Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

De studie naar de real-time celrespons op mechanische stimulatie wordt uitgevoerd door eerst cellen die GFP-fusie-eiwitten tot expressie brengen gedurende 24 uur op glazen bodemschaaltjes te kweken. De tweede stap is het coaten van de AFM-tip met gebiotineerd fibronectine. Vervolgens wordt de gefunctionaliseerde AFM-tip in contact gebracht met het celoppervlak om de vorming van een sterke focale adhesie rond de AFM-tip mogelijk te maken, waardoor directe manipulatie van het actine-cytoskelet mogelijk is via een matrix-integrine-actine-koppeling tussen de met fibronectine gecoate tip en de cel.

De laatste stap is om de levende cel mechanisch te stimuleren door een gecontroleerde opwaartse beweging van de AFM-tip, zodat de verticale kracht wordt uitgeoefend op het punt van celcontact zonder de sterke focale adhesie te verbreken. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat cellen op de mechanische stimulatie reageren door hun aanhechting aan het substraat te versterken en door reorganisatie van het actine-cytoskelet te induceren, zoals vastgelegd met real-time fluorescentie-optische beeldvorming. Hallo, ik ben Andrea Trake, universitair docent bij de afdeling Systems Biology and Translational Medicine aan het Texas A&M Health Science Center.

Hoi, ik ben Sum Lim. Ik ben postdoctoral fellow bij de afdeling Systems Biology and Translational Medicine aan het Texas A&M Health Science Center. Vandaag laten we u een procedure zien voor het bestuderen van adaptieve cellulaire remodeling na mechanische stimulatie.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om real-time remodellering van het cytoskelet in levende vasculaire gladde spiercellen te onderzoeken. Laten we beginnen. Voor deze studies wordt een omgekeerde Olympus IX 81-microscoop met een total internal reflection fluorescence (TIRF)-opstelling, gecombineerd met een CSU 22 Yokogawa scanning head, gebruikt.

Een bio scope SZ atoomkrachtmicroscoop is bovenop de omgekeerde optische microscoop gemonteerd. Het gehele systeem is geplaatst op een optische tafel van onderzoeks kwaliteit en is eerder in detail beschreven. Deze geïntegreerde microscoop maakt gebruik van twee quant EM electron multiplying charge coupled device of E-M-C-C-D camera's.

De ene is voor turf-imaging en de andere voor confocale imaging. De confocale opstelling, bestaande uit de spinning disc scanner, het externe filterwiel en een E-M-C-C-D-camera, is gemonteerd op een aluminium basisplaat die op een siliconen mat is geplaatst voor trillingsdemping. De gehele confocale opstelling is via een flens met een schroefkraag verbonden met de microscoop.

Hierdoor kan de opstelling tijdens atoomkrachtmicroscopie of FM-metingen worden ontkoppeld van de microscoop om trillingen van de roterende schijfscanner te voorkomen. Een argon-kryptonlaser wordt gebruikt als excitatiebron voor zowel de turf- als de confocale beeldvormingsmodi. De laser kan worden gekoppeld aan een van de twee optische vezels, die de laser naar de turf-opzetstuk of de confocale scankop geleiden.

Twee computers besturen het systeem. Eén maakt gebruik van slide book-software, waarmee de optische beeldvorming wordt aangestuurd, en de andere van nano scope-software, waarmee de AFM wordt aangestuurd. Plaats 24 uur vóór het experiment met mechanische stimulatie levende cellen die GFP-constructen tot expressie brengen, gericht tegen specifieke eiwitten, in een kweekschaal met glazen bodem. Vervang op de dag van het experiment het celkweekmedium door een medium zonder fenolrood.

Omdat een a FM-experiment zeer ruisgevoelig is, dient men tijdens het experiment praten of het aanraken van de optische tafel of de microscoop te vermijden om ruis te minimaliseren. Ontkoppel bij a FM-metingen de spinning disc confocale microscoop van de microscoop. Het experiment begint met het plaatsen van de kweekschaal op de a FM-tafel met een magnetische kraag om de schaal aan de magnetische microscooptafel te bevestigen.

De V-vormige cantilever op de AFM-probe is aangepast met het gebiotinyleerde glaskraaltje van twee micron. De cantilever is eenvoudig waarneembaar met behulp van de microscoop. Het kraaltje is op het uiterste uiteinde van de cantilever gelijmd; dit is de plek waar de coatingoplossing druppelsgewijs moet worden aangebracht.

Om een FM-probe voor het experiment voor te bereiden, monteert u eerst de tip in de glashouder en plaatst u vervolgens de glashouder op de tafelmontage om de tip te coaten. Was de tip door voorzichtig 10 µL docos phosphate buffered saline of DPBS op het uiterste uiteinde van de tip te druppelen, en droog de tip vervolgens met een kim wipe. Herhaal deze procedure vijf keer na het wassen met DPBS van 1 mg/mL.

Avid in oplossing. Druppelgewijs over de tip. Laat de tip vijf minuten incuberen na de avadon-coating.

Was de tip nog vijf keer met DPBS. Crosslink vervolgens biotinylered fibronectine op de avadon door een oplossing van 1 mg/mL druppelsgewijs op de tip aan te brengen en vijf minuten te incuberen.

Was ten slotte de tip nogmaals vijf keer met DPBS en laat de laatste druppel op de tip achter. Zodra de tip is voorbereid, wordt deze op een AFM-scanner gemonteerd. Plaats na montage van de AFM-tip een beschermende siliconen rok rond de houder.

Stel vervolgens de microscoop in voor videoweergave. Richt daarna de FM-tip in het centrum van het gezichtsveld. Stel de optische hefboom in door de laserstraal aan het uiterste uiteinde van de cantilever te plaatsen.

Vervang vervolgens het objectief door het juiste hoge vergrotingsobjectief voor beeldvorming van enkele cellen. Breng daarna de cel, die mechanisch wordt gestimuleerd, in het gezichtsveld en kies een plek waar de AFM-tip op het celoppervlak moet landen. Laat ten slotte de AFM-tip zakken tot deze contact maakt met die specifieke cel.

Nadat de tip in contact is gebracht met de cel, wordt er ongeveer 20 minuten gewacht. Dit maakt de vorming van een sterke focale adhesie mogelijk op het FM-contactpunt op het celoppervlak. Na deze wachttijd kan de procedure voor mechanische stimulatie worden gestart ter voorbereiding op het experiment met mechanische stimulatie.

Schakel over van de videocamera naar de E-M-C-C-D-camera om de fluorescerende cellen voor beeldvorming te kunnen bekijken. Leg vervolgens een initiële afbeelding van de cel in rust vast. Gebruik spinning disc- en confocale microscopie voor de visualisatie van het actine-cytoskelet in het gehele cellichaam.

Gebruik omgekeerd turf om focale adhesies te visualiseren om de cel te stimuleren. Gebruik de cantilever om in discrete stappen elke drie tot vijf minuten een gecontroleerde opwaartse beweging toe te passen. Tijdens het verkrijgen van de A FM-gegevens is het belangrijk dat de operator constant de spanning van de Z piso-positie bewaakt om de juiste timing voor de verticale pool te bepalen.

Leg gelijktijdig met een FM-data-acquisitie na elke verticale trekking een confocale of turf-afbeelding van de cel vast met behulp van de slide book-software. Trek ten slotte de FM-tip uit de cel na voltooiing van het stimulatie-experiment. Een vasculair glad spiercel getransfecteerd met actin MRFP en vcul.

GFP werd gebeeld met een FM aan het apicale celoppervlak. Dezelfde cel werd gebeeld met turf aan het basale celoppervlak. Hier zijn de twee beelden over elkaar heen gelegd.

Er werd ook een afbeelding van dezelfde cel gemaakt met een spinning disc confocale microscoop over het gehele cellichaam, weergegeven als een maximale projectie van een 3D-stack. Er is een goede overlap te zien tussen de A FM- en de spinning disc confocale afbeeldingen. Een vasculaire gladdecelsel, getransfecteerd met actin MRFP, werd mechanisch gestimuleerd door de A FM en afgebeeld met spinning disc confocale microscopie.

De fouten wijzen op actinevezels die een opmerkelijke herstructurering vertonen na een FM-stimulatie. Sommige actinevezels polymeriseren, terwijl andere depolymeriseren als gevolg van de mechanische stimulatie, en andere actinevezels bundelen. Vanwege de actine-herstructurering hebben we zojuist aangetoond hoe een levende celcultuur mechanisch gestimuleerd kan worden met behulp van EFM, terwijl gelijktijdig de CY-reorganisatie wordt geregistreerd met behulp van optische beeldvormingsmethoden.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een FM-experiment extreem ruisgevoelig is. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw metingen.