Name: De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer hoe je hartfunctie en energetica meet in geïsoleerde muizenharten met 31P NMR-spectroscopie. Deze methode combineert Langendorff-perfusie met real-time monitoring van hoogenergetische fosfaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Lynne Spencer bedanken voor haar steun tijdens de NMR-spectroscopie deel van het experiment. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health fonds R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (aan Dr Tian) en F32 HL096284 (aan Dr Kolwicz).

<ol><li> Voor deze experimenten zijn twee aparte systemen tegelijk gebruikt. Voor de aankoop van 31 P spectra, een Bruker 14T magneet is gekoppeld aan de Avance III console en een computer uitgerust met TopSpin V2.1 software. Voor de beoordeling van de hartfunctie, een custom built hart perfusie-systeem is gekoppeld aan de PowerLab 4 / 30 data-acquisitie, uitgerust met de LabChartPro 6-software voor data-analyse. </li><li> Op de dag van het experiment, is 1 liter van de Krebs-Henseleit buffer als volgt bereid: 0.5mm EDTA, 5.3mm KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl, en 25mm NaHCO 3. Het mengsel wordt vervolgens borrelen met 5% CO 2 / 95% O 2 gedurende 10-15 minuten voorafgaand aan de toevoeging van 2 mM CaCl 2. Tot slot, substraten, in de vorm van 10 mM glucose en 0,5 mm pyruvaat, worden toegevoegd. </li><li> Temperatuurregeling tijdens het experiment is van cruciaal belang. Verwarmde circulatiepompen worden gebruikt om de temperatuur tussen 37,0 onderhouden - 37,5 ° C, terwijl het hart is in de magneet. Temperatuur is gecontroleerd voor de duur van het experiment met behulp van een glasvezel temperatuursonde. </li><li> Perfusiedruk en linker ventriculaire druk worden bewaakt via de druk transducers gekoppeld aan een data-acquisitiesysteem en weergegeven met behulp van de meegeleverde software. Deze worden gekalibreerd met een standaard sfygmomanometer voorafgaand aan het experiment. Daarnaast worden de druk lijnen voldoende gespoeld om alle luchtbellen te verwijderen. </li><li> Een standaard steekproef van 150 mM natriumfosfaat (wat gelijk is aan de ionische sterkte van de KH buffer) wordt gebruikt om "kalibreren" de sonde voor het inbrengen van het hart. Dit vergemakkelijkt het signaal en vermindert de tijd die nodig is om de overname periode begint zodra het hart is gepositioneerd binnen de sonde. </li><li> Ter vermindering van bloedstolling, is de muis geïnjecteerd met 200 eenheden van heparine IP Na 5 minuten, natriumpentobarbital (175 mg / kg) IP wordt gegeven. </li><li> Het hart wordt snel geëxcideerd (met longen en thymus intact) en gearresteerd in ijskoud KH buffer. </li><li> Terwijl op ijs bewaard, zijn de longen snel verwijderd. De lobben van de thymus worden geïdentificeerd en voorzichtig terug geschild naar de aorta bloot te leggen. De thymus is verwijderd. De aorta wordt vervolgens geïsoleerd door het zorgvuldig verwijderen van het omringende weefsel. </li><li> Micro hechten pincet gebruikt worden om voorzichtig te houden beide wanden van de aorta naar het lumen bloot te leggen. De aorta is zorgvuldig geplaatst op de canule gemaakt van 0.965 mm OD polyethyleen buis (PE50). De aorta is op zijn plaats gehouden met een micro-schip klem terwijl de hechtingen worden snel gebonden rond de aorta. De clip is verwijderd en de tang worden gebruikt om zorgvuldig te controleren of de canule boven aortawortel. Extra banden zijn toegevoegd als nodig is om het hart zijn plaats te houden. </li><li> Eventuele extra weefsel wordt verwijderd met behulp van pincet en microscissors. Een kleine incisie gemaakt in de linker oorschelp. Een 0.61 mm OD polyethyleen buis (PE10) is zorgvuldig ingebracht via het linker atrium, LV holte, en via de apex, terwijl zachtjes houdt het hart. Het teveel aan slangen is bijgesneden. </li><li> Een leeggelopen met water gevulde ballon is ingebracht door het atrium in de LV en is op zijn plaats gehouden met behulp van plakband of hechtingen. De peristaltische pomp snelheid wordt geleidelijk verhoogd om voldoende stroom te leveren aan het hart. Tot het hart is plaats in het de NMR probe, zal het hart blijven geperfuseerd met een constante stroom overeenkomt met ongeveer 2 ml / min. De LV ballon wordt opgeblazen met een klein volume met behulp van een micrometer spuit om te controleren of de LV drukomzetter functioneert. </li><li> Het hart wordt zorgvuldig ingebracht in een 10 mm NMR-buis. Een brede boring "spinner" wordt gebruikt om de buis in de juiste positie binnen de sonde gids. Het gehele apparaat is dan stevig aan de 'navelstreng' met plakband. </li><li> De navelstreng wordt langzaam zakken in de bovenste boring van magneet tot het hart / NMR-buis in de spoel van de 10 mm NMR probe. </li><li> Zodra het hart op de juiste positie binnen de sonde, is de peristaltische pomp debiet aangepast om een ​​perfusie druk van 80mmHg te bereiken. (Vergeet niet, dat tot op dit punt het hart was geperfuseerd met een constante stroom van ongeveer 2 ml / min). De perfusie druk wordt dan onderhouden door waardoor de "hold"-mechanisme op de pomp controller. Het hart is dan mag een 15-20 minuten evenwicht periode. Gedurende die tijd, is het volume van de LV ballon aangepast aan een eind-diastolische druk van 8-10 mmHg te bereiken. </li><li> Gedurende de periode van evenwicht, is het noodzakelijk om de spectrometer parameters te optimaliseren om de best mogelijke fosfor-signaal te krijgen. Dit wordt bereikt door het instellen van de radio puls op de frequentie waarop de fosfor kern resoneert ("tuning") en het maken van het magnetisch veld homogeen ("shimming"). </li><li> Na de periode van evenwicht, kunnen meerdere 31 P NMR-spectra worden verkregen. De overname periode voor elk spectrum is afhankelijk van de tHij veldsterkte van de magneet, de grootte van de steekproef, en de signaal-ruis-verhouding die nodig is voor een specifiek experiment. Spectra zijn verkregen met behulp van een 14 Telsa magneet door het gemiddelde van het signaal verkregen uit 256 radio-frequentie pulsen van 20 us met een 60 graden hoek van flip en vertraging van 2,0 seconden. Dit experiment zal ongeveer 10 minuten. </li></ol> Representatieve resultaten Uit de data-acquisitie hardware en de LabChart software kunnen verschillende parameters van de hartfunctie gemeten worden door de experimentele protocol. De typische meten van de hartfunctie, is de linker ventrikel ontwikkelde druk (LVDevP), wordt verkregen door de eind-diastolische druk (EDP) van de systolische druk (figuur 1). Deze maatregel kan variëren, afhankelijk van de stam van de muis en de conditie van het hart (dat wil zeggen, druk overbelasting). Echter, in een normale muis C57Bl6 hart LVDevP is meestal tussen de 100-110 mmHg op vaste eind-diastolische druk van 8-10 mmHg. Daarnaast heeft de LabChart programma staat voor het meten van de hartslag op basis van de cyclische metingen van de LV drukgolven. Nogmaals, kan deze maatregel variëren, maar typische waarden zijn 350 tot 400 slagen per minuut wanneer harten mogen verslaan op intrinsieke tarieven. Toch kan het hart worden gestandaardiseerd aan de hand een stimulatiesysteem waarbij de hartslag wordt gehouden op 420 bpm. Daarnaast kunnen maatregelen van de contractiliteit (+ dP / dt) en ontspanning (-dP/dt) worden geschat met behulp van de eerste afgeleide van de LV drukgolf. Tijdens de experimentele protocol is het gemakkelijk om de Starling mechanisme te beoordelen door het opnemen van een druk-volume relatie. Dit wordt bereikt door het maken van een geleidelijke verhoging van de LV ballon volume en wijzend op de LVDevP als de EDP. Deze waarden kunnen vervolgens worden uitgezet als afgebeeld in figuur 2. Terwijl de Starling curve is optimaal, wijzend op de volume nodig is om een ​​EDP van 8-10 mmHg te bereiken kan een indirecte idee van LV kamer dimensie te geven. Dit kan gebruikt worden in modellen van aorta strepen als hypertrofisch hart doorgaans zal een kleinere ballon volume nodig hebben, terwijl verwijd hart vereisen een groter volume in vergelijking met controles. Tabel 1 toont vertegenwoordiger van de hartfunctie gegevens die tijdens de perfusie-protocol. De 31 P NMR-spectrometer zal signalen van phosphocreatine (PCR) en de drie fosfaat uit ATP (γ-ATP, α-ATP en β-ATP) als anorganisch fosfaat (Pi), zoals weergegeven in figuur 2. Analyse van elk van deze pieken geeft een waarde voor het gebied onder de curve. De hoeveelheid ATP wordt geschat door het gemiddelde van de γ-ATP en β-ATP gebieden. (De α-ATP is niet gebruikt omdat NAD moleculen bijdragen aan een onbekende deel van de totale signaal). De energetische toestand van het hart wordt bepaald door het quotiënt van de PCR-en ATP-gebieden (PCR: ATP ratio). Deze waarde is meestal 1,5 tot 1,7 in een muis hart geleverd met glucose als primaire substraat. Hoewel de 31 P-NMR biedt geen directe maatregelen van de ATP-of PCR-, de oppervlakte van de pieken is evenredig met het bedrag van de fosfor bevattende verbindingen in het monster. Waarden voor deze signalen kunnen worden geschat met behulp van andere methoden. Zo kunnen bijvoorbeeld de directe maatregelen van de ATP door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) in een cohort van harten leveren een gemiddelde concentratie. Deze waarde kan dan worden gebruikt om de gemiddelde ATP gebieden waargenomen in de spectra te kalibreren. De PCR-concentratie kan worden berekend op basis van de PCR-gebied ten opzichte van het ATP-gebied. Het is ook mogelijk om de pH schatten door het analyseren van de relatieve chemische verschuiving van het anorganisch fosfaat (Pi) signaal naar de PCR-signaal. 1 Met behulp van verschillende radio-puls sequenties, de creatine kinase reactie snelheid of de ATP-synthese reactie snelheid kan ook worden gemeten. 2 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. Baseline hartfunctie van geïsoleerde doorbloed hart. LVDevP: linker ventrikel ontwikkeld druk; LVEDP: linker ventrikel eind-diastolische druk; HR: de hartslag, RPP: rate pressure product; + dP / dt: eerste afgeleide LV druk positief; -dP/dt: eerste afgeleide LV druk negatief; PP : perfusiedruk; CF: coronaire flow. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vertegenwoordiger LV drukgolven van LabChart Pro-software. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger Starling curven van de controle (vaste lijn) en aorta gestreepte (stippellijn) muizen. A) systolische functie vertegenwoordigd door LVDevP meer dan verhogen LV volumes, zoals bepaald door het volume van de LV ballon. B) diastolische functie vertegenwoordigd door EDP meer dan verhogen LV volumes, zoals bepaald door het volume van de LV ballon. LVDevP: linker ventrikel ontwikkeld druk (systolische minus diastolische pressure), EDP: eind-diastolische druk. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger van 31 P-NMR-spectra van geïsoleerde geperfuseerd muis hart. Let op de relatief kleine Pi piek. In een aëroob perfusie hart geleverd met pyruvaat of vetzuren in aanvulling op glucose, moet deze piek minimaal zijn. Tijdens perioden van ischemie, deze piek toe, terwijl de PCR-top af. Let op de schouder aan de rechterkant van de α-ATP piek. Dit is de bijdrage van NAD moleculen. Pi: anorganisch fosfaat; PCR: phosphocreatine; ATP: adenosine trifosfaat.

<ol><li>Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+increased+glycolysis+in+the+hypertrophied+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart.</a> Hypertension. 44, 662-667 (2004).</li>
<li>Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+creatine+kinase+enzyme+kinetics+in+diabetic+cardiomyopathy.+A%2831%29P+NMR+magnetization+transfer+study+of+the+intact+beating+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).</li>
<li>Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles.</a> Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).</li>
<li>Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngwall%2C+JS+%22Cardiovascular+physiology+in+the+genetically+engineered%22">Cardiovascular physiology in the genetically engineered</a>. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).</li>
<li>Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+contractile+and+metabolic+reserve+in+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha-null+hearts+can+be+rescued+by+increasing+glucose+transport+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization.</a> Circulation. 112, 2339-2346 (2005).</li>
<li>Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+uptake+and+oxidation+in+mouse+hearts+prevent+high+fatty+acid+oxidation+but+cause+cardiac+dysfunction+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity.</a> Circulation. 119, 2818-2828 (2009).</li>
<li>Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+remodels+metabolic+network+in+favor+of+cardiac+glycogen+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage.</a> J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li>
<li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li>
<li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li>
<li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li>
<li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li>
</ol>

31 P-NMR-spectroscopie in de Langendorff-geperfuseerde geïsoleerde muis hart biedt betrouwbare en reproduceerbare gegevens. 3, 4 Echter, het noodzakelijk is dat canulatie van de aorta en het inbrengen van de LV ballon klaar bent goed zoals om een stabiele prestaties van hart toe, terwijl binnen in de NMR buis. Daarnaast, temperatuurregeling van het grootste belang om een ​​goede baseline functie te bereiken. Een belangrijke factor bij het verkrijgen van een goede, analyseerbaar NMR-spectra is het verhogen van de signaal-ruisverhouding. Dit kan worden bereikt door te zorgen voor een optimale &quot;tuning&quot; en &quot;vulplaten&quot; op het monster. Zoals vermeld in het protocol tekst, kan het gebruik van een standaard monster voorafgaand aan het inbrengen van het hart vergemakkelijken. Het is ook nuttig om te beschikken over een adequaat sized &quot;monster&quot;. Harten van minder dan 100 mg leveren in de regel lager PCr en ATP-signalen, neemt in de acquisitie tijd zal nodig zijn om een ​​goede fosfor spectra te verkrijgen. Er zijn verschillende manieren om het bestaande protocol te wijzigen om aanvullende informatie over de hartfunctie en energetica Garner. In ons laboratorium hebben we perfusie harten met gemengde substraat buffers die de aanwezigheid van verschillende combinaties van vetzuren (in lage en hoge concentraties), lactaat, ketonen, en insuline kunnen bevatten. Met het gebruik van stabiele isotopen in de perfusie buffer (dat wil zeggen, 13 C gelabelde substraten), hebben we de mogelijkheid om substraatgebruik schatting van de relatieve bijdrage van gelabelde acetyl CoA naar de TCA cyclus bezitten. 5-7 Voor deze toepassing, voeren we isotopomeer analyse van de 13-C3 en C4 13-glutamaat met 13 C-NMR-spectroscopie. Dit vereist het hart aan het einde van de perfusie protocol freeze-klemmen en het uitvoeren van een extractie van het bevroren weefsel. Dit zal een extra experiment als de analyse van het gebruik van een andere sonde met een apart setup-parameters nodig zijn. Andere toepassingen zijn onder meer de vervanging van glucose met deoxyglucose in de buffer, terwijl het toezicht op de tijdsafhankelijke accumulatie van 2-deoxyglucose fosfaat in het hart met behulp van 31 P-NMR-spectroscopie. Deze methode maakt het mogelijk voor het meten van myocard de opname van glucose. 7, 8 Daarnaast is ons laboratorium heeft geanalyseerd hartfunctie en energetica in perfusie protocollen die bestaat uit ischemie / reperfusie en hoge werkdruk uitdaging. 6, 8-10 In het kort, 31 P-NMR-spectroscopie in geïsoleerde muis harten is een technisch uitdagend procedure waarbij het ​​gebruik van geavanceerde apparatuur. Echter, de gegevens die het oplevert is van onschatbare waarde voor de onderzoeker die wil analyseren de functie en de energetica van bioengineered muismodellen. Voor ons laboratorium, zijn deze technieken zijn van vitaal belang in ons begrip van de gevolgen van een verscheidenheid van stressoren op de hartfunctie, energetica, en de stofwisseling. 1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloridedihydraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>Apparatuur</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pompcontroller&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltische pomp&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;Wegwerp BP-transducer&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>10 mm NMR-buisje</td><td>Apparatuur</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buisje PE10</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;Fysiologische druktransducer&lt;/a&gt;</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buisje PE50</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Micrometerspuit</td><td>Apparatuur</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-tang</td><td>Apparatuur</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>Castraviejo microschaar</td><td>Apparatuur</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Neoptix signaalconditioner</td><td>Apparatuur</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

de beoordeling van de hartfunctie en energetica in geïsoleerde mouse hearts gebruik 31 p nmr-spectroscopie

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered muismodellen zijn geworden krachtige research tools bij het bepalen van causale verbanden tussen moleculaire veranderingen en modellen van hart-en vaatziekten. Hoewel de moleculaire biologie is nodig bij het identificeren van de belangrijkste veranderingen in de signaleringsroute, is het niet een surrogaat voor functionele betekenis. Terwijl de fysiologie kan antwoorden op de vraag van de functie, een combinatie van fysiologie met biochemische evaluatie van metabolieten in het intacte, kloppend hart zorgt voor een compleet beeld van de hartfunctie en energetica. Al jaren is ons laboratorium gebruikt worden geïsoleerd hart perfusie in combinatie met nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om deze taak te volbrengen. De linker ventrikel functie wordt beoordeeld door Langendorff-mode geïsoleerde hart perfusies terwijl hart-energetica wordt gemeten door het uitvoeren van<sup&gt; 31</sup&gt; P magnetische resonantie spectroscopie van de geperfuseerde harten. Met deze technieken kunnen indices van de hartfunctie in combinatie met de niveaus van phosphocreatine en ATP gelijktijdig worden gemeten in kloppende harten. Bovendien kunnen deze parameters gecontroleerd te worden tijdens fysiologische of pathologische stressoren worden ingesteld. Zo kan bijvoorbeeld ischemie / reperfusie of een hoge werkdruk uitdaging protocollen worden vastgesteld. Het gebruik van de aorta strepen of andere modellen van cardiale pathologie geneigd zijn ook. Onafhankelijk van de varianten binnen het protocol, kan de functionele en energetische betekenis van moleculaire modificaties van transgene muismodellen adequaat beschreven worden, wat leidt tot nieuwe inzichten in de bijbehorende enzymatische en metabole routes. Daarom,<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR-spectroscopie in het geïsoleerde geperfuseerde hart is een waardevol onderzoek techniek in diermodellen van hart-en vaatziekten.

Langendorff-mode geïsoleerde perfusie hart, in combinatie met<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR-spectroscopie, combineert op het gebied van biochemie en fysiologie in een experiment. Het protocol voorziet in de dynamische meting van de hoge energie-fosfaatgehalte en de omzet in het hart, terwijl tegelijkertijd de controle fysiologische functie. Bij het correct wordt uitgevoerd, is dit een waardevolle techniek bij de beoordeling van de cardiale energetica.

De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie

Bio-engineered muismodellen zijn krachtige onderzoeksinstrumenten geworden bij het vaststellen van causale relaties tussen moleculaire veranderingen en modellen van ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de hartfunctie en energetica in een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart te observeren. Dit wordt bereikt door een muizenhart te perfunderen in LOR-modus. Met Krebs-buffer, verrijkt met glucose en pyruvaat als tweede stap, wordt een watergevulde ballon in de linker ventrikel of lv geplaatst, wat een constante monitoring van de hartfunctie tijdens het experiment mogelijk maakt.Vervolgens wordt het hart in een NMR-buis van 10 millimeter geplaatst en in de magneet ingebracht om de cardiale energetica te beoordelen door de resonanties van fosfocreatinefosfaten van een TP te observeren, waarbij de anorganische fosfaatresultaten werden verkregen die de cardiale functie en energetica aantonen op basis van de LV-drukstroomgolven en P 31 en massaspectroscopie p. Hallo, ik ben Steve Kitz van het MIT Cadre Metabolism Center in de afdeling Anesthesiologie van de University of Washington. Vandaag laat ik u een procedure zien voor geïsoleerde hartperfusie gecombineerd met 31 PNMR-spectroscopie.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de hartfunctie en energetics in onze bio-engineered muismodellen te beoordelen. Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, bereidt u één liter Krebs-Henseleit of KH-buffer.Introduceer 5% koolstofdioxide en 95% zuurstofbubbels in het mengsel gedurende 10 tot 15 minuten. Voeg vervolgens twee millimolair calciumchloride toe, gevolgd door substraten: 10 millimolair glucose en 0,5 millimolair pyruvaat. Voor deze experimenten worden twee afzonderlijke systemen gelijktijdig gebruikt per acquisitie van P 31-spectra.Een BRUER 14 T magneet is gekoppeld aan de advanced three console en een computer uitgerust met top spin V 2.1 software voor de beoordeling van de hartfunctie. Een op maat gebouwd hartperfusiesysteem is gekoppeld aan de power lab. Vier 30 data acquisitie.Uitgerust met de lab chart PRO six software voor data-analyse. Het hartperfusie-apparaat bevat een mini pulse three peristaltische pomp, aangestuurd door een STH pompmodule, die wordt gebruikt om de KH-buffer in het hart te perfunderen. Temperatuurregulatie tijdens het NMR-experiment is cruciaal. Verwarmde circulatoren worden gebruikt om de temperatuur tussen 37,0 en 37,5 °C te houden terwijl het hart zich in de magneet bevindt, waarbij de temperatuur gedurende het experiment wordt bewaakt met een glasvezeltemperatuursensor.Gedurende het hele experiment worden de LV-druk en de perfusiedruk gemonitord via druktransducers die zijn aangesloten op een datas acquisitiesysteem en worden weergegeven met de bijgeleverde software. Een fysiologische transducer wordt gebruikt om de LV-druk te monitoren en een wegwerpbloeddruktransducer wordt gebruikt om de perfusiedruk te monitoren. Tot slot wordt een navelstreng gebruikt om de verwarmde, zuurstofrijke buffer aan het hart toe te dienen.Zodra u zich in de magneet bevindt, kalibreert u vóór aanvang van het experiment de druktransducers met de standaarden van de fig moment manometer; plaats deze eerst zonder druk op de transducer om de kalibratie te nulstellen. Pomp vervolgens deze fig mode manometer op tot een hogere druk. Voer deze waarde in het computerprogramma in.Bevestig vervolgens dat de druktransducers adequaat zijn gekalibreerd door deze fig moment manometer op te pompen tot bekende drukken en deze te verifiëren op het computerscherm. Zodra de druktransducers zijn gekalibreerd, kalibreert u de NMR-probe met een 10 millimeter NMR-buis die een standaardmonster van 150 millimolair natriumfosfaat bevat. Voer de kalibratie uit met behulp van het softwareprogramma TopSpin.Stel eerst het monster af om de frequentie van de fosforresonantie in te stellen. Shim vervolgens het monster om een homogeen magnetisch veld te creëren. Deze initiële kalibratie verbetert het signaal en verkort de tijd die nodig is om de acquisitieperiode te starten.Zodra het hart is gepositioneerd binnen de probe om te beginnen met de extractie van het muizenhart, injecteer dan 200 units heparine intraperitoneaal om stolling te verminderen. Dien na vijf minuten 175 mg/kg natriumpentobarbital intraperitoneaal toe. Zodra de muis is geanestheseerd, leg deze dan op de rug en plak de armen en benen vast om het borstgebied bloot te leggen.Voer een knijptest bij de teen uit om er zeker van te zijn dat de muis volledig is geanestheseerd. Maak een incisie. Open de peritoneumholte en de borstkas met een schaar en gebruik een pincet om de ribbenkast terug te pellen en de borstholte bloot te leggen. Houd het longweefsel vast en til het hart voorzichtig op met een gebogen schaar.Snijd de grote bloedvaten achter het hart door en ga langzaam richting de kop van de muis totdat het hart is vrijgemaakt. Stop het hart onmiddellijk in ijskoude KH-buffer. Houd de organen op ijs en verwijder snel de longen.Identificeer de loben van de thymus en pel deze voorzichtig terug om de aorta bloot te leggen. Verwijder vervolgens de thymus. Isoleer tot slot de aorta door al het omliggende weefsel zorgvuldig te verwijderen.Houd met microsutuurpincetten over het algemeen beide wanden van de aorta vast om het lumen bloot te leggen. Plaats vervolgens de aorta voorzichtig op de canule. Deze is gemaakt van polyetheenbuis met een buitendiameter van 0,965 millimeter.Houd de aorta op zijn plaats met een microvasculaire klem en knoop snel hechtingen rond de aorta. Verwijder de klem zodra de hechtingen zijn geknoopt. Gebruik de pincet om zorgvuldig te controleren of de canule zich boven de aortawortel bevindt.Voeg eventuele aanvullende hechtingen toe die nodig zijn om het hart op zijn plaats te houden. Verwijder extra weefsel met de pincet en microschaar. Maak vervolgens een kleine incisie in de linker aurikel.Houd het hart voorzichtig vast en voer een polyetheenbuisje met een buitendiameter van 0,61 millimeter voorzichtig via het linkeratrium en de linkerventrikelholte in, tot aan de apex. Trim het overtollige buisje. Voer vervolgens een leeggelaten, met water gevulde ballon via het atrium in de linkerventrikel.Bevestig de ballon met plakband. Verhoog vervolgens geleidelijk de snelheid van de peristaltische pomp om een voldoende doorstroming naar het hart te waarborgen. Ga door met het perfunderen van het hart met KH-buffer met een constante stroomsnelheid van ongeveer twee milliliter per minuut totdat het hart in de NMR-probe is geplaatst.Knal de LV-ballon op met een klein volume met behulp van een micrometerspuit om te verifiëren dat de LV-druktransducer functioneert voor NMR-spectroscopie. Plaats eerst het hart voorzichtig in een 10 millimeter NMR-buis. Er wordt een brede boar-spinner rond de NMR-buis geplaatst om te helpen de buis in de juiste positie te leiden.Bevestig de gehele opstelling stevig aan de navelstreng met plakband binnen de probe. Laat vervolgens de navelstreng langzaam in de bovenste opening van de magneet zakken tot de NMR-buis met het hart zich in de spoel van de 10 millimeter NMR-probe bevindt. Zodra het hart de juiste positie in de probe heeft ingenomen, wordt de flow van de parasitairpompo aangepast om een perfusiedruk van 80 millimeters kwik te bereiken.Handhaaf de perfusiedruk door het hold-mechanisme op de pompregelaar te activeren. Laat het hart 15 tot 20 minuten equilibreren. Pas tijdens de equilibratieperiode het volume van de LV-ballon aan om een einddiastolische druk van 8 tot 10 mmHg te bereiken.Optimaliseer vervolgens de parameters van de spectrometer om het best mogelijke fosforsignaal te verkrijgen. Stem het NMR-instrument af door de radiopuls in te stellen, zodat de frequentie wordt bepaald waarbij de fosforkern resoneert. Shim vervolgens het monster om het magneetveld homogeen te maken na de equilibratieperiode.Start de acquisitie van meerdere 31P-NMR-spectra. De acquisitieperiode voor elk spectrum is afhankelijk van de veldsterkte van de magneet, de grootte van het monster en de vereiste signaal-ruisverhouding voor een specifiek experiment. In dit geval worden de spectra verkregen met een magneet van 14 Tesla door het signaal van 256 radiofrequentiepulsen van 20 microseconden te middelen, met een fliphoek van 60 graden en vertragingen van 2,0 seconden.Dit experiment zal ongeveer 10 minuten in beslag nemen. Een typische maatstaf voor de hartfunctie, de LV-ontwikkelde druk, wordt verkregen door de einddiastolische druk of EDP af te trekken van de systolische druk. Bij een normale C 57 black six muis ligt de LV-ontwikkelde druk van het hart doorgaans tussen 100 en 110 millimeters kwik bij een vaste einddiastolische druk van 8 tot 10 millimeters kwik.Representatieve stylingcurves zijn weergegeven van controlemuizen en muizen met een aortebandage. De systolische functie wordt weergegeven door de ontwikkelde LV-druk bij toenemende LV-volumes, bepaald op basis van het volume van de LV-ballon. De diastolische functie wordt weergegeven door de EDP bij toenemende LV-volumes.³¹P NMR-spectra van een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart tonen signalen van fosfocreatinine of PCR, de drie fosfaten van een TP en anorganisch fosfaat of pi. Hier is de PI-piek relatief klein. Dit is kenmerkend voor een aeroob geperfuseerd hart dat is voorzien van pyruvaat of vetzuren.Naast glucose neemt deze piek toe tijdens perioden van ischemie, terwijl de PCR-piek afneemt. Ik heb u zojuist laten zien hoe u een muizenhart voorbereidt voor perfusie, zodat zowel de hartfunctie als de energetica gelijktijdig tijdens het experiment kunnen worden gemeten. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het hart adequaat wordt geperfuseerd.Anders zullen uw NMR-gegevens niet betrouwbaar zijn. Dat is alles. Dank u wel en veel succes met uw experimenten.

assessment-cardiac-function-energetics-isolated-mouse-hearts-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit werk beschrijft elementaire procedures van niet-invasieve kleine dieren MRI en...

Niet-invasieve In Vivo Small Animal MRI en MRS: Basic experimentele procedures

Het doel is om de mitochondriale redox toestand van geïsoleerde harten te volgen in het kader van fysiologische preload en afterload druk. Een biventriculaire werken konijn hart model wordt gepresenteerd. Hoge resolutie tijdruimtelijke fluorescentie beeldvorming van NADH wordt gebruikt om de mitochondriale redox staat epicardiale weefsel volgen.

NADH fluorescentie beeldvorming van geïsoleerde Biventriculaire Werken Rabbit Hearts

Deze studie toont de succesvolle implementatie van magnetische resonantiemicroscopiebeeldvorming aan als een niet-invasieve tool om de hartafwijkingen te beoordelen bij muizen die zijn getroffen door auto-immuun myocarditis. De gegevens geven aan dat de techniek kan worden gebruikt om de ziekteprogressie bij levende dieren te volgen.

Niet-invasieve evaluatie van cardiale afwijkingen in experimentele autoimmuun Myocarditis door Magnetic Resonance Imaging Microscopy in de muis

Deze methode beschrijft het gebruik van Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) om de hartmorfologie, functie, perfusie, metabolisme en levensvatbaarheid te beoordelen met behulp van een gejodeerd contrastmiddel bij muizen met experimenteel geïnduceerde myocardischemie. De techniek kan worden toegepast voor niet-destructieve, longitudinale in vivo beeldvorming met hoge doorvoer van verschillende diermodellen van menselijke hartaandoeningen.

In vivo kwantitatieve beoordeling van myocard structuur, functie, perfusie en levensvatbaarheid Met behulp van Cardiac Micro-computertomografie

Hier introduceren we een methode voor het gebruik van een intra-ventrikel optische katheter in geperfundeerd harten om Absorptie spectroscopie uit te voeren over de hart muur. De verkregen gegevens bieden robuuste informatie over de zuurstofspanning van het weefsel, evenals substraat gebruik en membraanpotentiaal gelijktijdig met cardiale prestatie maatregelen in deze alomtegenwoordige voorbereiding.

Intra-cardiale side-afvuren licht katheter voor het monitoren van cellulaire metabolisme met behulp van Transmural extinctie spectroscopie van Geperfectiongebruikt zoogdieren harten

Deze studie beschrijft een uitgebreid cardiovasculair magnetisch resonantie beeldvorming (CMR) protocol om de linker ventriculaire functionele parameters van het muishart te kwantificeren. Het protocol beschrijft de verwerving, nabewerking en analyse van de CMR-beelden en de beoordeling van verschillende cardiale functionele parameters.

Kwantificering van de linkerventrikelfunctie van het muishart, myocardiale spanning en hemodynamische krachten door cardiovasculaire magnetische resonantiebeeldvorming

We beschrijven een experimentele opstelling voor het toedienen van hyperpolarized 13C-gelabelde metabolieten in continue perfusiemodus aan een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart. Een speciale 13C-NMR-acquisitiebenadering maakte de kwantificering van metabole enzymactiviteit in realtime mogelijk, en een multiparametrische 31P-NMR-analyse maakte de bepaling van het atp-gehalte en de pH van het weefsel mogelijk.

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie

Het huidige protocol beschrijft het verkrijgen van de druk-volumerelatie door middel van transoesofageale stimulatie, wat dient als een waardevol hulpmiddel bij het evalueren van de diastolische functie in muismodellen van hartfalen.

Een pacing-gecontroleerde procedure voor de beoordeling van hartslagafhankelijke diastolische functies in muizen hartfalen modellen

Dit artikel beschrijft de procedures voor het implanteren van een roman hydrogel in falende harten en kwantificeren van het effect op de linker ventrikel wand stress en functie. Deze procedures zijn met succes toegepast bij honden en mensen.

Vermindering van Linksventriculaire Muur Stress en verbetering in functie in gebreke Harten behulp Algisyl-LVR

Contrast-versterkte cardiale magnetische resonantie (CMR) beeldvorming maakt het mogelijk...

Evaluatie van de hartfunctie en myocard morfologie Met kleine dieren Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI bij ratten

Leer hoe je hartfunctie en energetica meet in geïsoleerde muizenharten met 31P NMR-spectroscopie. Deze methode combineert Langendorff-perfusie met real-time monitoring van hoogenergetische fosfaten.

De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik³¹ P NMR-spectroscopie

Meer video's verkennen