Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen
10 augustus 2010
Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden gemodelleerd In vitro Gebruik van polyacrylamide hydrogelen van verschillende naleving.
Om in vivo weefselcompliance te modelleren met behulp van acrylamidehydrogels. Dit wordt bereikt door eerst reactieve bodemdeksels en gesiliconiseerde bovendeksels te genereren. De tweede stap van de procedure is het gieten en creëren van de acrylamidehydrogels.
De derde stap van de procedure is het kruislinken van het extracellulaire matrix-eiwit naar keuze aan het hydrogel. De laatste stap van de procedure is het incuberen en analyseren van cellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die laten zien hoe variërende extracellulaire matrix-compliantie in vitro celgedrag reguleert door middel van analyse met behulp van immunofluorescentiemicroscopie, real-time kwantitatieve PCR en western blotting.
Vandaag laten we u de procedure zien voor het genereren en gebruiken van acrylamidehydrogels. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om onze extracellulaire matrixstijfheid te bestuderen die celmorfologie, celsignalering en proliferatie reguleert. Dus laten we beginnen.
Begin deze procedure door reactieve deksels te genereren. Plaats eerst een laag paraform op de onderste helft van een 150 millimeter Petri-schaal. Breng vervolgens maximaal negen autoclaaf 25 millimeter deksels over op de parafilm en bedek ze met één milliliter 0,1 molair natriumhydroxide.
Incubeer de deksels gedurende drie minuten. Na incubatie aspireert u het natriumhydroxide met een vacuümlijn die werkt in een chemische kap. Pipet 0,5 milliliter van drie aminoprofielen trimethyl of drie A-P-T-M-S op elke deksel. Incubeer de deksels gedurende drie minuten en aspireer vervolgens de drie A-P-T-M-S. Wees voorzichtig om niet te lang te incuberen om de vorming van schuim op het deksel te voorkomen.
Behandelde schuiven. Spoel de deksels eenmaal af met 20 milliliter gedeïoniseerd water in dezelfde schaal. Verwijder de deksels uit de schaal met behulp van gebogen pincetten en breng ze met de behandelde kant omhoog over naar een nieuwe 150 millimeter schaal.
Was vervolgens de deksels opnieuw met gedeïoniseerd water en plaats ze 10 minuten op de rocker. Na incubatie verwijdert u het water en was nogmaals twee keer. Het is erg belangrijk om alle drie A-P-T-M-S te verwijderen, zodat het niet zal reageren met het glutaaraldehyde en een troebel wit precipitaat zal achterlaten 10 minuten voor gebruik voor het glutaaraldehyde.
Gebruik gebogen pincetten om de deksels over te brengen naar een schone schaal met param en aspireer eventueel overgebleven vloeistof. Gebruik een vacuümlijn en bedek vervolgens elke deksel volledig met 0,5 milliliter 0,5% glutaaraldehyde in steriel gedeïoniseerd water om de drie A-P-T-M-S en het polyacrylamidegel te kruislinken. Incubeer de deksels gedurende 30 minuten in een chemische kap. Aspireer vervolgens het glutaaraldehyde, spoel en was de deksels opnieuw met gedeïoniseerd water.
Droog de deksels vervolgens volledig. Voeg nieuwe deksels toe aan een 50 milliliter Falcon-buis die een 10% oppervlakte-afdichtingsoplossing bevat in chloroform en schudden gedurende minimaal 10 minuten. Decanteer de oppervlakte-afdichtingsoplossing en laat drogen.
De deksels op Kim-doekjes in de biologische veiligheidskast waar de hydrogels worden voorbereid om met de bereiding van hydrogels te beginnen. Gebruik gebogen pincetten om de deksels reactieve zijde omhoog over te brengen naar een vel paraform dat op het oppervlak van de biologische veiligheidskast is vastgemaakt. Zorg ervoor dat de deksels vlak op het paraformoppervlak liggen.
Bereid vervolgens een verzadigde en hydroxy CIN aide of NHS-oplossing in tolueen voor door een kleine hoeveelheid NHS op te lossen in voldoende tolueen. Voor de specifieke experimenten, voeg kleine hoeveelheden NHS toe totdat de NHS niet langer oplost. De verzadigde oplossing is meestal troebel en roze.
Bereid vervolgens de acrylamide BIS acrylamide water en een PS voor om het gewenste acrylamidepercentage te bereiken. Voeg de reagentia toe aan de microgebruikbuizen zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Voeg vervolgens een enkele portie tegelijk toe.
Voeg de NHS en TM me toe. Vortex de buis kort en giet onmiddellijk tussen drie en vijf gels met 140 microliters per deksel in de biologische veiligheidskast. Plaats snel de SILICONISEERDE 25 millimeter deksel bovenop elk gel voordat het begint te polymeriseren.
Het toevoegen van het bovendeksel zal het acrylamide toestaan om het bodemdeksel volledig te bedekken. Incubeer deze sandwich op kamertemperatuur totdat het acrylamide is gepolymeriseerd om te bepalen wanneer polymerisatie heeft plaatsgevonden. Controleer de resterende acrylamideoplossing in de microcentrifugebuis.
De polymerisatie duurt een paar minuten voor stijve gels en iets langer voor zachte gels. Zodra polymerisatie is opgetreden, pakt u de sandwich voorzichtig op met behulp van steriele handschoenen. Schuif vervolgens het bovendeksel totdat het over het gepolymeriseerde gel hangt.
Pryk vervolgens het deksel los van het gel, gooi het bovendeksel weg. Plaats elke bodemgeldeksel, hierna hydrogel genoemd, in een zes-wellplaat.
Voeg vervolgens twee milliliter fosfaatgebufferd zoutwater of PBS toe per well van een zes-wellplaat. Was vervolgens de hydrogels met PBS en incubeer op een rocker gedurende vijf minuten. Herhaal deze wasbeurt twee keer.
Om het experiment te beginnen, bedekt u elk hydrogel met twee milliliter van een fibronectineoplossing of ander extracellulair matrix-eiwit. Incubeer het eiwit op het hydrogel gedurende een nacht bij vier graden Celsius om het covalent aan het hydrogel te laten binden. Na overnachtelijke incubatie aspireert u de ECM-oplossing. Blokkeer vervolgens de niet-reactieve NHS met één milligram per milliliter verwarmd geactiveerd vetzuur-vrij runder serumalbumine in serumvrij medium en incubeer gedurende minimaal 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Na incubatie, was de hydrogels eenmaal met steriel PBS. Plate vervolgens de cellen in het juiste gekweekte medium dat foetaal runderserum bevat. Op het hydrogel hier.
Er worden muizen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de invloed van de stijfheid van substraten op cellulaire functie met behulp van polyacrylamide-hydrogels. De methodologie omvat het creëren van hydrogels met verschillende complianties om in vivo weefselcondities te modelleren.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire biologie
- Biomaterialen
- Weefselengineering
Achtergrond
- Celgedrag wordt beïnvloed door de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix.
- Polyacrylamide-hydrogels kunnen de stijfheid van biologische weefsels nabootsen.
- Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor weefselengineeringtoepassingen.
- Immunofluorescence-microscopie en PCR-technieken worden gebruikt voor analyse.
Doel van het onderzoek
- Om in vivo weefselcompliantie in vitro te modelleren.
- Om te beoordelen hoe variërende compliantie van de extracellulaire matrix het celgedrag beïnvloedt.
- Om inzichten te geven in cellulaire reacties op mechanische stimuli.
Gebruikte methoden
- Bereiding van reactieve bodem- en gesiliconiseerde topdeksels.
- Creatie van acrylamide-hydrogels met verschillende stijfheidsniveaus.
- Kruisverbinding van extracellulaire matrixeiwitten aan de hydrogels.
- Incubatie en analyse van cellen met behulp van immunofluorescence-microscopie, real-time kwantitatieve PCR en western blotting.
Belangrijkste resultaten
- Resultaten tonen hoe compliantie van de extracellulaire matrix het celgedrag reguleert.
- Immunofluorescence-microscopie onthult veranderingen in celmorfologie.
- Real-time kwantitatieve PCR toont variaties in genexpressie gekoppeld aan stijfheid.
- Western blotting bevestigt veranderingen in eiwitexpressie als reactie op substraatcompliantie.
Conclusies
- Substraatstijfheid beïnvloedt cellulaire functies aanzienlijk.
- Polyacrylamide-hydrogels zijn effectief voor het modelleren van weefselcompliantie.
- De bevindingen hebben implicaties voor weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Modeling tissue stiffness in vitro enables mechanistic de-risking of therapeutic targets by linking extracellular matrix compliance to cellular phenotypes. This approach supports target validation in fibrosis, oncology, and cardiovascular disease by providing disease-relevant systems that predict cellular responses to biomechanical cues. Integrating hydrogel-based platforms early in discovery improves predictive confidence and informs portfolio triage based on pathophysiological relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by assessing how matrix stiffness regulates cell signaling pathways involved in proliferation and fibrosis.
- Operational Value: Enable functional target validation using disease-relevant stiffness conditions that mimic in vivo microenvironments.
- Predictive Value: Support preclinical decision-making by identifying targets whose activity is modulated by extracellular matrix compliance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare standardized hydrogels coated with ECM proteins to create reproducible substrates for compound screening.
- Quantitative Outputs: Generate measurable endpoints such as gene expression (via qPCR) and protein levels (via Western blot) that correlate with stiffness-dependent phenotypes.
- Screening Scalability: Enable evaluation of pharmacological agents across a range of tissue-mimetic compliances to identify context-specific efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Model fibrosis, tumor stroma, and vascular stiffening conditions by tuning hydrogel elasticity to pathophysiological ranges.
- Translational Continuity: Bridge discovery and preclinical workflows by using consistent stiffness-defined systems across target validation and lead optimization stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform go/no-go decisions based on whether compound effects are preserved under physiologically relevant mechanical cues.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for mechanosensitive pathways in fibrosis and cancer.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking matrix stiffness to changes in cyclin D1 expression and cell cycle progression.
- Screening: Enables assay standardization through tunable hydrogel stiffness and consistent ECM protein coating for reliable compound response assessment.
- Analytics: Provides quantitative readouts via immunofluorescence, qPCR, and Western blotting to compare cellular responses across stiffness conditions.
- Translational Research: Connects early findings to preclinical models by using stiffness ranges that reflect diseased tissues such as fibrotic liver or tumors.
- Enterprise Reuse: Establishes a tunable, reusable platform for evaluating targets across multiple disease areas where ECM remodeling is a hallmark.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating matrix stiffness as a variable influencing cell behavior and target engagement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hydrogel fabrication and protein crosslinking protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by de-risking targets early based on their responsiveness to biomechanical context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that maintain activity across physiological and pathological stiffness ranges.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials preparation and surface chemistry for reactive cover slip generation.
- Depends on access to rheometry or AFM for stiffness validation and batch-to-batch consistency.
- Necessitates standardization of ECM protein coating and blocking steps to ensure uniform ligand presentation.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to different cell types or 3D culture formats.
- Includes practical limitations such as hydrogel delamination if washing steps are insufficient or if glutaraldehyde crosslinking is incomplete.
