen worden uitgevoerd in V-bodem 96-wells platen. Negatief (bijvoorbeeld PBS 1X) en positieve (weefselkweek supernatant en / of allantoïsvocht van een influenza virus infectie) controlemonsters moet altijd worden opgenomen in een HA-test te valideren. <ul><li> Doseer 50 pi PBS 1X in elk putje van de V-bodem 96-well plaat. </li><li> Voeg 50 pide MDCK weefsel kweeksupernatanten en / of allantoïsvocht van de besmette eieren naar de eerste put en maken twee-voudige seriële verdunningen voor de volgende putten. Gooi de extra 50 ul van de laatste goed. </li><li> Voeg 50 pi van 0,5% -1,0% kip rode bloedcellen (opgesteld in PBS 1X) aan elke well. </li><li> Incubeer de V-bodem 96-well plaat voor 30-45 minuten (tot een rode stip zichtbaar is in de bodem van een negatieve controle PBS monster) op ijs. Lezen en interpreteren van de resultaten zoals aangegeven in figuur 4. </li></ul> 3. Passage van weefsel kweeksupernatanten Een negatief resultaat in de HA-test kan een gevolg van een lage transfectie-efficiëntie met lage niveaus van het virus aanwezig in het weefsel kweeksupernatanten en / of allantoïsvocht worden. Passage van deze monsters in verse MDCK en / of bevruchte eieren zal versterking van het virus (zoals aangegeven in figuur 3) Infecties worden uitgevoerd zoals eerder beschreven in paragraaf 1.11.2. 4. Representatieve resultaten Succesvolle influenza virus te redden zal worden bevestigd door de aanwezigheid van een positieve HA assay (figuur 4). Daarnaast zal het bestaan ​​van de CPE in de cellen die besmet zijn met het weefsel kweeksupernatanten of met de allantoïsvocht van eieren suggereren een positieve virale te redden. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Influenza Virus structuur: Influenza virus is omgeven door een lipide bilaag met de twee virale glycoproteïnen (HA, NA) en, ook, het ionkanaal eiwit, M2. HA is de virale bijlage eiwit, verantwoordelijk voor de binding aan siaalzuur-bevattende receptoren. NA is verantwoordelijk voor de virale vrijlating uit de gastheercellen. Onder de lipide bilaag, is een eiwit laag bestaat uit de binnenzijde envelop matrix eiwit 1, M1, die een rol speelt in virion montage en ontluikende en de nucleaire export eiwit (NEP), die nodig zijn voor de nucleaire export van virale ribonucleocapsids. De kern van het virus is gemaakt van een ribonucleoproteïne (RNP) complex, bestaande uit 8 enkelstrengs RNA-negatieve virale genen encapsidated door het virale nucleoproteïne, NP. Worden geassocieerd met het RNP complex zijn de virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase subeenheden PA, PB1, en PB2. De niet-structurele eiwitten NS1 en PB1-F2, gecodeerd door het RNA segmenten NS en PB1, respectievelijk, maken geen deel uit van het virion structuur. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Influenzavirus rescue plasmiden: De acht influenza virus genen gekloneerd in de ambisense plasmide PDZ worden aangegeven. PDZ plasmide 6, afgeleid van het proteïne-expressie-plasmide pCAGGs 7, is een bidirectionele plasmide vector met een menselijk RNA polymerase I promotor en een muis terminator-sequentie die de negatieve zin genomische RNA codeert, in tegenovergestelde richting van de polymerase I te verenigen, een polymerase II transcriptie cassette (kip β-actine-promotor en polyA) codeert voor de virale eiwitten uit dezelfde virale gen. cDNA's van elk virale segment worden gegenereerd door RT-PCR met voorwaartse en omgekeerde primers die de Sapi restrictie endonuclease site en het niet-coderende regio's van elk segment (zwarte dozen aan het eind van de virale genen). Het PCR-product is gekloneerd in de PDZ gedigereerd met Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Acht-plasmide-gebaseerde influenza rescue-systeem: PDZ plasmiden die de 8 influenza virale genen zijn co-getransfecteerd, in suspensie, in 293T-cellen MDCK co-culturen (dag 1). Vierentwintig uur na transfectie, media zonder FBS maar met TPCK / trypsine is vervangen (dag 2). Achtenveertig uur na het veranderen van media, is weefselkweek supernatant geoogst en gebruikt voor het MDCK of 10-dagen oude bevruchte kippeneieren (dag 4) besmetten. 48-72 uur post-versterking, weefselkweek supernatanten van MDCK geïnfecteerde cellen of allantoïsvocht van eieren worden geoogst en onderzocht op aanwezigheid van virus door HA (dag 6). Als er geen virus wordt gedetecteerd, kan dezelfde supernatant en / of allantoïsvocht opnieuw worden gepasseerd in de frisse MDCK cellen en / of bevruchte eieren. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Hemagglutinine assay (HA): hemagglutinatie van RBC door een virus deeltje is zichtbaar macroscopisch en is de basis voor virale deeltjes te detecteren in weefsel kweeksupernatanten en / of allantoïsvocht. Hoewel de HA-test maakt geen onderscheid tussen virale deeltjes die zijn besmettelijk en deeltjes die worden afgebroken en niet meer in staat om cellen te infecteren, de test is een goede indicator van de aanwezigheid van virus in monsters. A) Ontbreken (boven) van de aanwezigheid (onderkant) van het virus in de biologische monsters wordt bepaald door de aanwezigheid van RBC in de bodem van de plaat of de afwezigheid daarvan, respectief. B) Een vertegenwoordiger het gevolg zijn van een HA-test met geen detecteerbare niveaus van het virus (boven) of aanwezigheid (onderkant) van het virus is aangetoond.

<ol><li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li>
<li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+influenza+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. H. , 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins. PA, USA. 1647-1689 (2006).</li>
<li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li>
<li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

Mount Sinai School of Medicine heeft de intellectuele eigendomsrechten op het gebied van recombinant influenza virussen en AG-S is een uitvinder in deze intellectuele eigendom.

Redding van recombinant influenza virussen uit het plasmide DNA is een eenvoudig en duidelijk proces zodra het protocol routinematig wordt uitgevoerd in het laboratorium, maar in het begin, meerdere dingen mis kan gaan. Het is noodzakelijk om een ​​goede voorbereiding plasmide hebben om het virus te genereren. Goed onderhoud van de cellijnen (293T en MDCK) is cruciaal voor een succesvolle viral te redden. Traditioneel wordt een genetische tag ingevoegd in een influenza gen-codering plasmide, door stille mutagenese. Intr...

Cellijnen 293T (catalogusnummer CRL-11268) en MDCK (catalogusnummer CCL-34) cellijnen worden onderhouden in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Cellen zijn beschikbare vorm van de American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110 tot 2209 USA). Bevruchte kippeneieren Bevruchte 10-dagen oude kippen eieren kan worden verkregen van Charles River Laboratories, Specifiek Pathogeen Aviaire Fee Supply (SPAFAS) Aviaire Producten en Diensten. Franklin Commons, 106 Route 32, Noord-Franklin, CT 06254 USA. Eieren worden uitgebroed op 37 ° C voorafgaand aan en na de virale infectie. Voor en na virale infectie, zijn eieren schouwing van de levensvatbaarheid van de embryo&#39;s te bepalen. Het is zeer belangrijk om voor de dode eieren er voor en na de virale infectie. Vóór infectie een dode ei kan gemakkelijk worden gezien door de afwezigheid van bloedvaten, alsmede de afwezigheid van embryo mobiliteit. Bij schouwing, levende embryo&#39;s te verplaatsen. Na het virale infectie een dode ei (waarschijnlijk gerelateerd aan influenza virus infectie), zal gemakkelijk worden gespot door de slechte uitstraling van het ei zoals gezien door de kleinere en bloedige volume van allantoïsvocht. Geïnfecteerde-eieren worden weggegooid in dubbele autoclaveerbare zakken en geautoclaveerd volgens standaard procedures. Kip rode bloedcellen (RBC) Kip RBC kan worden gekocht van Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Bewaren bij 4 ° C. Voor HA testen, was 5 ml van de kip RBC met 45 ml PBS 1X in een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 rpm&#39;s, RT. Gooi voorzichtig het supernatant en gebruik een verdunning van 1:1000 van het ingehulde RBC in PBS 1X (uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0% RBC). Tissue kweeksupernatanten en allantoïsvocht Beide, weefsel kweeksupernatanten en allantoïsvocht kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor een korte periode van tijd. Na het bevestigen virus te redden, zijn virussen uit celsupernatanten of allantoïsvocht opgeslagen bij -80 ° C. Plasmids Alle plasmiden worden bereid met een plasmide maxi kit volgende aanbevelingen van de fabrikant. Alle plasmiden zijn fractie bij concentraties van 1 ug / ml in DDH 2 O en opgeslagen bij -20 ° C. Voor korte-termijn opslag, kan het plasmide te houden bij 4 ° C. De concentratie van de gezuiverde DNA-plasmide wordt bepaald spectrofotometrisch bij 260 nm, met een zuiverheid wordt geschat met behulp van de 260:280 nm ratio. Preparaten met 1,8-2,0 260:280 nm ratio&#39;s worden beschouwd als bestemmen voor virus te redden doeleinden. Bovendien moeten plasmide concentratie en zuiverheid worden bevestigd met agarose gel chromatografie. Ambisense PDZ plasmiden (6) met daarin de acht influenza A/PR/8/34 virale genen (7) zijn aangegeven in figuur 2. Virussen De beschreven protocol voor het redden van influenza A/PR/8/34 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) twee voorwaarden. Verontreinigd materiaal, waaronder tissue kweeksupernatanten en bevruchte eieren, moeten worden gesteriliseerd weg te doen. Redding van andere influenza virus kan een hogere BSL omstandigheden en dus bijzondere voorwaarden / security metingen moeten worden gevolgd. Weefselkweek media en oplossingen DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM), 50 ml foetaal runderserum (FBS), en 5 ml van de 100X penicilline / streptomycine (PS). Bewaren bij 4 ° C. Deze media worden gebruikt om de 293T en MDCK cellen alsmede voor de transfecties te behouden. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml DMEM, 4,3 ml van 35% runderalbumine (BA). Bewaren bij 4 ° C. Net voor gebruiken, voegt TPCK behandeld trypsine tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ml. Besmettelijke media. 10X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4. Voeg DDH 2 O tot 1 liter. Pas de pH op 7,3. Steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur. 1X PBS: Verdun 10X PBS 1:10 met DDH 2 O. Steriliseren in autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur.

generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-dna

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Inspanningen van een aantal influenza onderzoeksgroepen zijn de spil in de ontwikkeling en verbetering van het influenza A virus reverse genetics. Oorspronkelijk opgericht in 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmide-gebaseerde omgekeerde genetische technieken om recombinante virussen te genereren hebben een revolutie in de influenza gebied van onderzoek, omdat specifieke vragen zijn beantwoord door genetisch gemanipuleerde, besmettelijke, recombinant influenza virussen. Dergelijke studies omvatten virus replicatie, de functie van de virale eiwitten, de bijdrage van specifieke mutaties in virale eiwitten in de virale replicatie en / of de pathogenese en, ook, virale vectoren met behulp van recombinante influenza virussen uiten van vreemde eiwitten<sup&gt; 3</sup&gt;.

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Inspanningen van diverse influenza-onderzoeksgroepen zijn cruciaal geweest voor de ontwikkeling en verbetering van reverse genetics voor het influenzavirus A. Oorspronkelijk ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om recombinant influenzavirus te genereren uit plasmide-DNA. Dit wordt bereikt door de acht influenza-gen-coderende DNA-plasmiden in een co-cultuur van 2 9 3 t- en MDCK-cellen te transfecteren met behulp van Lipofectamine 2000 als tweede stap. Het supernatant van de weefselkweek zal worden gebruikt om verse MDCK-cellen en/of 10 dagen oude geëmbryoneerde kippeneieren te infecteren, die het virus in het supernatant van de getransfecteerde cellen zullen amplificeren.Vervolgens zullen we de supernatanten van de weefselkweken en het allantoïsche vocht uit geïnfecteerde kippenembryo-eieren oogsten. Om de aanwezigheid van het virus te bevestigen met behulp van een HA-assay, worden resultaten verkregen die de aanwezigheid van het virus aantonen op basis van de aanwezigheid van agglutinatie. Hallo, ik ben Luis Martinez Rito van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of Rochester.Vandaag ga ik u laten zien hoe u recombinante influenzavirussen kunt redden uit plasmid-DNA. We gebruiken deze techniek in ons laboratorium om verschillende aspecten van de biologie van het influenzavirus te bestuderen en om potentiële vectoren en vaccins te ontwikkelen. Laten we beginnen.Verwarm vóór aanvang van de transfectie de celkweekreagentia tot 37 °C: gefosfateerde gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x, PBS-EDTA, trypsine en KO-gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) met 10% foetaal kalfserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS). Bereid vervolgens per transfectie 250 µL Opti-MEM medium en 6 tot 8 µL Lipofectamine 2000 voor en laat dit 5 tot 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Bereid het plasmidtransfectiemengsel door 1 µg plasmid-DNA toe te voegen aan een buis met 50 µL Opti-MEM medium. Voeg telkens 1 µg van de acht PDZ-plasmiden toe die virale segmenten bevatten.PB twee PB één pa ha np na m en N MS. Voeg 250 µL kamertemperatuur opti MEML PF 2000 toe aan het influenza DNA-plasmid transfectiemengsel en incubeer dit gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen suspensies van 2 9 3 T- en MDCK-cellen voor transfectie voor. De dichtheid van de 2 9 3 T- en MDCK-cellen moet 80 tot 90% confluentie bedragen.Op de dag van transfectie, bij ongeveer vijf keer 10 tot de zes cellen per 100 millimeter schaal, worden de cellen gewassen, losgemaakt en gecentrifugeerd met behulp van standaard celkweektechnieken. RESUSPENDeer 2 9 3 T-cellen in drie milliliters D-M-E-M-F-B-S-P-S. Wanneer geresuspendeerd, worden de drie milliliters overgebracht naar de MDCK-cellen voor resuspensie.Dit creëert het mengsel van 2 9 3 T- en MDCK-cellen om als co-cultuur te worden gebruikt. Voeg 250 milliliters van de 2 9 3 T-M-D-C-K-cellen per putje toe aan een zes-putjesplaat. Voeg na 20 tot 30 minuten één milliliter DMEM 10%FBS 1%PS toe aan elk van de opti M-E-M-L-P-F 2000 influenza DNA-plasmidmengsels.Voeg dit vervolgens toe aan de wells met de 250 milliliters 2 9 3 T-M-D-C-K cellen. Schud de six well plate voorzichtig en laat de transfectie gedurende de nacht incuberen in de incubator bij 37 °C en 5% CO₂. De volgende dag, 16 tot 24 uur na transfectie, wordt het transfectiemedium vervangen en worden de getransfecteerde cellen gedurende 48 uur geïncubeerd in DMEM 0,3% Bovine albumin of BA 1% PS bevattende één µg/mL L tosil lado twee phenol ethyl chlor methyl ketone of TPCK-behandelde trypsine.Indien infectie van MDCK-cellen gewenst is, zaai dan één dag vóór de infectie of twee dagen na de initiële virale transfectie verse MDCK-cellen uit; breng vervolgens 48 uur na het vervangen van het medium het supernatant van de getransfecteerde cellen over naar een microcentrifugebuisje. Centrifugeer het supernatant van de weefselkweek gedurende één tot twee minuten bij 13.000 RPM vóór infectie van de MDCK-cellen. Controleer de cellen onder de microscoop om een monolaag te bevestigen en ga dan verder met de infectie. Was de cellen tweemaal met 1 mL 1× PBS.Voeg 200 µL van de gecentrifugeerde supernatants van de weefselkweek uit eerdere stappen toe en laat dit één uur incuberen bij kamertemperatuur. Schud de plaat elke 10 minuten om uitdroging van de cellen na het uur van virale absorptie te voorkomen. Verwijder het infectiemedium van de MDCK-cellen en voeg twee milliliter DMEM 0,3%BA 1%PS toe dat één µg/mL TPCK-trypsine bevat.Een cytopathisch effect zal worden waargenomen in de geïnfecteerde MDCK-cellen 48 tot 72 uur na passage. Afhankelijk van de transfectie-efficiëntie en de viruslast bestaan de cytopathische effecten uit het afronden van cellen, celdood en loslating van het oppervlak, enzovoort. Isoleer vervolgens snat uit de MDCK-cellen voor de assay om de aanwezigheid van het virus in de weefselkweek te bevestigen.Centrifugeer de supernatten gedurende één tot twee minuten bij 13.000 RPM in een microcentrifuge om celresten te verwijderen en breng deze over naar een nieuwe centrifugebuis om kippenembryo-eieren te infecteren. Controleer de 10 dagen oude eieren met een belichtingskast (candling box) om de interface tussen de luchtkamer en de allantoïsche holte te zien. Markeer de grens van de interface met een potlood en een naald van een spuit van vijf milliliter.Maak een gaatje in de eierschaal met een spuit van 1 mL. Infecteer elk ei met 200 µL van de eerder verkregen supernatant van de weefselkweek. Dek het gaatje in de eierschaal af met gesmolten was met behulp van een wattenstaafje.Incubeer de geïnfecteerde eieren gedurende twee tot drie dagen bij 37 °C voordat het allantoïsche vocht wordt geoogst. Incubeer de kippeneieren vervolgens twee uur of een nacht bij 4 °C om het kippenembryo te doden en het bloed te laten stollen. Was de eierschalen met 70% ethanol om steriele omstandigheden te creëren.Open het ei voorzichtig boven de luchtkamer door er met een lepel op te tikken. Verwijder de gebroken eierschalen met een pincet en een naald van één milliliter. Verwijder het allantoïsche vlies zonder de eidooier te beschadigen.Stabiliseer het kiजembryo met een spatel en breng een pipet van 10 milliliter in de vloeistof van de allantoïsche holte. Verzamel zoveel mogelijk van de allantoïsche vloeistof. Verzamel per ei 8 tot 12 milliliter in een centrifugebuis van 15 milliliter op ijs.Breek of verzamel geen eigeel; centrifugeer vijf minuten bij vier graden Celsius en breng het allantoïsche vocht over in nieuwe centrifugebuisjes van 15 milliliter op ijs. Bewaar de buisjes met het gecentrifugeerde allantoïsche vocht bij vier graden Celsius totdat ze op de aanwezigheid van gereduceerd virus zijn gecontroleerd met een HA-assay. De HA-assay wordt uitgevoerd met behulp van V-bottom 96-wellplaten, met negatieve controles met PBS 1X en positieve controles van weefselkweek.Supinate en of of Alan Toic. Vloeistof van een niet-resisterende influenza virusinfectie moet altijd worden opgenomen in de NAHA-assay. Verdeel 50 µL 1X PBS over elke well van de V-bodem 96-wells plaat; voeg 50 µL van de MDCK-weefselkweeksupernatanten en of Alan Toic-vloeistof uit de geïnfecteerde eieren toe aan de eerste well en maak tweevoudige seriële verdunningen voor de volgende wells.Verwijder de overtollige 50 µL uit de laatste well. Voeg 50 µL van 0,5 tot 1% kippenrode bloedcellen toe aan elke well. Incubeer de V-bodem 96-wells plaat gedurende 30 tot 45 minuten op ijs, of totdat er een rode neerslag zichtbaar is in de bodem van een negatieve controle-PBS-sample. De aanwezigheid van virus in de MDCK-weefselkweeksupernatanten en/of in de allantoïsche vloeistof van geïnfecteerde eieren kan macroscopisch worden bepaald met behulp van hemagglutinatie van kippenrode bloedcellen.De aanwezigheid van het virus induceert hemaglutinatie, terwijl de afwezigheid van het virus de vorming van een rode pellet op de bodem van de put mogelijk maakt. Daarnaast zal het optreden van CPE, zoals celronding, celdood, loslating van het oppervlak, enzovoort, in cellen geïnfecteerd met de supernatanten van de weefselkweek of met de allantoïsche vloeistof uit eieren, wijzen op een positieve virale rescue; in het geval van het influenzavirus zijn ongeveer 10³ tot 10⁴ plaque-vormende eenheden (pfu) vereist om een positief signaal in de HA-assay te geven. Daarom kan parallel aan de HA-assay een immunofluorescentie-assay worden uitgevoerd om een echt negatief resultaat te bevestigen.Omdat de aanwezigheid van individuele virale partikels kan worden gedetecteerd door geïnfecteerde cellen te kleuren met fluorescentielabel-antilichamen, is het mogelijk dat HA-negatieve supernatanten of allantoïsche vloeistoffen positief zijn bij het gebruik van immunofluorescentie-assays. In dat geval moet het virus opnieuw worden geamplificeerd door verpakking in MDCK-cellen of eieren. Allantoïsche vloeistof en/of weefselkweeksupernatanten van de tweede passage zouden nu duidelijk positief moeten zijn in de HA-assay.We hebben zojuist gezien hoe influenza-virussen kunnen worden gered uit plasmid-DNA. Het redden van influenza-virussen uit plasmid-DNA is een eenvoudig en direct proces. Dit protocol is oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium voor het redden van recombinante influenza-virussen uit plasmid-DNA.Wij raden drie onafhankelijke transfecties per recombinant virus aan. Als er wordt geprobeerd om meer dan één recombinant influenzavirus te redden, schaal dan de stappen naar verhouding aan het aantal te redden virussen. Het volgende transfectie- en infectieprotocol om recombinante influenzavirussen uit plasmadesna te redden, is een vaardigheid voor platen met zes wells.Alle procedures voor het oogsten van LAN-toicvloeistoffen uit geïnfecteerde eieren worden onder steriele omstandigheden uitgevoerd. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors — encoding different viral structural proteins — in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

The video showcases a method to create cold-adapted recombinant influenza viruses. It involves transfecting human cells with bi-directional plasmids, followed by incubation at lower temperature incubation to yield viruses suitable for vaccine production, characterized by reduced replication in warmer conditions.

Generating  Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

Er is een algemene kennisgebrek over hoe vaccins werken. Hier stellen we het gecombineerde gebruik van omgekeerde genetica en botmerg chimerische muizen voor om inzicht te krijgen in de vroege gastheer immuunreacties op vaccins met een speciale focus op dendritische cellen en T-cel immuniteit.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Beschrijven we een methode waarmee we identificeren kritische residuen nodig zijn voor de binding van de mens of lymfkliertest monoclonal antilichamen die gericht zijn op de virale hemagglutinine van influenza A-virussen. Het protocol kan worden aangepast aan andere oppervlakte glycoproteïnen van virus en hun overeenkomstige neutraliserende antilichamen.

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Dit protocol beschrijft een experimenteel proces voor het produceren van hoogtiter infectieuze virale pseudo-getypte deeltjes (PP) met envelop glycoproteïnen uit twee influenza-A-stammen en hoe ze hun infectiviteit kunnen bepalen. Dit protocol is zeer aanpasbaar om PPS te ontwikkelen van elk ander type omhulde virussen met verschillende envelop glycoproteïnen.

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Leer hoe u recombinant griepvirus genereert uit plasmide-DNA door transfectie in 293T- en MDCK-cellen. Deze methode is essentieel voor virologisch onderzoek en vaccinontwikkeling.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Meer video's verkennen