Name: Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer een transurethrale methode om urineweginfecties bij muizen te induceren en te kwantificeren. Dit protocol omvat bacteriële inoculatie, katheterisatie en weefselanalyse voor infectieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Shelly Xie en Jennifer Payne erkennen voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van de Society of Pediatric Urologie en de Stanford Pediatric Research Fund.

I. Voorbereiding van de urethrale katheters <ol><li> Voor elke muis blaas en nieren te bemonsteren, Plaats 5-6 roestvrij staal kralen (blaas, 1,6 mm formaat of 0,9-2,0 mm blend) of zirkoniumoxide kralen (nier, 0,5 mm formaat) in een cryovial buis, respectievelijk. Autoclaaf de kraal-bevattende buizen. </li><li> Na de buizen afkoelen tot kamertemperatuur, voeg 200 microliter van steriele PBS aan elk roestvrij staal bead-bevattende buis en 400 microliter van steriele PBS aan elk zirkoonoxide bead-bevattende buis. </li><li> We bereiden urethrale katheters zoals beschreven door Hung en Hultgren 13. Autoclaaf een schoon paar platte kop en fijn pincet schaar (iris of vergelijkbaar type) en laat de instrumenten om af te koelen tot kamertemperatuur. Veeg de oppervlakken van een laminaire stroming kap met 70% ethanol. In de kap, snijd een 30 cm (bij benadering) segment van polyethyleen buizen. Aseptisch plaats een steriele naald van 30 gauge (1 / 2 inch lange naald) in een steriele 3 cc spuit. Pick-up een eind van de snede polyethyleen buis met de geautoclaveerde tang en schuif de slang op de naald totdat het voldoet aan de hub. Snijd de slang, zodat ongeveer 2 cm langer is dan de punt van de naald. Verwijder de katheter uit de spuit en plaats in een steriele petrischaal. </li><li> Ter vermindering van de kans op kruisbesmetting, maken we een katheter voor elke muis. Nadat alle katheters zijn gemaakt, steriliseren ze door blootstelling in een onbedekt petrischaaltje UV-bestraling voor ten minste 30 minuten. Niet rechtstreeks naar UV-lampen of bloot enig deel van het lichaam in de kap, terwijl lampen zijn geactiveerd. Na blootstelling aan UV, kunnen katheters worden opgeslagen op lange termijn in de petrischaal. Wij raden het afdichten van de schotel met Parafilm om te helpen steriliteit te behouden. </li></ol> II. Dier inenting <ol><li> Muizen moeten komen op ten minste een week voor de experimentele manipulatie om stress geïnduceerde verstorende factoren te vermijden. Vrouwelijke muizen zijn gebruikt omdat de mannelijke muizen plasbuis is zeer moeilijk te kateterizeren. CBA / J is een algemeen gebruikt, UTI-gevoelige inteelt muizenstam. Muizen moeten worden gebruikt tussen de 8 en 12 weken oud zijn, want dit is de etalage van immunologische volwassenheid voorafgaand aan de veroudering. Op de eerste dag van het experiment, dip aan het einde van een steriele entnaald in een flacon van bevroren bacteriële voorraad. Schraap een klein inoculum en de streep uit op een geschikte agarplaat. In het algemeen, uropathogene E. coli (UPEC) en andere stammen kunnen 's nachts worden geteeld op Luria-Bertani (LB) agar bij 37 ° C in de lucht. UPEC stammen groeien als solide, geelachtig-wit doorschijnende kolonies op LB agar. Onmiddellijk de bacteriële voorraad terug te keren naar de vriezer. Uropathogene bacteriestammen kunnen minder virulent na verloop van tijd met herhaalde, seriële culturen. Daarom adviseren wij strepen uit een nieuwe agar plaat voor elk experiment. </li><li> Op dag 2 van het experiment, na het bevestigen van een goede morfologie kolonie, enkele kolonies van agar platen en 's nachts plaats halen in ten minste 5 cc bouillon cultuur. LB bouillon kan gebruikt worden voor de meeste uropathogene bacteriestammen (37 ° C, 200 rpm in de lucht). Houd de doppen los op de bouillon cultuur buizen beluchting mogelijk te maken. </li><li> Op dag 3 van het experiment nemen 10% van de eerste bouillon cultuur en de cultuur in bouillon weer 's nachts (meestal 37 ° C en 200 tpm), tot type I pili expressie te verbeteren. Serial bouillon culturen helpen om bacteriële uropathogenicity te optimaliseren, want type I pili is aangetoond dat een kritische virulentie factor voor uropathogens in vivo 1. Houd de doppen los op de bouillon cultuur buizen beluchting mogelijk te maken. </li><li> Op dag 4 van het experiment, het meten van de OD 600 van de bouillon cultuur van dag 3. Als dit niet al bekend voor de bacteriestam wordt getest, moet u tien-voudige seriële verdunning plating over ten minste 7 logs (verdunningen uitgevoerd met PBS, culturen uitgevoerd op LB-agar, 37 ° C incubatie 's nachts) om de relatie tussen OD 600 en cfu te bepalen / ml. Als een vuistregel, een OD 600 van 0,4-0,5 komt overeen met het algemeen tot een 2x10-7 kve per 50 microliter. Zodra de relatie tussen de OD 600 en cfu / ml is vastgesteld, kan men de bouillon cultuur aan te passen aan de OD 600 overeenkomt met de gewenste kve per muis in 50 microliter van PBS. Wat werk heeft gesuggereerd dat inoculatie van 10 microliter, in plaats van 50, leidt tot minder reflux in de kidneys6. Toch hebben de meeste publicaties gemeld gebruik van 50 microliter per muis. Het algemeen, de gewenste cfu varieert tussen 10 6 en 108 cfu / muis, maar elke bacteriële / muis combinatie van stam moet empirisch worden getest in vivo. </li><li> Om ervoor te zorgen dat de inocula worden niet ongeldig verklaard onmiddellijk na instillatie, moet muizen worden beroofd van water gedurende tenminste 30 minuten voor de inductie van algemene anesthesie. Een ander belangrijk manoeuvre is om te bewegen plassen voorafgaand aan de anesthesie-inductie door scruffing muizen en zachtjes op de onderste abdomen. Twee tot 2,5% isofluraan is een veilige inductie dosis voor 8-12 weken oude vrouwelijke CBA muizen, gevolgd door onderhoud van anesthesie met 1,8-2% isofluraan. </li><li> Als de verdoving eenmaal is bereikt, worden muizen geplaatst in de rugligging met hun hoofd ingevoegd in een neuskegel verbonden met isofluraan-met zuurstof. De onderbuik wordt gemasseerd om de urine te evacueren uit de blaas. Als de blaas is relatief leeg is, kan deze manoeuvre niet toegeven urine. De onderbuik en het perineum is doordrenkt met 70% ethanol. </li><li> Een steriele 1 cc spuit zonder naald wordt gebruikt voor het opstellen van de gewenste bacterieel inoculum. Vervolgens wordt een steriel urethrale catheter aseptisch op de spuit. Het teveel aan slangen is afgesneden van de katheter met een schaar, zodat slechts 1-2 millimeter van de slang blijven distaal van de punt van de naald. Vervolgens wordt de spuit getikt en de zuiger ingedrukt met de spuit rechtop om alle luchtbellen te verwijderen. Een klodder bacteriostatisch smerende is gelei gespoten op een steriele petrischaal of de binnenkant van steriele spuit wrapper. De tip van de katheter (met aangesloten spuit) is ondergedompeld in de gelei. Als er meerdere bacteriestammen worden getest in hetzelfde experiment, wees voorzichtig niet dezelfde daling van gelei te gebruiken om katheters met verschillende stammen te smeren. </li><li> Met behulp van een stereo-microscoop (0,8 x tot 5x zoombereik) voor een vergroting, is de clitoris motorkap van de verdoofde muis zachtjes gevat in de niet-dominante hand met een paar fijn getande pincet en getogen craniale naar de diepe roze urethrale meatus bloot ( figuur 1). De spuit (met aangehechte katheter) is begrepen in de dominante hand met een potlood grip en de tip van de katheter is betrokken bij de urethra gehoorgang op een hoek van 45 graden. De clitoris kap is uitgerekt langs de lange as van de spuit, effectief "loading" de urinebuis op de katheter. Deze manoeuvre is van essentieel belang, omdat de muis plasbuis is overbodig. De katheter moet gemakkelijk in de blaas (tot de hub, figuur 2), en kan voorzichtig worden draaide om de overbodige plooien van de plasbuis te navigeren. Nadat de katheter is hubbed, kan de injectiespuit worden verlaagd totdat deze parallel met de lange as van de muis. De niet-dominante hand kan dalen de tang om de positie van de katheter en spuit de dominante hand wordt gebruikt om langzaam te injecteren de inoculum (minstens 5 seconden) te stabiliseren. Als vloeistof wordt gezien stroomt rond de katheter tijdens de injectie, ofwel de blaas vol is of de katheter wordt in de vagina (net caudaal van de plasbuis). Injectie moet onmiddellijk gestopt worden en de positie van de katheter zorgvuldig onderzocht. Als de katheter in de plasbuis was, moet de gegeven muis niet worden opgenomen in het experiment. Aan de andere kant kan een catheter misplaatst in de vagina worden verplaatst en de injectie opnieuw geprobeerd. Na injectie wordt de katheter en de injectiespuit langzaam uit de muis. </li><li> Ter vermindering van de kans op vroege post-inoculatie plassen, wat kan evacueren toegediend bacteriën en daardoor leiden tot een variabele infectie niveaus, sommige onderzoekers te onderhouden muizen onder narcose gedurende 30 minuten na transurethrale inoculation10. Na de operatie moet muizen terug op een schone aarde deken met continue observatie om terug te keren van normale ademhaling en activiteit te bevestigen. Zodra dieren volledig hebben de mogelijkheid om kruipen hersteld, kunnen ze worden teruggestuurd naar beddengoed-bevattende kooien. </li></ol> III. Het meten van CFU in geïnfecteerd weefsel <ol><li> Verschillende muis UTI publicaties gerapporteerd over de cultuur resultaten van 6 uur tot een week of langer na de inenting. De optimale tijd punten moeten empirisch worden bepaald voor elke bacteriële / muizenstam combinatie. Vervalt urine wordt verkregen voor cultuur door scruffing muis over een steriele petrischaal. Verzamelde urine dient te worden gehouden op ijs te allen tijde. Meerdere pogingen om vervallen urine te krijgen gedurende vele uren kan het nodig zijn, omdat de muis lediging is frequent, een laag volume (30-100 microliter per leegte), en stress-afhankelijk. </li><li> Na het behalen van vernietigde urinemonsters, we offeren muizen met behulp van isofluraan en cervicale dislocatie. De buik is aseptisch geopend. Als een nietige urinemonster werd niet met succes eerder verkregen, kan een kleine hoeveelheid urine vaak worden opgezogen door de blaaswand met behulp van een 30 gauge naald en spuit. </li><li> Een of beide nieren zijn verwijderd, gehakt in ten minste 4 stukken (elk stuk moet lager zijn dan 50 microgram) op een steriele petrischaaltje en geplaatst in zirkoon kraal / PBS-bevattende cryovials op het ijs. De blaas is verwijderd, gehakt in ten minste vier stukken, en geplaatst in roestvrij staal kraal / PBS-bevattende cryovials op het ijs. Het weefsel / kraal / PBS-bevattende cryovials worden geplaatst in een Bullet Blender homogenisator en de weefsels worden gehomogeniseerd met behulp van de "8" speed setting voor een minuut. Het is gebruikelijk dat voor sommige weefselfragmenten te blijven na homogenisering. Zolang 50-100 microliter vloeistof homogenaat kan worden gepipetteerd, solide fragmentenzijn niet noodzakelijk een probleem. Als homogenisering tijd wordt verhoogd voor een aantal monsters, is het essentieel om dit te doen voor alle weefsels in om de consistentie van homogenisering te behouden. We maken gebruik van een Bullet Blender homogenisator, omdat het voorkomt de mogelijkheid van cross-contaminatie, is sneller dan de verwerking van individuele monsters een voor een met een standaard homogenisator, en niet significant warmte de monsters gehomogeniseerd. </li><li> Ten minste twee of drie tien-voudige verdunningen van de verzamelde urine en weefsel homogenaten moeten worden gemaakt in een microtiterplaat. Voor de inleidende experimenten kan het verstandig om ten minste zeven tien-voudige verdunningen te maken. Cultuur tot 100 microliter urine, blaas en / of nieren homogenaten over geschikte agar. Omdat de urine monsters kunnen worden volume-beperkt is, kan het nodig zijn om hun volumes voor te brengen tot 100 microliter tot het uitvoeren van tien-voudige verdunningen. Indien dit nodig is, zal de eerste verdunning (voor tien-voudige verdunning) moeten worden verwerkt in de definitieve berekeningen van de bacteriële oplevert. Wij geven de voorkeur kweken UPEC op eosine-methyleenblauw of MacConkey agar (overnacht incubatie bij 37 ° C), omdat deze media zijn selectief voor gramnegatieve organismen. UPEC stammen groeien op MacConkey agar zo centraal umbilicated, rood-roze kolonies vanwege hun vermogen om lactose te fermenteren. </li><li> Na een nacht cultuur, tellen de CFU voor elke plaat. Voor serieel verdunde monsters, is de plaat verdunnen met 50 tot 100 kolonies beschouwd als de meest nauwkeurige telling. "Back" berekenen cfu per weefsel, per milligram weefsel, of per ml. </li></ol> IV. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Urethrale meatus (donker roze weefsel) worden blootgesteld door het optillen van de clitoris kap craniale met een pincet (buiten top van de foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gecatheteriseerd urethra. De gespleten clitoris kan worden gezien net boven de katheter. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Blaas cfu telt 2 dagen na transurethrale infectie van 8 weken oude vrouwelijke CBA / J muizen met uropathogene E. coli. Blazen werden gehomogeniseerd en cfu / ml bepaald door seriële verdunning uitplaten op MacConkey agar. Diamonds geven kve / ml voor individuele muizen, horizontale balk geeft mediaan kve / ml.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

Inductie van de muis urineweginfectie door transurethrale inoculatie van bacteriën is een reeds lang bestaande, maar technisch veeleisende procedure 11. Hung en Hultgren publiceerde onlangs een uitstekend overzicht van transurethrale technieken van de muis urineweginfectie 13. In dit artikel proberen we verder te illustreren de finesses van deze experimentele aanpak. Beginners kunnen oefenen hun techniek door het uitvoeren van een midline laparotomie om de blaas bloot t...

<table><tbody><tr><td>Cryovials, 2.0 ml polypropyleen (zonder doppen)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Doppen voor cryovials, met &amp;rsquo;O&amp;rsquo; ring</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Zirconiumoxide kralen (0.5mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kralen (1.6mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kralenmengsel (0.9-2.0mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>CBA/J muizen, 8-12 weken oud, vrouwtjes</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4.3mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.4mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>LB-agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-bouillon</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Inoculatie-lusjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Eosine-methyleenblauw (EMB) agarpoeder</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey agarpoeder</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>LB agarpoeder</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic niet-radiopake polyethyleen buisjes, PE10 [binnendiameter 0.28 mm (0.011 inch); buitendiameter 0.61 mm (0.024 inch)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge naalden, 1/2 inch</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tuberculinespuit met slip-tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Luer-Lock spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

transurethrale inductie van mouse urineweginfectie

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogene bacteriestammen die van belang zijn gekweekt op agar. In het algemeen, uropathogene<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) en andere stammen kunnen &#39;s nachts worden geteeld op Luria-Bertani (LB) agar bij 37 ° C in de lucht. UPEC stammen groeien als geel-wit doorschijnende kolonies op LB agar. Na de bevestiging van de juiste kolonie morfologie, zijn enkele kolonies vervolgens opgepikt te worden gekweekt in bouillon. LB bouillon kan gebruikt worden voor de meeste uropathogene bacteriestammen. Twee seriële, &#39;s nachts LB bouillon culturen kan worden gebruikt om de expressie van type I pili, een goed gedefinieerde virulentie factor voor uropathogene bacteriën te verbeteren. Bouillon culturen zijn verdund tot de gewenste concentratie in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Acht tot 12 weken oude vrouwelijke muizen zijn geplaatst onder isofluraan anesthesie en transurethrally geënt met bacteriën met behulp van polyethyleen buizen bedekt met 30 gauge spuiten. Typische inocula, die empirisch moeten worden bepaald voor elke bacteriële / muizenstam combinatie, zijn 10<sup&gt; 6</sup&gt; Tot 10<sup&gt; 8</sup&gt; Kve per muis in 10 tot 50 microliter van PBS. Na de gewenste infectie periode (een dag tot enkele weken), urine monsters en de blaas en de beide nieren worden geoogst. Elk orgaan is gehakt, geplaatst in PBS, en gehomogeniseerd in een Blue Bullet homogenisator. Urine en weefsel homogenaten zijn serieel verdund in PBS en gekweekt op juiste agar. De volgende dag, zijn kolonievormende eenheden geteld.

Deze video zal aantonen methoden om transurethrally veroorzaken muis infecties van de urinewegen en kwantificeren van de omvang van de resulterende infecties.

Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie

De relevante urinogene bacteriële stammen worden gekweekt op agar. Over het algemeen kunnen urinogene E. coli (UPEC) en andere stammen gedurende de nacht worden gekweekt op ...

Het algemene doel van deze procedure is om een urineweginfectie bij muizen transurethraal op te wekken. Dit wordt bereikt door eerst de gewenste bacteriële stammen te kweken en de culturen te verdunnen tot de gewenste concentratie. De tweede stap van de procedure is het transurethraal inoculeren van de blaas van de muis met de betreffende bacteriële stammen.De derde stap van de procedure is het verzamelen van urine monsters en het oogsten van de nieren en blazen. De laatste stap van de procedure is de inoculatie van agarplaten met urine en homogenaten van nier- en blaasmonsters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een succesvolle infectie van het urinestelsel aantonen op basis van de aanwezigheid van bacteriële kolonies in de geplaatste monsters.Hallo, ik ben Michael Shea en welkom in mijn laboratorium bij de afdeling Urologie van de Stanford University School of Medicine. Ik ben Annu, ebenfalls van het Shea-lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor transurethrale katheterisatie bij muizen.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de inductie van urineweginfecties bij muizen te bestuderen. Laten we beginnen. Snijd in een laminaire flowkast een stuk polyethyleenslang van 30 centimeter af en bevestig een naald van 30 gauge op een steriele spuit van 3 kubieke centimeter.Gebruik steriele pincetten om één uiteinde van de afgeknipte slang op te pakken en schuif deze over de naald totdat deze de naaldhouder bereikt. Knip de slang zodanig af dat er ongeveer twee centimeter voorbij de punt van de naald uitsteekt. Dit helpt om letsel bij de muizen tijdens de catheterisatie te voorkomen.Verwijder de katheter uit de spuit en plaats deze in een steriele petrischaal. Maak één katheter voor elke muis die geïnfecteerd moet worden. Steriliseer de katheters met ultraviolette bestraling gedurende ten minste 30 minuten.Verzegel een schaal met Parafilm om de katheter steriel te houden voor langdurige bewaring. Uitplaten van een geschikte agarplaat met een inoculum van een bevroren stock van de bacteriële stam van belang. Hier wordt een inoculum van urinaire pathogene E coli of UPEC uitgeplaat voor incubatie gedurende één nacht bij 37 °C.Select enkelvoudige kolonies met de juiste morfologie, wat in het geval van UPEC vaste geelachtige, translucente kolonies op LB-agar zijn, en plaats deze in ten minste vijf milliliters vloeibaar bouillon voor een overnachtcultuur bij 37 °C met agitatie bij 200 revolutions per minute. Voeg 10% van de eerste bouilloncultuur toe aan vers medium en laat dit overnacht groeien. Om de expressie van type 1 pili te verhogen, wat geassocieerd is met uro-pathogenese in vivo, wordt vervolgens de OD 600 van de cultuur gemeten om het aantal colony forming units te bepalen.Afgekort CFU per milliliter cultuur. Verdun de cultuur met steriele 1 XPBS zodat de uiteindelijke concentratie tussen 10⁶ en 10⁸ CFU in 10 tot 50 µL ligt om te voorkomen dat het inoculum onmiddellijk wordt uitgescheiden. Ontzeg de muizen na installatie gedurende 30 minuten water vóór de anesthesie, pak de muis in de nek en druk voorzichtig op de onderbuik om plassen te stimuleren.Plaats de geanestheseerde muis op de rug met de kop in een neusconus die is aangesloten op zuurstof houdend isofluoraan. Masseer de buik om eventueel resterende urine uit de blaas te verwijderen. Gebruik een spuitfles om de onderbuik en het perineum te bevochtigen met 70% ethanol.Gebruik vervolgens een steriele spuit van één milliliter om het bacteriële inoculum op te zuigen. Bevestig een voorbereide steriele katheter aan de spuit. Gebruik een schaar om de slang zo door te knippen dat deze slechts één tot twee millimeter voorbij de punt van de naald uitsteekt.Dit helpt om letsel bij muizen tijdens de catheterisatie te voorkomen; tik tegen de spuit en druk de zuiger in. Om luchtbellen te verwijderen, smeert u de katheter door deze in een klodder bacteriostatische glijmiddelgelei te dopen. Zorg ervoor dat u voor elke bacteriële stam die onder een dissectiestreoscoop wordt getest een andere klodder gelei gebruikt.Gebruik een pincet met fijne tanden in de niet-dominante hand om de clitorisvoorhuid voorzichtig vast te pakken en op te tillen, zodat de dieproze urethrale ATU in de dominante hand zichtbaar wordt. Pak de spuit met de bevestigde katheter vast. Houd de spuit vast als een potlood en voer de tip van de katheter onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de buik van de muis in de urethrale ATU.In het sagittale middenvlak. Rek de clitorisvoorhuid uit langs de lange as van de spuit. Hierdoor wordt de urethra effectief op de katheter geladen.De katheter moet, indien nodig, gemakkelijk in de blaas glijden. Draai de katheter voorzichtig rond om gemakkelijker door de overtollige plooien van de urethra te navigeren. Wanneer de katheter tot aan de hub is geplaatst, brengt u de spuit parallel aan de buik van de muis naar beneden.Leg de pincet neer en gebruik de niet-dominante hand om de katheter en de spuit te stabiliseren. Injecteer het inoculum langzaam gedurende ten minste vijf seconden. Als er tijdens de injectie vloeistof rond de katheter wordt waargenomen, is de blaas vol of bevindt de katheter zich in de vagina.Stop de injectie en controleer de positie van de katheter. Positioneer de katheter indien nodig opnieuw in de urethra. Trek de katheter na de injectie langzaam terug.Houd de muis gedurende een half uur na inoculatie onder anesthesie. Om het risico op lekkage na de operatie te verkleinen, laat u de muis herstellen op een schone warmtedeken onder continue observatie om het herstel van normale ademhalingspatronen en activiteit te bevestigen. Zodra de muis volledig is hersteld en in staat is om te kruipen, plaatst u de muis terug in een kooi met nestmateriaal.Afhankelijk van de combinatie van bacteriële stammen en muizenstammen kan het tussen zes uur en een week duren voordat een volledige infectie is bereikt. Om deze te ontwikkelen, plaatst u gedurende enkele uren voor elke geïnfecteerde muis een steriele Petrischaal op ijs. Houd de muis in de nek boven de schaal om urine te verzamelen voor kweek.50 µL urine zou voldoende moeten zijn. Pipetteer de urine in een microcentrifugebuis, sluit deze af en bewaar de urine op ijs. Plaats onder de dissectiescoop een geëuthanaseerde muis op de rug op een dissectieschaal.Sproei de buikholte in met 70% ethanol. Gebruik een schaar om een incisie van drie tot vier centimeter te maken in de huid en de onderliggende buikwand. Gebruik indien nodig spelden om de buikwand terug te trekken van de inhoud van de buikholte.Als eerdere pogingen tot urinecollectie mislukt zijn, gebruik dan een naald van 30 gauge en een spuit om urine direct door de blaaswand te aspireren. Gebruik een pincet en een schaar om de nieren te verwijderen. Breng deze over naar een steriele Petrischaal en snijd elke nier in ten minste vier stukjes van ongeveer twee tot drie millimeter groot.Overbreng elk nierfragment naar een cryovial met vijf tot zes steriele zirkoniumoxide-kraaltjes van 0,5 mm en 400 µL steriele PBS. Bewaar de niermonsters op ijs. Gebruik een pincet en een schaar om de blaas te verwijderen.Maal de blaas fijn met dezelfde methode als voor de nieren. Breng elk blaasfragment over naar een cryovial bevattend roestvrijstalen kogels van 1,6 millimeter en 200 µL steriele PBS en bewaar de buisjes op ijs. Plaats de vials in een bullet blender homogenisator en homogeniseer het weefsel op snelheidsinstelling acht gedurende ten minste één minuut.Het komt vaak voor dat er na homogenisatie nog enkele weefselfragmenten achterblijven. Alle monsters moeten gedurende dezelfde tijd in een microtiterplaat worden gehomogeniseerd. Maak seriële tienvoudige verdunningen van de verzamelde urine en het weefselhomogenaat met ijs.Koude PBS verspreiden. De verdunning is voltooid. Passende agarplaten laten overnacht groeien bij 37 °C.Het aantal CFU per orgaan of milligram weefsel of milliliter urine kan worden terugberekend op basis van het aantal kolonies op elke plaat. We hebben deze technieken gebruikt om te bestuderen hoe mutaties in bacteriële stressresponsen de eigenschap van UPEC beïnvloeden om in vivo UTI te veroorzaken, evenals de resistentie tegen antibiotica die aan geïnfecteerde muizen zijn toegediend. Deze tabel laat het vermogen van wild-type UPEC zien om de blaas van de muis te infecteren na transurethrale inoculatie.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe urineweginfecties transversaal kunnen worden geïnduceerd bij muizen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de muizen voorzichtig te catheteriseren. De juiste techniek zorgt voor een gemakkelijke catheterisatie, maar kan oefening vereisen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Luyts, N., et al. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the induction and tracking of urinary tract infection in a mouse model using bioluminescent E. coli injected into the bladder, where bacterial adhesion, invasion, and intracellular replication occur. The emitted light from the bioluminescent operon serves as a real-time marker of bacterial load during infection...

Visualization of Urinary Tract Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Conover, M. S., et al., J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for assembling and implanting a transurethral catheter in a female mouse, followed by bacterial inoculation to establish catheter-associated urinary tract infection and investigate biofilm-mediated host-pathogen interactions.

Catheter-Associated Urinary Tract Infection in a Mouse Model

Source: Conover, M. S. et. al., Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of intracellular bacterial communities (IBCs) in mouse bladder tissue infected with β-galactosidase-expressing Escherichia coli. Following tissue fixation, permeabilization, and staining with X-gal, IBCs appear as blue puncta under a dissecting microscope, confirming bacterial invasion during urinary tract infection.

Visualizing Intracellular Bacterial Communities in an Infected Mouse Bladder

In this video, we describe the technique for the intravesical administration of uropathogenic bacteria to generate a urinary tract infection model in mice. This model can be used to understand the spread of uropathogenic bacterial infection within the urinary system and the mechanisms that determine UTI susceptibility.

Generating Urinary Tract Infection Model: A Technique to Administer Uropathogenic Bacteria in Mouse to Develop Urinary Tract Infection Model

This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

Transurethral Catheterization and Bacterial Inoculation to Generate a Urinary Tract Infection Model in Male Mice

Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice

De mogelijkheid om urineweginfecties (UTI) te modelleren is cruciaal om bacteriële pathogenese te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische methoden te stimuleren. Het doel van dit werk is om muismodellen van experimentele UTI en katheter-geassocieerde UTI te demonstreren die bevindingen naspelen en voorspellen die bij mensen worden gezien.

Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Transuretrale instillatietest is een uitdagende procedure en is niet goed beschreven in de literatuur. Het doel van dit manuscript is om een techniek voor transuretrale inbrengen van een katheter voor intravesicale levering van vloeistoffen met werkzame stoffen in de urineblaas en/of de prostaat bij volwassen mannelijke muizen te beschrijven.

Transuretrale Instillation Procedure in volwassen mannelijke muis

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Leer een transurethrale methode om urineweginfecties bij muizen te induceren en te kwantificeren. Dit protocol omvat bacteriële inoculatie, katheterisatie en weefselanalyse voor infectieonderzoek.

Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie

Meer video's verkennen