De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie
31 augustus 2010
Langendorff-mode geïsoleerde perfusie hart, in combinatie met 31 P NMR-spectroscopie, combineert op het gebied van biochemie en fysiologie in een experiment. Het protocol voorziet in de dynamische meting van de hoge energie-fosfaatgehalte en de omzet in het hart, terwijl tegelijkertijd de controle fysiologische functie. Bij het correct wordt uitgevoerd, is dit een waardevolle techniek bij de beoordeling van de cardiale energetica.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de hartfunctie en energetica waar te nemen in een geïsoleerd geperfundeerd muishart. Dit wordt bereikt door een muishart te perfunderen in LOR-modus. Met Krebs handselecteer buffer verrijkt met glucose en pyruvaat als tweede stap, wordt een met water gevulde ballon in het linker ventrikel of lv geplaatst, wat constant monitoring van de hartfunctie tijdens het experiment mogelijk maakt.
Vervolgens wordt het hart in een 10 millimeter NMR-buis geplaatst en in de magneet geplaatst om de hartenergetica te beoordelen door observatie van de resonanties van fosfocreatinefosfaten van een TP en de resultaten van anorganisch fosfaat werden verkregen die hartfunctie en energetica tonen op basis van de LV-drukgolven en P 31 en een massaspectroscopie p. Hallo, ik ben Steve Kitz van het MIT Cadre Metabolism Center in het Department of Anesthesiology aan de University of Washington. Vandaag laat ik u een procedure zien voor geïsoleerde hartperfusie gecombineerd met 31 PNMR spectroscopie.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de hartfunctie en energetica te beoordelen in onze bio-ingenieurs muismodellen. Dus laten we beginnen. Om dit protocol te beginnen, bereidt u één liter kres, vandaar licht of KH-buffer voor.
Introduceer 5% koolstofdioxide en 95% zuurstofbelletjes in het mengsel gedurende 10 tot 15 minuten. Voeg vervolgens twee millimolair calciumchloride toe, gevolgd door substraten, 10 millimolair glucose en 0,5 millimolair pyruvaat. Voor deze experimenten worden twee afzonderlijke systemen tegelijkertijd gebruikt per verwerving van P 31 Spectra.
Een BRUER 14 T-magneet is geïnterfaced met de geavanceerde drie console en een computer uitgerust met top spin V 2.1 software voor beoordeling van de hartfunctie. Een op maat gebouwd hartperfusiesysteem is geïnterfaced met de power lab. Vier 30 gegevensaanvraag.
Uitgerust met de lab chart PRO zes software voor gegevensanalyse. Het hartperfusieapparaat omvat een mini pulse drie peristaltische pomp geregeld door een STH-pompcontroller die wordt gebruikt om de KH-buffer in het hart te perfunderen. Temperatuurregulatie tijdens het NMR-experiment is cruciaal. Verwarmde circulators worden gebruikt om de temperatuur tussen 37,0 tot 37,5 graden Celsius te handhaven terwijl het hart zich in de magneet bevindt en de temperatuur gedurende de duur van het experiment wordt gemonitord met behulp van een fiber optische temperatuursonde.
Gedurende het experiment worden de LV-druk en perfusiedruk gemonitord via druktransducers die zijn bevestigd aan een gegevensverzamelsysteem en weergegeven met behulp van de meegeleverde software. Een fysiologische transducer wordt gebruikt om de LV-druk te monitoren en een wegwerpbloeddruktransducer wordt gebruikt om de perfusiedruk te monitoren. Ten slotte wordt een navelstrengsnoer gebruikt om het verwarmde geoxideerde buffer aan het hart te leveren.
Eenmaal in de magneet, vóór het begin van het experiment, kalibreer de druktransducers met de standaarden fig moment manometer eerst plaats, geen druk in de transducer, om de kalibratie te bereiken. Blaas vervolgens deze fig mode manometer op tot een hogere druk. Voer deze waarde in het computerprogramma in.
Bevestig vervolgens dat de druktransducers voldoende zijn gekalibreerd door deze fig moment manometer op bekende drukken op te blazen en ze op het computerscherm te verifiëren. Nadat de druktransducers zijn gekalibreerd, kalibreer de NMR-sonde met een 10 millimeter NMR-buis met een standaard monster van 150 millimolair natriumfosfaat. Voer de kalibratie uit met behulp van het top spin softwareprogramma.
Eerst moet u de monsterfrequentie van de fosforresonantie instellen. Schik vervolgens het monster om een homogeen magnetisch veld te creëren. Deze initiële kalibratie vergemakkelijkt het signaal en verkort de tijd die nodig is om met de verwervingsperiode te beginnen.
Eenmaal het hart in de sonde is gepositioneerd om met de muishartextractie te beginnen, injecteert u de muis met 200 eenheden heparine intraperitoneaal om coagulatie te verminderen. Na vijf minuten, toedien 175 milligram per kilogram natrium Penta barbital intraperitoneaal. Zodra de muis is verdoofd, plaatst u hem op zijn rug en tapeert u de armen en benen om het borstgebied te onthullen.
Voer een teenprik uit om er zeker van te zijn dat de muis volledig verdoofd is. Snijd. Open de buikholte en borst met schaar en gebruik pincetten om het borstbeen terug te pellen en een borsthohling te onthullen met pincetten. Houd vast aan het longweefsel en til het hart voorzichtig op met gebogen schaar.
Snijd de grote bloedvaten achter het hart en ga langzaam in de richting van het hoofd van de muis tot het hart vrij is. Arresteer onmiddellijk het hart in ijskoud KH-buffer. Houd de organen op ijs en verwijder snel de longen.
Identificeer de lobben van de thymus en pelle ze voorzichtig terug om de aorta te onthullen. Verwijder vervolgens de thymus. Isoleer ten slotte de aorta door voorzichtig alle omliggende weefsel te verwijderen.
Gebruik micro naaipincetten om beide wanden van de aorta algemeen vast te houden om het lumen te onthullen. Plaats vervolgens de aorta voorzichtig op de canule. Gemaakt van 0,965 millimeter buitendiameter polyethyleen buis.
Houd de aorta op zijn plaats met een micro vatenklem en bind snel hechtingen rond de aorta. Zodra de hechtingen zijn vastgebonden, verwijder de klem. Gebruik de pincetten om voorzichtig te controleren of de canule boven de aortawortel is geplaatst.
Voeg eventueel extra snoeren toe die nodig zijn om het hart op zijn plaats te houden. Verwijder eventueel overtollig weefsel met de pincetten en micro schaar. Maak vervolgens een kleine insnijding in de linker orakel.
Houd voorzichtig het hart vast en plaats voorzichtig 0,61 millimeter od polyethyleen buis door het linker atrium, de linker ventrikelholte en uit door de apex. Trim de overtollige buis. Plaats vervolgens een opgeblazen watergevulde ballon door het atrium in het linker ventrikel.
Houd de ballon op zijn plaats met plakband. Verhoog vervolgens geleidelijk de peristaltiekpompsnelheid om voldoende stroom naar het hart te bieden. Continueer het perfund
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor Langendorff-modus geïsoleerde hartperfusie gecombineerd met 31P NMR-spectroscopie, waardoor dynamische meting van cardiale energetica mogelijk wordt. De methode maakt gelijktijdige bewaking van hoog energie fosfaatgehalte en hartfunctie mogelijk in een geïsoleerd muizenhart.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiologie
- Biochemie
- NMR-spectroscopie
Achtergrond
- Langendorff-perfusie is een techniek die wordt gebruikt om hartfunctie te bestuderen.
- 31P NMR-spectroscopie biedt inzicht in energiemetabolisme in hartweefsel.
- Deze methode maakt real-time beoordeling van cardiale energetica mogelijk.
- Begrip van cardiale energetica is cruciaal voor het evalueren van hartgezondheid en ziekte.
Doel van de studie
- Om hartfunctie en energetica in een geïsoleerd muizenhart te observeren.
- Om de impact van verschillende substraten op hartprestaties te beoordelen.
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor toekomstige cardiale energetica-studies.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Krebs-Henseleit buffer met glucose en pyruvaat.
- Inbrengen van een watergevulde ballon in de linkerventrikel voor drukbewaking.
- Gebruik van een 10 mm NMR-buis voor het beoordelen van cardiale energetica.
- Calibratie van drukhulpstukken en NMR-sondes voor nauwkeurige metingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en perfusie van het muizenhart.
- Real-time bewaking van linkerventrikeldruk en perfusiedruk.
- Dynamische meting van hoog energie fosfaten tijdens het experiment.
- Inzichten in de relatie tussen substraatbeschikbaarheid en hartfunctie.
Conclusies
- Het protocol combineert effectief fysiologische en biochemische beoordelingen.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cardiale energetica in onderzoeksomgevingen.
- Toekomstige studies kunnen op deze methodologie voortbouwen om hartgezondheid te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts, providing a physiologically relevant system for evaluating molecular modifications in cardiovascular disease models. By integrating Langendorff perfusion with 31P NMR spectroscopy, researchers can obtain real-time, quantitative readouts of high-energy phosphate metabolites alongside hemodynamic parameters, supporting mechanistic de-risking in target validation and preclinical screening workflows. The approach enhances predictive confidence by linking molecular alterations to functional and metabolic phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring how genetic or pharmacological interventions affect cardiac energetics and function in intact, beating hearts.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous monitoring of LV developed pressure and phosphocreatine/ATP levels under physiological or pathologic stress.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds or genetic modifications that preserve energetic homeostasis during ischemia/reperfusion or high-workload challenges.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline cardiac function and metabolite levels in a reproducible, Langendorff-perfused format.
- Quantitative Outputs: Generates simultaneous, real-time measurements of hemodynamic function (LV pressure) and biochemical energetics (PCr, ATP, Pi) for multi-parametric assay development.
- Scalability & Reuse: The isolated heart platform can be adapted across disease models (e.g., aortic banding, transgenic models) to enable consistent, cross-project evaluation of cardiac safety and efficacy signals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly assesses the functional and energetic significance of molecular modifications in transgenic models of cardiac pathology, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical evaluation by providing a quantitative, physiologically anchored readout of cardiac health.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by detecting early energetic dysfunction that may predict late-stage clinical failure in cardiovascular programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical assessment, offering a reusable platform for evaluating cardiac liability and target engagement in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in cardiac energetics and contractile function.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through controlled perfusion conditions, real-time pressure monitoring, and consistent NMR spectral acquisition.
- Analytics: Delivers quantitative, multi-parametric readouts (LV developed pressure, end-diastolic pressure, PCr/ATP ratios, Pi shifts) that allow objective comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by maintaining physiological relevance while enabling biochemical interrogation of metabolic pathways in intact hearts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, cross-functional capability applicable to cardiovascular, metabolic, and mitochondrial toxicity programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating molecular changes with direct measurements of cardiac function and high-energy phosphate metabolism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized buffer preparation, temperature control, pressure transducer calibration, and NMR shimming procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic or metabolically disruptive compounds early, reducing late-stage attrition in cardiovascular drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets and leads by providing early insight into energetic reserve and stress resilience in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isolated heart perfusion, NMR spectroscopy, and pressure transducer calibration.
- Dependent on access to high-field NMR spectrometers (e.g., 14T) and specialized perfusion hardware compatible with magnet bore constraints.
- Necessitates cross-team standardization between physiology, pharmacology, and NMR analytics teams for consistent data acquisition and interpretation.
- Adaptation considerations include model-specific adjustments to perfusion pressure, balloon volume, and substrate composition based on disease phenotype or genetic background.
- Practical limitations include signal-to-noise constraints in low-abundance metabolite detection and the need for rigorous exclusion of ischemic artifacts during setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
