Name: Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Ontdek hoe substratuimstijfheid cellulaire functie beïnvloedt met polyacrylamide hydrogels. Deze methode modelleert in vivo weefselcompliantie voor weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk is ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health.

Voorbereiding <ul><li> Coverslips moet worden geautoclaveerd. </li><li> Steriel gedestilleerd of gedeïoniseerd water moet worden gebruikt om oplossingen voor te bereiden en voor het wassen van dekglaasjes. </li><li> AC (40% w / v) en bis-AC (1% w / v) oplossingen worden gesteriliseerd met 0,2 micrometer filtratie. Bereid 10% ammoniumpersulfaat (APS; 100μg/ml water) kort voor het gebruik en steriel filter. Vervang de APS-oplossing maandelijks. </li><li> Chemische reagentia zoals 3-APTMS, chloroform, glutaradehyde, NHS, en SurfaSil dat niet kan worden geautoclaveerd worden bewaard in een toegewezen fles uitsluitend gebruikt voor de bereiding van hydrogelen. </li><li> Voor de beste resultaten, moet hydrogels worden gebruikt binnen een paar dagen na de incubatie overnacht met de juiste ECM-eiwit. </li><li> Bereid een 10% SurfaSil in chloroform (10 ml is meestal genoeg voor 20 top dekglaasjes) in een 50 ml polypropyleen Falcon buis voor het gieten van de hydrogel. (Ons laboratorium meestal siliconizes de top dekglaasjes tijdens de 0,5% glutaaraldehyde incubatie stap). Voeg de dekglaasjes om de Falcon buis en rock gedurende minstens 10 minuten. Giet het SurfaSil oplossing en lucht de dekglaasjes op Kimwipes droog in de biologische veiligheid kast waar de hydrogelen zal worden voorbereid. </li><li> Bereid de hitte-geïnactiveerd BSA-oplossing als volgt: een 20 mg / ml, oplossing van de vetzuren vrij BSA in PBS is geïncubeerd in een 68 ° C waterbad gedurende 30 minuten. De oplossing wordt dan steriel gefiltreerd en opgeslagen bij 4 ° C. </li></ul> Procedure <ol><li> Leg een laag van Parafilm op de onderste helft van een 150-mm petrischaal. </li><li> Plaats tot 9 van 25 mm dekglaasjes op de top van de Parafilm en bedek ze met 1 ml 0,1 M NaOH. Incubeer gedurende 3 minuten en daarna zuigen met een stofzuiger lijn. </li><li> Werken in een chemische kap, plaats 0,5 ml 3-APTMS op elke dekglaasje aan. Incubeer gedurende 3 minuten en daarna zuig het APTMS. Als je te lang wacht, zal een schuim vormen. </li><li> Spoel na de dekglaasjes met 20 ml gedeïoniseerd water in dezelfde schotel. Verwijder de dekglaasjes van de schaal met behulp gebogen pincet en zet ze, met hun behandelde kant naar boven, naar een nieuw 150-mm schotel. Was de dekglaasjes met gedeïoniseerd water drie keer, op de rocker, gedurende 10 min. elke wasbeurt. Als u niet aan alle APTMS te verwijderen, zal het reageren met de glutaaraldehyde in de volgende stap en laat een wit troebel neerslag (Figuur 1). </li><li> Ontdooi de glutaraldehyde (~ 10 min voor gebruik). </li><li> Met behulp van gebogen tang, overdracht van de dekglaasjes om een ​​schone schotel gelaagd met Parafilm en zuig de resterende vloeistof. Gebruik een stofzuiger lijn of Kimwipe om het resterende water blot als dat nodig is. </li><li> Bedek alle dekglaasje met 0,5 ml van 0,5% glutaraldehyde in steriel gedeïoniseerd water en incubeer gedurende 30 minuten in een chemische kap. Zuig het glutaraldehyde. Spoel en was de dekglaasjes zoals in stap 4. Volledig droog de ​​dekglaasjes. [Je kunt hier stoppen en laat de dekglaasjes enkele weken in een droge ruimte]. </li><li> Wanneer u klaar bent om de hydrogelen te bereiden, te gebruiken gebogen tang om de dekglaasjes, reactieve kant naar boven, over te dragen aan een blad van de Parafilm die is opgenomen op het oppervlak van de biologische veiligheid kabinet. Zorg ervoor dat de dekglaasjes plat op de Parafilm oppervlak. </li><li> Bereid een verzadigde NHS oplossing in tolueen. (Los een kleine hoeveelheid van de NHS in voldoende tolueen voor de specifieke experiment. Hou het toevoegen van NHS beetje bij beetje tot de NHS niet meer oplost. De verzadigde oplossing is meestal bewolkt en roze.) </li><li> Vervolgens de voorbereiding van de acrylamide, bis-acrylamide, water en APS om het gewenste percentage acrylamide te bereiken. Voeg de reagentia in microcentrifugebuizen zoals hieronder is beschreven tot een totaal volume van 0.8ml. </li><li> Toen, op een aliquot in een tijd, de NHS toe te voegen en TEMED aan de 0,8 ml AC oplossing, vortex kort en ONMIDDELLIJK laat er eerst 3-5 gels met behulp van 140 ui per dekglaasje in de biologische veiligheid kap. Indien mogelijk moet alle stappen vanaf dit punt worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet. [Let op: verschillende grootte dekglaasjes gebruikt kan worden op basis van behoefte. Als 18-mm dekglaasjes worden gebruikt, gebruik ~ 33 ul AC oplossing per dekglaasje en een 18-mm boven gesiliconiseerde dekglaasje aan.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Bis-AC (%) </td></tr><tr><td></td><td> 0.3 (stijf) </td><td> 0.15 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 (zacht) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Water </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED</td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Plaats snel de gesiliconiseerde 25-mm dekglaasje op de top van elke gel voordat het begint te polymeriseren. Toevoeging van de top dekglaasje moet het mogelijk maken van de AC om volledig te bedekken de bodem dekglaasje aan. Incubeer deze "sandwich" bij kamertemperatuur tot de AC polymeriseert. (Controleer de resterende AC oplossing in de microcentrifugebuis om te bepalen wanneer polymerisatie heeft plaatsgevonden. Meestal een paar minuten voor de stevige gel en een iets langer voor zachte degenen worden volstaan.). </li><li> Voorzichtig pick-up van de sandwich (steriele handschoenen aan!) En schuif de bovenste dekglaasje tot het overhangen van de gepolymeriseerde gel. U kunt dan wrikken het uit de gel. Als u te lang wacht voordat u de top dekglaasje, zal de gel scheuren als het dekglaasje wordt verwijderd. </li><li> Gooi de top dekglaasje aan. Plaats de onderste gel-dekglaasjes (hierna te noemen de hydrogel) in 6-well platen met 2 ml PBS / goed. PBS kunnen worden toegevoegd voor of na de gel-dekglaasje aan elk putje. Was de hydrogels met PBS drie keer, op een rocker, 5 min per wasbeurt. </li><li> Herhaal stap 11-14 totdat het vereiste aantal van hydrogelen is opgesteld. </li><li> Bedek elk hydrogel met 2 ml van een fibronectine-oplossing (3 ug / ml in PBS) of andere ECM-eiwit (zie Klein et al.. 13 voor meer informatie.). De ECM-eiwit wordt covalent gebonden aan de hydrogel tijdens de nacht incubatie bij 4 ° C. </li><li> Zuig het ECM-oplossing en blok niet-gereageerde NHS met 1mg/ml hitte-geïnactiveerd vetzuren vrij BSA in serum-vrije media voor minstens 30 min bij 37 ° C in een celkweek incubator. Zodra Spoel de hydrogels met steriel PBS of celkweek medium. </li><li> Plaat cellen in de juiste kweekmedium dat FBS. Het aantal cellen gezaaid op de hydrogel moet worden bepaald door de gebruiker op basis van de mate van cel verspreiding en confluentie die nodig zijn voor experimenten. Ongeveer 10 5 cellen is meestal voldoende voor westerse blotting en qPCR analyse. </li><li> Na de incubatie periode kan cel eiwit of mRNA worden gehaald. De dekglaasjes worden zorgvuldig verwijderd uit de bronnen met behulp van gebogen pincet en geplaatst (cell-side down) op de top van 100 ul druppeltjes lysis buffer die zijn gespreid (2-3cm) langs een vel Parafilm op het lab bank. (Wij gebruiken standaard SDS sample buffer en TRIzol, respectievelijk van monsters voor te bereiden op western blotting en om RNA te isoleren voor qPCR.) Incubeer de cellen met de lysis buffer gedurende precies een minuut. Verwijder de dekglaasjes en breng de lysis buffer om een ​​microcentrifugebuis. Als alternatief voor de RNA-extractie alleen, kan de gebruiker elke hydrogel over te dragen aan een nieuwe 6-well plaat en voeg 1 ml TRIzol / goed. Incubeer gedurende 3 minuten en verwijder TRIzol oplossing voor opslag in een microcentrifugebuis. </li></ol> Aanvullende informatie over de procedures, zoals immunofluorescentie, is BrdU kleuring, transfectie, enz. voor cellen gezaaid op hydrogels beschreven in Klein et al.. 2007 13. Representatieve resultaten Grondig wassen van de dekglaasjes na toevoeging van APTMS is een belangrijke stap in het produceren van "reactieve" dekglaasjes. Indien een niet volledig te verwijderen van de APTMS, zal het reageren met de glutaaraldehyde in de volgende stap en een wit troebel neerslag zoals te zien in figuur 1A. Figuur 1B toont een goed gewassen en gedroogd dekglaasje aan. Als de neerslag zich ontwikkelt, moet de hele procedure opnieuw worden gestart vanaf het begin als het dekglaasje niet meer bruikbaar is. Na de vorming en hydrogel coating met ECM-eiwitten 's nachts, kunnen cellen worden gezaaid de volgende dag. Zoals figuur 2 laat zien, is er een duidelijk verschil tussen de cel verspreiding op harde versus zachte hydrogels. Zoals kan worden gezien door phalloidin kleuring in muis embryonale fibroblasten (MEF), cellen zich tot een grotere mate op stijf in vergelijking met zachte hydrogels. Sterker nog, zullen de meeste cellen verbonden aan een zachte hydrogel blijven compact en hechten minder efficiënt. Hoewel slechts MEF morfologie is weergegeven in figuur 2, het verschil in cel verspreiden is consistent in de verschillende andere cellijnen getest 11-12,14. Geheimen tot succes <ol><li> Zodra de procedure is gestart, is het zeer belangrijk om de dekglaasjes te houden met de 'reactieve' naar boven en in het achterhoofd te houden aan welke zijde is gecoat. </li><li> Handschoenen moeten worden gedragen ten allen tijde tijdens de procedure om een ​​werkomgeving die zo steriel mogelijk te verstrekken. </li><li> Het grootste deel van de eerste stappen worden uitgevoerd tussen een chemische dampkap en het lab bank. Alle stappen na het verwijderen van overtollige glutaaraldehyde uit de dekglaasjes moet worden uitgevoerd onder een biologische veiligheid kast. </li><li> Vanwege de verschillen in cel spreaDing (figuur 2), raden we zaaien tweemaal het aantal cellen op een zachte hydrogels in vergelijking met stijve hydrogels. </li><li> De AC polymerisatie proces is zeer snel. Voor de eerste keer gebruikt, kan een daling van de hoeveelheid APS of TEMED in de oplossing van het polymerisatieproces te verlengen. Probeer niet meer dan een paar dekglaasjes voor te bereiden in een keer. </li><li> In de celcyclus studies waar synchronisatie in G0 nodig is, we meestal serum-verhongeren cellen in plastic cultuur gerechten, trypsinize de cellen en reseed ze op hydrogelen van verschillende naleving in de aanwezigheid van mitogenen (FBS en / of groeifactoren). Deze procedure zorgt ervoor dat de start bevolking van G0-gesynchroniseerde cellen is identiek in alle monsters. Echter, voor veel signaaltransductie studies, kan de vereiste mitogeen stimulatie periode niet lang genoeg zijn om voor de bevestiging en de verspreiding van de cellen. In dit geval hebben we serum-verhongeren de cellen op de hydrogels en vervolgens direct te stimuleren met mitogeen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Figuur 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1a"> Figuur 1A. Verkeerd gewassen dekglaasje aan. Na toevoeging van APTMS, was dekglaasje gewassen voor 1-2 minuten voor de toevoeging van de glutaaraldehyde-oplossing. Een neerslag vormen op het dekglaasje dat niet is gewassen volgens de stappen beschreven in procedure. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Figuur 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1b"> Figuur 1B. Goed gewassen dekglaasje aan. Na toevoeging van APTMS, was dekglaasje gewassen voor drie keer 10 minuten elk voor toevoeging van de glutaaraldehyde-oplossing. Geen neerslag vormt op het dekglaasje. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Morfologie van de cellen op hydrogelen met verschillende stijfheid. Gevestigde MEFs werden gezaaid op met fibronectine gecoate hydrogelen van hoge of lage stijfheid voor 9 uur. Na de incubatieperiode werden de cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd met FITC-phalloidin, die bindt aan F-actine. MEF op hoge stijfheid gels vertonen stress-vezels en zijn goed verspreid in vergelijking met die gezaaid op lage stijfheid hydrogels. Schaalbalk = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger van kwantitatieve PCR resultaat van de muis cycline D1 mRNA niveaus. Serum uitgehongerd muis embryonale fibroblasten werden uitgeplaat op een hoge (3% acrylamide) of laag (0,3% acrylamide) stijfheid hydrogels en gestimuleerd met 10% FBS voor 9 uur. Na de RNA-extractie, was real-time kwantitatieve PCR-analyse uitgevoerd voor cycline D1 mRNA niveaus (genormaliseerd voor 18S RNA). G0 vertegenwoordigt cycline D1 mRNA van slapende cellen. Cycline D1 mRNA waarden significant stijgen op stijf hydrogelen, maar niet op zachte hydrogels. De gegevens zijn gemiddelde + / - SD van dubbele PCR-reacties.

<ol><li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+heterogeneous%2C+atherosclerotic+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li>
<li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness%2C+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li>
<li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis%3A+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%2C+cellular+tension%2C+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li>
</ol>

Een cruciaal element van de hydrogel polymerisatieproces is om te voorkomen dat luchtbel ontstaan ​​waardoor cellen te binden aan de glazen dekglaasje in plaats van de ECM-gecoate hydrogel zelf. Dit kan voorkomen worden door zorgvuldig te pipetteren de polymerisatie oplossing na vortexen en visueel ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen verstrikt zijn geraakt in de gel. We raden altijd aan de voorbereiding van extra &quot;reactieve&quot; coverslips en hydrogels om te zorgen genoeg voor experimenten. <p class="jove...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehyde, 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>Bewaren bij -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-aminopropyltrimethoxysilaan 97%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Bewaren bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>SurfaSil siliconeringsvloeistof</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Bewaren bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>NHS (N-hydroxysuccinimide-ester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>Bewaren bij 4&amp;#x00B0;C; maandelijks vervangen</td></tr><tr><td>Albumine, runderserum, in essentie vetzuurvrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>Bewaren bij 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Dekglasjes (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (18mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

het bestuderen van de effecten van matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik acrylamide-based hydrogelen

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Weefsel stijfheid is een belangrijke determinant van cellulaire functie, en veranderingen in weefsel stijfheid worden vaak geassocieerd met fibrose, kanker en hart-en vaatziekten 1-11. Traditionele cel biologische benaderingen aan het bestuderen van cellulaire functie door culturen van cellen op een vaste ondergrond (plastic borden of glas dekglaasjes) die niet kan goed zijn voor het effect van een elastische ECM of de variaties in ECM stijfheid tussen de weefsels. Om het model in vivo weefsel compliance in vitro, wij en anderen gebruiken ECM-gecoate hydrogels. In ons laboratorium worden de hydrogelen op basis van polyacrylamide die het bereik van het weefsel naleving biologisch 12 gezien kan nabootsen. &quot;Reactieve&quot; dekglaasjes worden gegenereerd door incubatie met NaOH gevolgd door toevoeging van 3-APTMS. Glutaraldehyde wordt gebruikt om cross-link van de 3-APTMS en de polyacrylamide gel. Een oplossing van acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) en ammoniumpersulfaat wordt gebruikt voor de polymerisatie van de hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is opgenomen in de AC-oplossing voor het verknopen ECM eiwit aan de hydrogel. Na polymerisatie van de hydrogel, is de gel oppervlak bedekt met een ECM-eiwit van de keuze, zoals fibronectine, vitronectine, collageen, etc. De stijfheid van een hydrogel kan worden bepaald door reologie of atomic force microscopie (AFM) en aangepast door het variëren van het percentage van de AC-en / of bis-AC in de oplossing 12. Op deze manier kan substraat stijfheid worden afgestemd op de stijfheid van de biologische weefsels, die ook kan worden gekwantificeerd aan de hand reologie of AFM. Cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld op deze hydrogelen en gekweekt op basis van de vereiste experimentele omstandigheden. Beeldvorming van de cellen en hun herstel voor moleculaire analyse is eenvoudig. Voor dit artikel, definiëren we zachte ondergrond als die met elastische moduli (E) &lt;3000 Pascal en stijve ondergrond / weefsels als die met E&gt; 20.000 Pascal.

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden gemodelleerd<em&gt; In vitro</em&gt; Gebruik van polyacrylamide hydrogelen van verschillende naleving.

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

Weefselstijfheid is een belangrijke determinant voor de cellulaire functie, en veranderingen in weefselstijfheid zijn gewoonlijk geassocieerd met fibrose, kanker en ...

Om de in vivo weefselcompliantie te modelleren met behulp van acrylamidehydrogelen. Dit wordt bereikt door eerst reactieve onderste dekglasjes en gesiliconiseerde bovenste dekglasjes te maken. De tweede stap van de procedure is het gieten en vervaardigen van de acrylamidehydrogelen.De derde stap van de procedure is het crosslinken van het gekozen extracellulaire matrixeiwit aan de hydrogel. De laatste stap van de procedure is de incubatie en analyse van de cellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe variërende compliantie van de extracellulaire matrix in vitro het celgedrag reguleert, door middel van analyse met immunofluorescentiemicroscopie, real-time kwantitatieve PCR en western blotting.Vandaag laten we u de procedure zien voor het genereren en gebruiken van acrylamide-hydrogels. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe de stijfheid van de extracellulaire matrix de celmorfologie, celsignalering en proliferatie reguleert. Laten we beginnen.Begin deze procedure met het genereren van reactieve dekglasjes. Plaats eerst een laag parafilm op de onderste helft van een Petri-schaal van 150 millimeter. Breng vervolgens maximaal negen geautoclaveerde dekglasjes van 25 millimeter over naar de parafilm en bedek deze met 1 milliliter 0,1 molar natriumhydroxide.Incubeer de dekglasjes gedurende drie minuten. Aspireer na incubatie het natriumhydroxide met een vacuümsysteem in een zuurkast. Pipetteer 0,5 milliliters 3-aminopropyltrimethoxysilaan of 3-APTMS op elk dekglasje. Incubeer de dekglasjes gedurende drie minuten en aspireer vervolgens het 3-APTMS. Neem voorzorg om niet te lang te incubeer om de vorming van schuim op het dekglas te voorkomen.Dekglas na de behandeling. Spoel de dekglazen eenmaal met 20 milliliters gedeïoniseerd water in hetzelfde schaaltje. Verwijder de dekglazen uit het schaaltje met een gebogen pincet en breng ze met de behandelde zijde naar boven over naar een nieuw schaaltje van 150 millimeter.Was de dekglasjes vervolgens opnieuw met gedeïoniseerd water en plaats ze gedurende 10 minuten op de rocker. Verwijder na de incubatie het water en was ze nog twee keer extra. Het is zeer belangrijk om al het A-P-T-M-S te verwijderen, zodat dit niet reageert met het glutaaraldehyde en 10 minuten voor het gebruik van het glutaaraldehyde een troebele witte neerslag achterlaat.Breng met een gebogen pincet de dekglasjes over naar een schoon schaaltje met een laag parafilm en zuig eventueel resterend vocht af met een vacuümlijn. Bedek vervolgens elk dekglasje volledig met 0,5 milliliters 0,5% glutaraldehyde in steriel gedeïoniseerd water om de drie A-P-T-M-S en de polyacrylamidegel te crosslinken. Incubeer de dekglasjes gedurende 30 minuten in een zuurkast. Zuig daarna de glutaraldehydespoeling af en was de dekglasjes opnieuw met gedeïoniseerd water.Droog vervolgens de dekglasjes volledig. Voeg nieuwe dekglasjes toe aan een Falcon-buis van 50 milliliter met een 10% surface seal-oplossing in chloroform en schud deze gedurende ten minste 10 minuten. Giet de surface seal-oplossing af en laat de glasjes aan de lucht drogen.Leg de dekglasjes op Kim wipes in de biologische veiligheidskast waar de hydrogels zullen worden bereid om te beginnen met de bereiding van de hydrogels. Gebruik gebogen pincetten om de dekglasjes met de reactieve zijde naar boven over te brengen naar een vel parafilm dat op het oppervlak van de biologische veiligheidskast is vastgeplakt. Zorg ervoor dat de dekglasjes plat op het parafilmoppervlak liggen.Bereid vervolgens een verzadigde hydroxy CIN-hulpstof- of NHS-oplossing in tolueen door een kleine hoeveelheid NHS op te lossen in voldoende tolueen. Voeg voor de specifieke experimenten kleine hoeveelheden NHS toe totdat de NHS niet langer oplost. De verzadigde oplossing is gewoonlijk troebel en roze.Bereid vervolgens de acrylamide, BIS-acrylamide, water en een PS voor om het gewenste acrylamidepercentage te bereiken. Voeg de reagentia toe aan de microcentrifugebuisjes zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Doe dit vervolgens aliquot voor aliquot.Voeg de NHS en TM toe. Vortex de buis kortstondig en giet onmiddellijk over drie tot vijf gels, waarbij 140 µL per dekglas wordt gebruikt in de biologische veiligheidskabinetten. Plaats snel het GESILICONISEERDE 25 mm dekglas bovenop elke gel voordat de polymerisatie begint.Door het toevoegen van het bovenste dekglas wordt het acrylamide over het onderste dekglas verspreid. Incubeer deze sandwich bij kamertemperatuur totdat het acrylamide polymeriseert om vast te stellen wanneer de polymerisatie is voltooid. Controleer de resterende acrylamide-oplossing in het microcentrifugebuisje.De polymerisatie duurt enkele minuten voor stijve gels en iets langer voor zachte gels. Zodra de polymerisatie is voltooid, tilt u de sandwich voorzichtig op met steriele handschoenen. Schuif vervolgens het bovenste dekglas weg totdat het over de gepolymeriseerde gel hangt.Wip vervolgens de afdekking open. Schuif de gel eraf en gooi het bovenste dekglas weg. Plaats elk onderste gel-dekglas, hierna aangeduid als de hydrogel, in een six-well plaat.Voeg vervolgens twee milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS toe per putje van een zes-wells plaat. Was vervolgens de hydrogels met PBS en incubeer deze vijf minuten op een rocker. Herhaal deze wasstap twee keer.Om met het experiment te beginnen, wordt elke hydrogel bedekt met twee milliliters van een fibronectine-oplossing of een ander extracellulair matrixeiwit. Incubeer het eiwit overnight bij 4 °C op de hydrogel om covalente binding aan de hydrogel mogelijk te maken; aspireer na de overnight incubatie de ECM-oplossing. Blok vervolgens de niet-reactieve NHS met 1 mg/mL hitte-geactiveerd vetzuurvrij bovien serumalbumine in serumvrij medium en incubeer dit gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C.Was na incubatie de hydrogels eenmaal met steriele PBS. Zaai vervolgens de cellen uit op de hydrogel in het geschikte kweekmedium dat foetaal runderserum bevat.Gevestigde embryonale muis fibroblasten worden gebruikt. Bepaal het aantal cellen dat op de hydrogel moet worden gezaaid op basis van de mate van celspreiding en confluentie die vereist is voor het experiment. Voor western blot- en kwantitatieve PCR-analyse zijn ongeveer 10⁵ cellen nodig.Incubeer de cellen vervolgens onder de passende condities voor het specifieke celtype. Na de incubatieperiode wordt het celproteïne of mRNA geëxtraheerd, afhankelijk van de behoefte.Pipetteer druppels van 100 µL lysisbuffer op een vel parafilm op de laboratoriumbank, met ongeveer twee tot drie centimeter tussen elke druppel. Verwijder vervolgens voorzichtig elke hydrogel door het onderste dekglas uit de well te tillen. Gebruik hiervoor gebogen pincet en plaats de zijde met de cellen naar beneden op de druppels.Incubeer de cellen precies één minuut met de lysisbuffer. Verwijder tot slot de dekglasjes en breng de lysisbuffer over naar een microcentrifugebuisje. Bij RNA-extractie kan men alternatief elke hydrogel overbrengen naar een nieuwe zes-wells plaat en één milliliter triazol per well toevoegen.Incubeer de gels gedurende drie minuten na de incubatie. Verwijder de triazooloplossing voor bewaring in een microcentrifugebuisje. Grondige wassing van de dekglasjes na toevoeging van A-P-T-M-S is een belangrijke stap bij het produceren van reactieve dekglasjes.Correct gewassen en droge dekglasjes zijn vrij van elk residu van neerslag. A-P-T-M-S zal reageren met het glutaaraldehyde en een wit troebel neerslag vormen. Indien er neerslag optreedt, moet de volledige procedure worden herhaald aangezien het dekglasje niet langer bruikbaar is.Na de vorming van de hydrogel en de coating met ECM-eiwitten worden de cellen gedurende de nacht uitgezaaid. Er is een duidelijk verschil tussen cellen die uitspreiden op stijve versus zachte hydrogelen, zoals te zien is bij de phalloidine-kleuring; muis embryonale fibroblasten spreiden zich in grotere mate uit op stijve hydrogelen vergeleken met zachte hydrogelen. Inderdaad blijven de meeste cellen die aan een zachte hydrogel hechten compact en hechten ze minder efficiënt.Representatieve resultaten van de kwantitatieve PCR van de mRNA-niveaus van cycling D1 in embryonale fibroblasten van muizen tonen aan dat cycling D1 significant is opgereguleerd op een stijve matrix, maar niet op een zachte matrix. Dit suggereert dat de stijfheid van de matrix de progressie van de celcyclus in vitro reguleert. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u hydrogels met verschillende stijfheden kunt genereren om in vivo fysiologische condities na te bootsen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra reactieve dekglasjes te maken, aangezien er ongelukken en fouten zullen optreden.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

This video demonstrates an assay to study the effect of extracellular matrix (ECM) stiffness on bacterial infection of adherent cells. Polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, overlaid with collagen, are layered in a multi-well plate to mimic the stiffness of physiological ECM. Upon overlaying human endothelial cells on the hydrogels and infecting the cells with Listeria monocytogenes bacteria engineered to express a fluorescent protein once intracellular, flow cytometry is used to...

An Assay to Study the Impact of Extracellular Matrix Stiffness on Bacterial Infection

We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Ons laboratorium heeft DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels, een dynamisch hydrogel systeem ontwikkeld om de effecten van modulerende weefsels stijfheid op celfunctie beter te begrijpen. Hier bieden we schema's, beschrijvingen en protocollen om deze hydrogels bereiden.

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Ontdek hoe substratuimstijfheid cellulaire functie beïnvloedt met polyacrylamide hydrogels. Deze methode modelleert in vivo weefselcompliantie voor weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

Meer video's verkennen