Name: RhoC GTPase Activering Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer een pull down assay om actieve RhoC GTPase in cellen te kwantificeren. Deze methode biedt betrouwbare data over RhoC-activiteit en inzicht in signaaltransductieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ministerie van Defensie W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 en W81XWH-08-1 tot 0356

1. Bereid GST-fusie-eiwit <ol><li> Glycerol voorraden JM109 bevoegde bacteriën die de eerste N-terminale 90 aminozuren van de rhotekin Rho bindend domein (RBD) gesubkloneerd in de BamH1/EcoR1 pGEX3x vector worden gemaakt. Om ervoor te zorgen hoge efficiëntie van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd voor elk experiment. In onze ervaring, vers bereide GST-RBD is de sleutel tot een robuuste en accurate GTPase activering assay. </li><li> Voeg 50 uL (bij benadering, niet ontdooien) van glycerol voorraad aan 50 ml van LB versterker en groeien 37 ° C gedurende de nacht met schudden. </li><li> Verdunnen 1:10 in 500 ml LB-versterker en groeien gedurende 1 uur </li><li> Veroorzaken GST-eiwit productie met 0,1 mM IPTG gedurende 2 uur. </li><li> Gelijkmatig te verdelen in de centrifuge flessen en centrifuge, Sorval GSA3 rotor bij 5000 tpm 4 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Resuspendeer pellet in centrifuge flessen, 10 ml lysis buffer *. * Bacteriële Lysis Buffer: 20% sucrose, 10% glycerol, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl 2, 2 mM DTT, Add verse PMSF, benzamide, aprotinine en leupeptin. </li><li> Ultrasone trillingen 2-3 min (dit is afhankelijk van het type ultrasoonapparaat. We maken gebruik van een Fischer Sonic Dismembranator Model 500 vastgesteld op mark 6, 50% cyclus). </li><li> Centrifuge, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm bij 4 ° C. Op dit punt een kleine hoeveelheid kan worden genomen en uitgevoerd door SDS-PAGE. De gel kan Coomassie gekleurd zijn en een band moet duidelijk zijn op 46 kDa. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 1 ml van 50% glutatione-Sepharose 4B slurry. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C met rotatie. Was drie keer met lysis buffer. </li><li> Resuspendeer GST-RBD/glutatione-Sepharose kralen om een ​​50% suspensie (ongeveer 1 ml) met GST-vis buffer **. ** GST-Fish Buffer: 10% glycerol, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Voeg verse PMSF, benzamide, aprotinine en leupeptin </li></ol> 2. GST-fusie pull-down-test <ol><li> Gebruik 50-10 x 10 6 cellen / test </li><li> Was cellen eenmaal in ijskoud PBS, blijf platen op ijs (we gebruiken een platte glazen schaal gevuld met ijs) en lyseren met 0,5 ml GST-vis buffer. </li><li> Incubeer 5 min op ijs-, oogst-cellen met behulp van een rubberen politieman of vlak scrapper, transfer naar buis microfuge en 20.000 toeren per minuut 5 min gecentrifugeerd bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant naar een nieuwe microfugebuis. Neem 50 ui van de totale Rho (dat wil zeggen het BBP + GTP gebonden) te bepalen. </li><li> Voeg 0,5 mL GST-RBD/glutatione-Sepharose kralen en incuberen bij 4 ° C, 's nachts met rotatie. </li><li> Was 6x met GST-vis buffer. </li><li> Resuspendeer kralen in 40 ul 2x-Laemelli sample buffer Op dit punt van de concentratie van het totale Rho eiwit genomen fractie in 2.4 dient te worden bepaald en 30 ug bereid te worden uitgevoerd op de gel met de corresponderende activering monster. </li><li> Kook monsters bij 90 ° C gedurende 5 min, kort centrifuge en neem supernatant (dat wil zeggen voorkomen dat de kralen) laden en draaien op een 12-well 4-20% gradiënt SDS-PAGE gel. </li><li> Run gel op niet hoger dan 150 volt, over te dragen aan membraan met behulp van Towbin buffer en de constante stroom van 100 W. </li><li> Block membraan met 5% melk / TBST oplossing en sonde met RhoC-specfic antilichaam. </li></ol> 3. Representatieve resultaten Goede resultaten moet produceren een enkele band op ongeveer 22 kDa. Slechte resultaten produceren meerdere banden of een hoge achtergrond. Dit wijst op afbraak van eiwitten, onvolledige wassen van monsters of het gebruik van oude GST-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Drie aparte cellijnen die verschillende niveaus van RhoC GTPase worden aangetoond dat lage niveaus van actieve en totale RhoC, een hoog niveau van actieve en totale RhoC of geen RhoC te tonen. De blot werd vervolgens gestript en reprobed met een antilichaam om het huis te houden-gen actine om te dienen als een laad-controle voor de totale RhoC eiwit. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Meerdere bands of hoge achtergrond het gevolg is van afbraak van eiwitten, onvolledige wassen van de monsters of het gebruik van oude GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

De meest kritische fase van de procedure is de generatie van verse GST-RBD. Gebrek aan aandacht te besteden aan deze stap is de belangrijkste reden voor de mislukking. Alle stappen, van de generatie van de GST-RBD (1.2) op de overnacht incubatie met de cel lysaat (2.5), moet worden gedaan in een enkele dag. Een andere cruciale stap is om er zeker van dat er genoeg cellen om de cellysaten te produceren. Dit is vooral van belang als we kijken naar RhoC GTPase, die de neiging heeft om aanwezig te zijn in lage niveaus in de...

<table><tbody><tr><td>Glutathion-sepharose 4B beads</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Criterion 4-20% Tris-HCl gels</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpase activering assay

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase heeft 91% homologie met RhoA GTPase. Omwille van de prevalentie in cellen, hebben veel reagentia en technieken voor het RhoA GTPase ontwikkeld. Echter, is RhoC GTPase uitgedrukt in uitgezaaide kankercellen op relatief lage niveaus. Daarom hebben weinig RhoC-specifieke reagentia ontwikkeld. We hebben een aangepast Rho activatie test om RhoC GTPase op te sporen. Deze techniek maakt gebruik van een GST-Rho bindende domein fusie-eiwit te trekken actief RhoC GTPase. Daarnaast kunnen we totaal eiwit oogsten aan het begin van de test tot het niveau van het totaal (GTP en het BBP gebonden) RhoC GTPase te bepalen. Dit maakt voor de bepaling van actief versus het totaal RhoC GTPase in de cel. Een aantal commerciële versies van deze procedure zijn echter ontwikkeld, zijn de commerciële kits geoptimaliseerd voor RhoA GTPase en meestal niet goed werken voor RhoC GTPase. Delen van de test zijn eveneens gewijzigd als de ontwikkeling van een RhoC-specifiek antilichaam.

Dit protocol maakt gebruik van een pull-down test om het niveau van de actieve RhoC GTPase vast te stellen in de cellen.

RhoC GTPase Activering Assay

RhoC GTPase vertoont 91% homologie met RhoA GTPase. Vanwege de prevalentie ervan in cellen zijn er veel reagentia en technieken voor RhoA GTPase ontwikkeld. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De hier gepresenteerde methode beschrijft een assay voor activering van RhoA specifieke GDP / GTP uitruilfactoren (GEFs) in gekweekte cellen volgen door gebruik te maken van een gemuteerde RhoA GST fusieproteïne dat een hoge affiniteit voor geactiveerd GEFs heeft. GEFs worden neergeslagen uit cellysaten, gedetecteerd door Western blotting en gekwantificeerd door densitometrie.

Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten

This video demonstrates a competition assay to study GTPase-binding protein partners. Utilizing nucleotide-bound GTPase protein immobilized on magnetic beads, the competitive binding between two interacting protein partners for the same binding site on the GTPase can be studied to assess the binding affinities of the protein partners.

Competition Binding Assay to Study Competing GTPase-Binding Protein Partners

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, inclusief Rac1. In vivo, concurreren Rac1-bindende eiwitten voor een enkele bindingsinterface, waarvan de conformatie wordt bepaald door een gebonden nucleotide. Het nucleotide is zowel belangrijk als moeilijk experimenteel te beheersen, vanwege de hoge hydrolysesnelheid.

Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

De adsorptie van peptiden op plastic tijdens traditionele seriële verdunningen met pipetpunten kan de bepaling van de potentie aanzienlijk beïnvloeden en het begrip van structuur-activiteitsrelaties verwarren die worden gebruikt voor fasen van loodidentificatie en loodoptimalisatie in de ontdekking van geneesmiddelen. Hier worden methoden beschreven voor geautomatiseerde akoestische non-contact seriële verdunning van peptidemonsters.

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoek naar de prenylation en 5'-Guanosinetrifosfaat (GTP)-laden van Rho GTPase. Dit protocol bestaat uit twee gedetailleerde methoden, namelijk membraan fractionering en een GTPase-linked immunosorbent assay. Het protocol kan worden gebruikt voor het meten van de prenylation en de GTP laden van verschillende andere kleine GTPases.

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-Go. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

We hebben een split-luciferase reassemblagetest opgezet om de contacten tussen endoplasmatisch reticulum en mitochondriën in levende cellen te monitoren. Aan de hand van deze test beschrijven we een protocol om het niveau van deze inter-organelkoppelingen in HEK293T cellen kwantitatief te meten, onder de voorwaarde van chemische behandeling.

Split-luciferase herassemblagetest om endoplasmatisch reticulum-mitochondriëncontacten in levende cellen te meten

Leer een pull down assay om actieve RhoC GTPase in cellen te kwantificeren. Deze methode biedt betrouwbare data over RhoC-activiteit en inzicht in signaaltransductieprocessen.

RhoC GTPase Activering Assay

Meer video's verkennen