Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy
4 oktober 2010
Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.
Het onderzoek naar de celreactie in real time op mechanische stimulatie wordt bereikt door eerst cellen te laten groeien die GFP-fusie-eiwitten tot expressie brengen op glazen schotels gedurende 24 uur. De tweede stap is om de A FM-tip te coaten met biotinyleren fibronectine. Vervolgens wordt de functionele a FM-tip in contact gebracht met het celoppervlak om een sterke focale adhesie rond de A FM-tip te laten vormen, waardoor directe manipulatie van het actine cytoskelet mogelijk is via een matrix-integrine-actine-koppeling tussen de met fibronectine beklede tip en de cel.
De laatste stap is het mechanisch stimuleren van de levende cel door gecontroleerde opwaartse beweging van de A FM-tip, zodat de verticale kracht wordt uitgeoefend op het punt van celcontact zonder de sterke focale adhesie te verbreken. Uiteindelijk blijkt uit de resultaten dat cellen reageren op de mechanische stimulatie door hun hechting aan het substraat te versterken en door actine cytoskelet reorganisatie te induceren, zoals vastgelegd met behulp van real-time fluorescentie optische beeldvorming. Hallo, ik ben Andrea Trake, assistent-professor in het Department of Systems Biology and Translational Medicine aan het Texas a and m Health Science Center.
Hallo, ik ben Sum Lim. Ik ben postdoctoraal onderzoeker in het Department of Systems Biology and Translational Medicine aan het Texas a and m Health Science Center. Vandaag laten we je een procedure zien voor het bestuderen van adaptieve cellulaire remodellering door mechanische stimulatie.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om real-time cytoskeletaal remodellering in levende vasculaire gladde spiercellen te onderzoeken. Dus laten we beginnen. Voor deze studies wordt een omgekeerde Olympus IX 81-microscoop met een totale interne reflectiefluorescentie of turf-aansluiting in combinatie met een CSU 22 Yokogawa-scankop gebruikt.
Een bio scope SZ atomaire krachtmicroscoop is gemonteerd bovenop de omgekeerde optische microscoop. Het hele systeem is gemonteerd op een optisch tafel van onderzoekskwaliteit en is eerder in detail beschreven. Deze geïntegreerde microscoop maakt gebruik van twee quant EM elektronenvermenigvuldigende ladingskoppelingsapparaten of E-M-C-C-D camera's.
Een is voor turf-beeldvorming en de andere voor confocale beeldvorming. De confocale assemblage, die bestaat uit de externe filterwiel van de draaiende schijfscanner en een E-M-C-C-D-camera, is gemonteerd op een aluminium basisplaat geplaatst op een siliciumpad dat nodig is voor trillingsdemping. De hele confocale assemblage verbindt met de microscoop via een flens met een draadkraag.
Zo kan de assemblage tijdens atomaire krachtmicroscopie of a FM-metingen worden losgekoppeld van de microscoop om trillingen van de draaiende schijfscanner te voorkomen. Er wordt een argon-kryptonlaser gebruikt als excitatiebron voor zowel turf- als confocale beeldvormingsmodi. De laser kan worden gekoppeld aan een van de twee optische vezels, die de laser naar de turf-aansluiting of de confocale scankop leveren.
Twee computers besturen het systeem. De ene maakt gebruik van Slide Book-software, die de optische beeldvorming bestuurt, en de andere Nano Scope-software, die de A FM bestuurt. 24 uur voorafgaand aan het mechanische stimulatie-experiment worden levende cellen met GFP-constructies die gericht zijn op specifieke eiwitten in een glazen schotel voor celkweek geplaatst. Op de dag van het experiment wordt het celkweekmedium vervangen door fenolroodvrij medium.
Omdat het a FM-experiment erg ruisgevoelig is, moet men tijdens het experiment niet praten of de optische tafel of microscoop aanraken om ruis te minimaliseren. In de a FM-metingen wordt de draaiende schijfconfocale losgekoppeld van de microscoop. Het experiment begint met het monteren van de celkweekschotel op de a FM-standaard met een magnetische kraag om de schotel aan de magnetische microscoopstandaard te bevestigen.
De V-vormige cantilever op de A FM-sonde is aangepast met de twee micron biotinyleerde glazen kraal. De cantilever is gemakkelijk te zien met behulp van de microscoop. De kraal is gelijmd aan het uiteinde van de cantilever, en dit is waar de coatingoplossing druppelsgewijs moet worden aangebracht.
Om de a FM-sonde voor het experiment voor te bereiden, monteert u eerst de tip in de glazen houder en plaatst u vervolgens de glazen houder op de tafelmontage om de tip te coaten. Was de tip door voorzichtig 10 microliter docosfosfaatbufferoplossing of DPBS aan het uiteinde van de tip te druppelen en gebruik vervolgens een kimdoek om de tip te drogen. Herhaal deze procedure vijf keer na het wassen met DPBS bij een een milligram per milliliter.
Avid in oplossing. Druppelsgewijs over de tip. Laat de tip vijf minuten incuberen na avadon-coating.
Was de tip nog vijf keer met DPBS. Vervolgens cross-linkt u biotinyleerde fibronectine naar de avadon door een oplossing van één milligram per milliliter toe te voegen. Druppelsgewijs op de tip en gedurende vijf minuten incuberen.
Was de tip ten slotte nog eens vijf keer met DPBS en laat de laatste druppel op de tip achter. Zodra de tip is voorbereid, monteert u de tip op de a FM-scanner. Na het monteren van de a FM-tip plaatst u een beschermende siliconenrok rond de houder.
Stel vervolgens de microscoop voor videobeeld in. Richt vervolgens de a FM-tip in het midden van het beeldveld uit. Stel de optische hefboom in door de laserstraal aan het uiteinde van de cantilever te plaatsen.
Vervolgens verandert u het objectief in het juiste hoogvergrotingsobjectief voor beeldvorming van enkele cellen. Breng vervolgens de cel, die mechanisch zal worden gestimuleerd, in het beeldveld en kies een plaats waar de A FM-tip op het celoppervlak moet landen. Ten slotte laat u de a FM-tip zakken tot deze op die specifieke cel aanraakt.
Nadat de tip in contact met de cel is gebracht, wacht u ongeveer 20 minuten. Dit zorgt voor een sterke focale adhesie die zich vormt op het punt van contact van de a FM op het celoppervlak. Na de wachttijd kan de procedure voor mechanische stimulatie beginnen om voor te bereiden op het mechanische stimulatie-experiment.
Schakel van videocamera naar E-M-C-C-D camera om de fluorescerende cellen voor beeldvorming te kunnen bekijken. Verkrijg vervolgens een initieel beeld van de cel in rust. Gebruik draaiende schijf en vocale microscopie voor visualis
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het gebruik van een geïntegreerde atoomkracht-optische beeldvormingsmicroscoop om levende cellen in kweek mechanisch te stimuleren. De methodologie bevat een stapsgewijze handleiding en toont representatieve gegevens van responsen van levende cellen op mechanische stimulatie.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Mechanische stimulatie
- Live cell imaging
Achtergrond
- Het begrijpen van de celrespons op mechanische stimuli is van cruciaal belang in de celbiologie.
- Atomic force microscopie maakt een precieze manipulatie van cellen mogelijk.
- Live cell imaging biedt real-time inzicht in cellulaire processen.
- Focale adhesie speelt een sleutelrol bij celaanhechting en -respons.
Doel van de studie
- Om instructies te geven over het gebruik van een gespecialiseerde microscoop voor levende celstudies.
- Om de effecten van mechanische stimulatie op levende cellen te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden waarmee onderzoekers de studie kunnen repliceren.
Gebruikte methoden
- Cellen die GFP-fusie-eiwitten tot expressie brengen, worden gekweekt op glazen schaaltjes.
- De AFM-tip is gecoat met gebiotineerd fibronectine.
- De gefunctionaliseerde AFM-tip wordt gebruikt om focale adhesies met het celoppervlak te creëren.
- Mechanische stimulatie wordt toegepast door middel van een gecontroleerde opwaartse beweging van de AFM-tip.
Belangrijkste resultaten
- Cellen versterkten hun hechting aan het substraat na stimulatie.
- Reorganisatie van het actine-cytoskelet werd waargenomen als reactie op mechanische krachten.
- Fluorescentie-imaging in real-time legde dynamische cellulaire responsen vast.
- Het protocol demonstreerde met succes de effectiviteit van de techniek.
Conclusies
- De geïntegreerde microscoop is effectief voor het bestuderen van levende celresponsen op mechanische stimuli.
- Deze methode kan het begrip van cellulaire mechanica en adhesie verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van verschillende celtypen en condities omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Inzicht krijgen in hoe levende cellen mechanische krachten waarnemen en zich daaraan aanpassen, is essentieel voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in mechanotransductiepaden. Deze geïntegreerde AFM-optische beeldgevingsbenadering maakt real-time resolutie op subcellulair niveau van cytoskelet- en adhesiedynamiek mogelijk, wat zorgt voor voorspellende zekerheid in vroege discoveryfasen door mechanische stimuli te koppelen aan structurele reorganisatie. De methode ondersteunt mechanisch risicobeheer door kracht-geïnduceerde actine-remodellering en versterking van focale adhesies direct te visualiseren, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij de selectie van targets in de preklinische fase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te onthullen hoe mechanische stimulatie reorganisatie van het actine-cytoskelet en versterking van focale adhesies triggeren.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk via directe observatie van krachtafhankelijke cytoskeletdynamiek in levende adherente cellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door mechanische input te koppelen aan structurele output, waardoor ambiguïteit bij de interactie met mechanosensitieve targets wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door reproduceerbare protocollen vast te stellen voor mechanische stimulatie en real-time imaging.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en kwantitatieve output aan via gecontroleerde AFM-tipbewegingen en gesynchroniseerde fluorescentie-uitlezingen.
- Schaalbaarheid: Benadrukt het hergebruik van het platform voor verschillende adherente celtypen, wat betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt in mechanobiologische screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten door aan te tonen dat er sprake is van apicale-naar-basale structurele koppeling, waarbij apicale stimulatie reorganisatie in het gehele cellichaam induceert.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door dynamische responsen vast te leggen die bijdragen aan de afstemming van biomarkers in mechanotransductiepaden.
- Mechanistische Risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde van risicoreductie door aan te tonen hoe krachtstoepassing leidt tot actin-polymerisatie, depolymerisatie en bundling, waardoor het werkingsmechanisme wordt verduidelijkt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, en biedt mechanistische inzichten voorafgaand aan de compound screening.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetesten ondersteunt door gecontroleerde mechanische stimulatie toe te passen en realtime remodeling van het cytoskelet te observeren.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via reproduceerbare vorming van focale adhesies en kwantitatieve imaging van actinedynamiek met behulp van TIRF- en confocale modaliteiten.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals actinepolymerisatie/-depolymerisatiegebeurtenissen en veranderingen in de intensiteit van focale adhesies, waardoor een vergelijking tussen gestimuleerde en rusttoestanden mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door aan te tonen hoe apicale mechanische stimulatie structurele veranderingen door het cellichaam voortplant, wat relevant is voor krachtoverdracht op weefselniveau.
- Bedrijfsuitbreiding: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor het bestuderen van mechanosensitieve targets in vasculaire, epitheliale en mesenchymale celmodellen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij target-validatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in mechanotransductie-paden.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van mechanische stimulatie en multi-modale beeldvorming.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen mechanobiologie-programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van directe observatie van kracht-geïnduceerde cellulaire adaptatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in AFM-bediening, live cell imaging en cytoskeletdynamiek.
- De instrumentatiebehoeften omvatten een geïntegreerd AFM-TIRF-confocaal systeem met trillingsdemping en dubbele EM-CCD-camera's.
- Standaardisatie tussen teams vereist strikte naleving van protocollen voor tipfunctionalisatie, vorming van focale adhesies en stimulatietiming.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten variërende substraatstijfheid, coatingeiwitten en celtypen, terwijl de specificiteit van de apicale stimulatie behouden moet blijven.
- Praktische beperkingen omvatten ruisgevoeligheid tijdens AFM-metingen en de noodzaak van gecontroleerde omgevingscondities om drift te minimaliseren.
