Name: Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Ontdek LAESI-massaspectrometrie voor moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms onder atmosferische druk. Deze methode analyseert monsters direct zonder voorbehandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële ondersteuning van dit werk door de Amerikaanse National Science Foundation onder Grant nummer 0719232, door het Amerikaanse Department of Energy (DEFG02-01ER15129), en door Protea Biosciences, Inc (Morgantown, WV). De auteurs wil ook Jessica A. Stolee bedanken voor haar hulp tijdens de video-opnamen van het protocol.

Het volgende protocol beschrijft de belangrijkste stappen van de laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) experiment en geeft representatieve voorbeelden voor laterale en drie-dimensionale (3D) beeldvorming voor dieren en planten weefselmonsters. Extra experimentele en technische details kunnen worden verkregen van elders. 1-6 1. Tissue Voorbereiding en montage <ol><li> Als het snijden nodig is, een cryomicrotoom te gebruiken om de sectie weefsel in 10 tot 100 micrometer dikke plakken bij -10 tot -20 ° C, tenzij anders aanbevolen voor een bepaald weefsel type. </li><li> Monteren delen op een vlakke ondergrond (bijvoorbeeld chemisch gereinigd pre-glasplaatje) rechtstreeks, zonder chemische modifiers. Voor de coupes weefsels, dooi-mount de secties en zet de sample houder een Peltier-koeling fase onmiddellijk na dooi-montage aan het weefsel bevroren te allen tijde tijdens de analyse te houden. Deze stap is nodig om een ​​minimum te beperken / voorkomen moleculaire migratie in de sectie. </li><li> Indien nodig, gebruik dan een koellichaam is uitgerust met een low-power ventilator warmte-afvoer te vergemakkelijken van de Peltier-stadium te houden het weefsel bevroren. </li><li> In een vochtige omgeving over een langere periode van tijd (1-2 uur), te inspecteren voor de condensatie van water of ijs op het weefsel oppervlak. Condensatie van waterdamp op het weefsel beïnvloedt nadelig de imaging prestatie in LAESI experimenten. 1 </li><li> Indien nodig, gebruik dan een kamer ontvochtigingstoestel of plaats de gekoelde monster in een milieu-kamer gevuld met een inert gas (bijv. droge stikstof gas) om condensatie te voorkomen. 1 </li></ol> 2. Optimalisatie van de LAESI Ion Bron De LAESI ion bron bestaat uit een mid-infrarood laser, een reeks van optische elementen voor lichte besturing en gericht alsmede aanvullende steekproef houders, koeling componenten, vertaling podia, en een oplosmiddel leveringssysteem. Figuur 1 toont de typische opbouw van deze elementen met betrekking tot de ingang van de atmosferische druk ionenbron van een massaspectrometer. <ol><li> Zoals geïllustreerd in figuur 1, positie van het monster 15-20 mm onder de opening van de massa spectrometer sampling cone (d OR-FP). </li><li> Werken een mid-IR laser op 2,94 micrometer golflengte en 10 Hz herhalingsfrequentie. Het verkleinen van de laser output naar ~ 100 μJ / puls energie. </li><li> Gebruik een combinatie van goud spiegels en een focus lens transparant op de laser golflengte (bijvoorbeeld een plano-convexe CaF 2 of ZnSe lens) te koppelen van de laserpuls energie in het monster bij een normale frequentie (zie rechts invalshoek met betrekking tot monster oppervlak in Figuur 1). </li><li> Positie van het midden-infrarood straal as van 5-8 mm in de voorkant van de opening van de massa spectrometer sampling cone. </li><li> Pas de focus lens positie en de puls energie van de laserstraal om weefsel te verwijderen bereiken in het brandpunt. De afmetingen van de geablateerd volume bepalen de pixel (voxel of in drie-dimensionale beeldvorming) maat voor de beeldvorming toepassing. </li><li> Plaats een nanospray zender in lijn met de inlaat as van de massaspectrometer en een doorlaat-to-emitter tip afstand van ~ 10 mm (zie figuur 1). </li><li> Voor de elektrospray, bereiden 50% methanol-oplossing met 0,1% azijnzuur of 0,1% ammoniumacetaat additief voor positieve of negatieve ion-modus, respectievelijk. Afhankelijk van het monster, overige organische oplosmiddelen, zoals acetonitril, isopropanol, etc., kunnen in plaats van methanol bij concentraties die geschikt is voor de analytische taak. De stabiliteit van de electrospray is cruciaal voor een succesvolle beeldvorming. Afhankelijk van het oplosmiddel selectie, het debiet en de spuiten spanning moeten worden aangepast om stabiele spuiten te bereiken. </li><li> Voor reactieve LAESI 6 in imaging-toepassingen, kan de electrosprayed oplossing bevat reactanten. </li><li> Gebruik een spuit pomp naar de electrospray oplossing te leveren door middel van de electrospray zender met een debiet van ~ 300 nL / min. </li><li> Als de massa spectrometer opening wordt gehouden op een laag voltage (&lt;500 V gemeten tegen de grond), het genereren van electrospray door het aanbrengen van hoge spanning direct op de electrospray emitter (bv, 3000 V) of door middel van een metalen verbinding bezitten. Anders, de grond direct de electrospray zender of door metalen vakbond electrospray vast te stellen. </li><li> Bedien de electrospray bron in kegel-jet spuiten mode voor de meest efficiënte ion generatie door LAESI. Voor het effect van die variabelen op het sproeien modes en hun effect op de massa spectra, elders zie de discussies. 5,7,8 </li><li> Voorzichtig aan te passen van de relatieve afstanden van de LAESI setup te optimaliseren voor LAESI ion opleveren terwijl de laserstraal, de emitter, en de opening assen in hetzelfde vlak. Gelieve elders vindt gedetailleerde instructies. 5 </li><li> Met een optische microscoop, bepalen de laterale afmetingen van de ablatie krater op het monster. </li><li> Voor drie-dimensionale LAESI imaging experimenten uit te voeren ablatie met individuele pulsen en bepalen de diepte van een voxel gebruikt, bijvoorbeeld, de z-stack mode in optische microscopie. 3 </li></ol> 3. Moleculaire Beeldvorming en data-analyse In de beeldvorming experiment, is het weefselmonster verplaatst in het brandvlak van de laser in de X-en Y-richting met stap groter dan of gelijk aan de afmetingen van de ablatie plek. De ruimtelijke resolutie wordt beperkt door de concentratie van de invallende laserstraal. <ol><li> Selecteer het gebied van de rente op het monster oppervlak en het verkrijgen van de (X, Y) coördinaten van de bijbehorende grenzen. </li><li> Kies een gridding algoritme (bijvoorbeeld adaptieve grid, geselecteerd gebied imaging, rechthoekig rooster, spiraal patroon, Z scanning, enz.), waarmee het monster oppervlak raster met geselecteerde dwell-tijd op elke pixel op het gebied dat moet worden afgebeeld. </li><li> Gebruik een drie-assige vertaling podium en software die in staat is rastering de steekproef op basis van de vooraf bepaalde grid. </li><li> Bereken de totale tijd die nodig is voor de beeldvorming. </li><li> Schakel de data-acquisitie termijn van de massaspectrometer. Indien dit niet mogelijk is, stelt u de data-acquisitie tijd te beperken tot de berekende beeldvorming tijdswaarde. </li><li> Start het mid-infrarood laser bron een herhalingssnelheid goed om voldoende signaal-ruisverhouding te produceren in de massa spectrum binnen de dwell time van elke pixel naar een LAESI laterale imaging experiment uit te voeren. Voor 3D moleculaire beeldvorming, gebruik maken van een spectrum overname die hoger is dan de laserbron herhalingsfrequentie met succes massa-analyse van de ionen gegenereerd binnen een enkele laserpuls. Wacht tot de START-signaal naar de ablatie volgorde te starten. </li><li> Zet de electrospray bron. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing voor de volle tijd die nodig is voor de beeldvorming. </li><li> Tegelijkertijd starten de overname van massaspectra, de mid-IR-laser ablatie, en het oppervlak scannen. </li><li> Wanneer de beeldvorming run is voltooid, STOP het oppervlak scannen, de mid-IR stralend, en de data-acquisitie. </li><li> Schakel de laserbron. </li><li> Zet de hoogspanning. </li><li> Schakel de injectiepomp. </li><li> Stel de massaspectrometer te STANDBY-modus. </li><li> Zet de Peltier-koeling elektronica. </li><li> Sluit inert gas stromen als het gebruikt wordt. </li><li> Gebruik een software om de absolute coördinaten van de pixels in de laterale imaging of de voxels in 3D analyse correleren met de bijbehorende spectra. </li><li> Plot de ion intensiteit signaal voor een geselecteerde m / z-waarde ten opzichte van de absolute coördinaten van analyse tot zijdelingse-en 3D-moleculaire beelden te verkrijgen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Figuur 2 geeft representatieve resultaten voor een aantal belangrijke weefseltypen en imaging modaliteiten. Paneel A toont een geval voor een dierlijk weefsel sectie die bevroren is geweest tijdens het experiment om uitdroging te voorkomen. 1 Daarnaast is de steekproef was gevestigd in een droge stikstof gas-omgeving aan het omgevingslicht water dampen vermijden van condensatie op het monster oppervlak. Een 100-um dikke coronale gedeelte van een rat hersenen (Rattus norvegicus) is zijdelings belicht met LAESI. De anatomische gebieden van de hersenen (zie de optische beeld in paneel A) tonen een goede correlatie met de moleculaire beeld verkregen voor de plasmalogens PC (O-33: 3) en / of PE (O-36: 3) met m / z 728.559. Panel B geeft de 3D-LAESI beeldvorming van een Zebra plant (Aphelandra squarrosa) bladweefsel. Omdat de bladeren hebben een natuurlijk afweermechanisme tegen uitdroging, kan het monster worden ondervraagd in de omgeving. 3 De verkregen 3D moleculaire beelden bleek een groot aantal distributie patronen voor primaire en secundaire metabolieten. Onder andere werd acacetin met m / z 285.076 ontdekt bij hogere ion telt in de gele sectoren van de tweede en derde lagen van de top met een homogene verdeling in de andere. Deze verdeling is overeengekomen met het patroon van de afwisseling gezien in de optische beeld. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische voorstelling van de LAESI systeem (ES, electrospray emitter tip, OF, opening van de massa-spectrometer sampling cone, FL, met de nadruk lens, FP, brandpunt, P, Peltier koeling fase, HS, koellichaam). Een deel van de fijn stof uitgestoten tijdens de mid-IR-ablatie (rode stippen) samensmelt met de elektrospray om geladen druppeltjes bezaaid met moleculen en ionen van het monster (groene stippen) opleveren. De ionen vrijkomen van deze druppeltjes worden geanalyseerd en opgenomen door de massa spectrometer. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve resultaten voor laterale en 3D imagi. ng met LAESI massaspectrometrie (A) Het bovenste paneel toont de optische beeld van een rat hersenen (Rattus norvegicus) coronale gedeelte en de moleculaire beeld verkregen voor de plasmalogens PC (O-33: 3) en / of PE (O-36 : 3) met m / z 728.559. De witte schaal balk komt overeen met 1 mm. Aangepast met toestemming van (referentie 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Het onderste paneel toont de 3D-beeldvorming van een blad van een bonte Zebra plant (Aphelandra squarrosa). Acacetin met m / z 285.076 werd gedetecteerd bij hogere ion telt in de gele sectoren van de tweede en derde lagen van de top met een homogene verdeling in de andere. Herdrukt met toestemming van (referentie 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure%2C+in+vivo%2C+and+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNemes%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li>
<li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
</ol>

Verschillende weefseltypen vertonen variërende gehalte aan water en de treksterkte, die op hun beurt, kunnen invloed hebben op de ablatie eigenschappen van de monsters. Negen Om deze gevolgen te verzachten, is het gewenst dat de laser Fluence, omgang met monsters, en analyse protocollen worden herzien bij het ​​wisselen tussen grote weefseltypen. Voor enkele cel of hogere resolutie onderzoeken, het midden-infrarood licht kan worden gekoppeld in een geslepen optische vezel in plaats van een focus lens. 10 Bij het ​​positioneren van de fiber tip in de nabijheid van de geselecteerde cellen in een weefsel, kan LAESI analyse worden uitgevoerd op een single-cell niveau. Als een label-free ionenbron voor omgevingstemperaturen ionisatie massa spectrometrie, heeft 11 LAESI zien een groot potentieel voor het onderzoek naar de biochemische processen in weefsels. Met de toegevoegde voordelen van een directe analyse, laterale en 3D beeldvorming, LAESI is een opkomende bio-analytische hulpmiddel voor het profileren en grafische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Massaspectrometer</td><td>Waters</td><td>Q-TOF Premier</td><td></td></tr><tr><td>Mid-IR laser</td><td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td><td>Vibrant IR</td><td></td></tr></tbody></table>

atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door laesi massaspectrometrie

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionisatie massa spectrometrie methoden in staat analytisch onderzoek direct worden uitgevoerd op een tissue of biofilm onder natieve-achtige experimentele omstandigheden. Laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) is een dergelijke ontwikkeling en is bijzonder goed geschikt voor het onderzoek van water-bevattende monsters. LAESI maakt gebruik van een mid-infrarode laserstraal (2,94 micrometer golflengte) te prikkelen de watermoleculen van het monster. Wanneer de ablatie fluence drempel wordt overschreden, wordt het monstermateriaal verdreven in de vorm van fijn stof en deze projectielen reizen naar tientallen millimeters boven het monster oppervlak. In LAESI, wordt deze ablatie pluim onderschept door sterk geladen druppeltjes met een fractie van de uitgestoten monstermateriaal te vangen en de chemische bestanddelen te zetten in gas-fase ionen. Een massa-spectrometer uitgerust met een atmosferische druk ionenbron-interface wordt gebruikt om te analyseren en registreren van de samenstelling van de vrijgekomen ionen afkomstig uit de peilden gebied (pixel) van het monster. Een systematische ondervraging over een reeks van pixels opent een weg voor de moleculaire beeldvorming in de microprobe analyse-modus. Een uniek aspect van LAESI massaspectrometrische beeldvorming is diepte profilering dat, in combinatie met de laterale beeldvorming, maakt het mogelijk drie-dimensionale (3D) moleculaire beeldvorming. Met de huidige zijdelingse en diepte resoluties van ~ 100 micrometer en ~ 40 um, respectievelijk, LAESI massaspectrometrie imaging helpt bij het verkennen van de moleculaire structuur van biologische weefsels. Hierin bespreken we de belangrijkste elementen van een LAESI systeem en geven richtlijnen voor een succesvolle imaging experiment.

Laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) is een atmosferische druk ionenbron voor massaspectrometrie. In de beeldvorming modus, een mid-infrarood laser peilt naar de verdeling van moleculen over een tissue sectie of een biofilm. Deze techniek biedt een nieuwe aanpak voor de diverse bio-analytische studies onder autochtone experimentele omstandigheden uitgevoerd.

Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Omgevingsionisatiemethoden in massaspectrometrie maken het mogelijk om analytische onderzoeken direct uit te voeren op weefsel of een biofilm onder natuurgetrouwe...

Om een lazy massaspectrometrie-imaging-experiment uit te voeren op biologisch weefsel of een biofilm, wordt de lazy-opstelling klaargemaakt voor een robuuste werking. De volgende stap is het monteren van het monster in een monsterhouder en het bepalen van de experimentele condities die vereist zijn voor het te onderzoeken monster. Vervolgens wordt het laterale lazy moleculaire imaging-experiment gestart en worden de vereiste gegevens gebruikt om ruimtelijke moleculaire distributies te verkrijgen.De resultaten tonen de moleculaire architectuur van biologische weefsels en biofilms. Ik ben dr. Peter Nemes van het Vertus Research Laboratory aan de George Washington University. Het belangrijkste voordeel van de LAESI-techniek ten opzichte van andere methoden, waaronder confocale, optische en massaspectrometrie-beeldgevingsmethoden zoals MALDI en SIMS, is dat de monsteranalyse direct op het weefsel kan worden uitgevoerd onder atmosferische drukcondities en dat er geen monstervoorbehandeling nodig is.Monteer de weefselcoupes van belang direct op een vlak oppervlak, zoals een chemisch vooraf gereinigde glazen objectglas zonder chemische modificatoren. Bevestig het monster direct na montage aan een peltier-koelplateau indien nodig; gebruik een koelblok voorzien van een ventilator met een laag vermogen om de warmteafvoer van het peltier-plateau te bevorderen. Controleer vervolgens, indien er gedurende een langere periode van ongeveer één tot twee uur in een vochtige omgeving wordt gewerkt, op condensatie van water of ijs op het weefseloppervlak.Watercondensatie op het weefsel heeft een nadelig effect op de beeldprestaties bij LAIR-experimenten. Gebruik indien nodig een ontvochtiger in de ruimte of plaats het betreffende monster in een omgevingskamer gevuld met een inert gas, zoals droge stikstofgas, om condensatie te voorkomen. Na het optimaliseren van de condities voor het in stand houden van het monster, dient men de ionenbron te optimaliseren; de laserablatie, electrospray-ionisatie of LAIR-ionenbron bestaat uit een mid-infraroodlaser, afgekort als mid-IR, en een reeks optische elementen voor het sturen en focussen van het licht.De opstelling omvat daarnaast extra monsterhouders, koelcomponenten, translatietrappen en een elektrospray-systeem. Een deel van het fijnstof dat tijdens de mid-IR-ablatie wordt uitgestoten, versmelt met de elektrospray om geladen druppels te vormen waarin moleculen en ionen van het monster zijn ingebed. De ionen die uit deze druppels vrijkomen, worden geanalyseerd en geregistreerd door de massaspectrometer, waarvan de opening hier wordt getoond.De opstelling wordt geconfigureerd voordat het experiment wordt gestart. Nauwkeurige aanpassingen van de experimentele parameters zijn vereist om de gekozen sample aan te passen en de ionenbron te optimaliseren. Begin met het positioneren van de sample 15 tot 20 millimeter onder de opening van de bemonsteringskegel van de massaspectrometer.Bedien de mid-IR-laser op een golflengte van 2,94 micrometer en een herhalingssnelheid van 10 hertz. Demp de laseruitgang tot een energie van ongeveer 100 micro joule per puls. Gebruik een combinatie van gouden spiegels en een focuslens die transparant is bij de lasergolflengte om de laserlichtenergie in het monster te koppelen.Positioneer de mid-infrarode B-as bij normale invalshoeken vijf tot acht millimeter vóór de opening van de bemonsteringsconus van de massaspectrometer. Pas de positie van de focuslens en de laserpulsergie aan om weefselverwijdering in de brandpuntsplek tot de gewenste diepte te bereiken. De afmetingen van het geablateerde volume.Bepaal de pixelgrootte voor de beeldgevingsapplicatie. Plaats een nanospray-emitter in lijn met de inlaatas van de massaspectrometer, op een afstand van ongeveer 10 millimeter van het orifice. Bereid voor de electrospray een 50% methanoloplossing voor met 0,1% azijnzuur voor de positieve ionmodus of 0,1% ammoniumacetaat.Voor de negatieve ionmodus. De stabiliteit van de electrospray is cruciaal voor een succesvolle beeldvorming. Afhankelijk van de keuze van het oplosmiddel moeten de stroomsnelheid en de spuitspanning worden aangepast om een stabiele spray te bereiken.Voor reactieve, lazy en imaging-applicaties kan de electrospray-oplossing reactanten bevatten. Gebruik een spuitenpomp om de electrospray-oplossing via de electrospray-emitter toe te dienen met een stroomsnelheid van ongeveer 300 nanoliters per minuut. Als de opening van de massaspectrometer op een laag voltage wordt gehouden, bijvoorbeeld onder ongeveer 500 volt ten opzichte van de massa, kan electrospray worden gegenereerd door een hoog voltage, bijvoorbeeld 3000 volt, direct op de electrospray-emitter of via een metalen koppeling aan te brengen.Bedien de electrospraybron in cone jet spraying-modus voor de meest efficiënte iongeneratie; pas de relatieve afstanden van de opstelling zorgvuldig aan om de ionopbrengst te optimaliseren, terwijl de assen van de laserstraal, de emitter en de opening met een optische microscoop in hetzelfde vlak worden gehouden. Bepaal de laterale afmetingen van de ablatiekrater op het monster voor driedimensionale imaging-experimenten. Voer de ablatie uit met individuele pulsen en bepaal de diepte van een voxel met behulp van bijvoorbeeld de Z-stack-modus in de optische microscopie.Nu de weefselmontagecondities en de ionisatiebron zijn geoptimaliseerd, kan worden overgegaan tot moleculaire beeldvorming in het beeldvormingsexperiment. Het weefselmonster wordt in het brandvlak van de laser in de x- en y-richting verplaatst met stapgroottes die gelijk zijn aan of groter dan de afmetingen van de ablatieplek. De ruimtelijke resolutie wordt beperkt door de focussering van de invallende laserstraal.Selecteer een interessegebied op het oppervlak van het monster en bepaal de XY-coördinaten van de bijbehorende grenzen. Kies een rasteralgoritme om het monsteroppervlak te rasteren met een geselecteerde verblijftijd per pixel over het te beelden gebied. Gebruik een drievoudige XS-translatiepodia en software die in staat is om het monster volgens het vooraf vastgestelde raster te bewegen.Bereken vervolgens de totale tijd die nodig is voor de beeldvorming. Start de mid-infrarood laserbron op een herhalingssnelheid die passend is om een voldoende signaal-ruisverhouding te produceren voor de geselecteerde ionen in het massaspectrum binnen de verblijftijd per pixel. Schakel de electrospraybron in om een lazy lateral imaging-experiment uit te voeren.Zorg ervoor dat er voldoende oplossing aanwezig is voor de volledige tijd die nodig is voor de beeldvorming. Start nu gelijktijdig de acquisitie van massaspectra, de mid-IR laserablatie en het oppervlaktescanproces en verzamel de gegevens. Zodra de beeldvormingsrun is voltooid, stop je het scannen van het oppervlak, de mid-IR laser en de data-acquisitie.Schakel de laserbron uit, zet de hoogspanning uit, schakel de spuitpomp uit en zet de massaspectrometer in de stand-by-modus. Schakel daarnaast de elektronica voor de plaatkoeling uit en sluit de inerte gasstroom. Indien van toepassing.Plot tenslotte het ionintensiteitssignaal voor een geselecteerde MZ-waarde tegen de absolute analysecoördinaten om laterale of 3D moleculaire beelden te verkrijgen. Dit zijn representatieve beelden van laterale lazy imaging van een 100 micrometer dikke coronale doorsnede van een rattenbrein. De doorsnede werd tijdens het experiment bevroren en bewaard in een droge stikstofgasomgeving.De anatomische hersengebieden vertonen een goede correlatie met het moleculaire beeld verkregen voor twee plasmodium met MZ 2 78 0,59. Dit is een moleculair beeldexperiment in 3D met gebruik van bladweefsel van de zebraplant, waarbij in de omgevingscondities werd gezocht naar onder andere primaire en secundaire metabolieten. ASCE met MZ 2 85 0,076 werd gedetecteerd met hogere ionenaantallen in de gele sectoren van de tweede en derde laag vanaf de bovenkant, met een homogene distributie.Bij de andere kwam deze distributie overeen met het patroon van de variatie dat in het optische beeld werd waargenomen. H Na de ontwikkeling hiervan. De lazy-techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de analytische en B chemie om de moleculaire samenstelling en ruimtelijke organisatie van weefsels en biofilms met een aanzienlijk watergehalte te bestuderen.Vergeet niet dat werken met een mid-infraroodlaser en een elektrische spuitbron extreem gevaarlijk kan zijn. Volg tijdens deze procedure altijd de standaard laserveiligheidsprotocollen en pas een geschikte afscherming toe op alle elektrische verbindingen.

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Enkele cel analyse wordt uitgevoerd door middel van massaspectrometrie op plantaardige en dierlijke cellen bij atmosferische druk met behulp van een scherp glasvezelkabel aan de cellen voor laser-ablatie electrospray ionisatie (LAESI) massaspectrometrie monster.

Directe analyse van enkele cellen met behulp van massaspectrometrie bij atmosferische druk

Secundaire electrospray ionisatie massa spectrometrie (Sesi-MS) kan de detectie van vluchtige organische stoffen (VOS), zonder de noodzaak voor een monstervoorbehandeling. Dit protocol bevat instructies voor het snel (binnen minuten) karakterisering van bacteriële VOS met behulp van Sesi-MS.

Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)

Desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie (DESI-MS) is een ambient methode waarbij monsters, met inbegrip van biologische weefsels, kunnen worden afgebeeld met een minimale monstervoorbereiding. Door rastering het monster onder de ionisatie-elektrode, deze spray-gebaseerde techniek voldoende ruimtelijke resolutie om moleculaire kenmerken van belang te onderscheiden binnen coupes.

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Laser-induced afbraak spectroscopie uitgevoerd op dunne orgaan-en tumorweefsel met succes natuurlijke elementen en kunstmatig geïnjecteerd gadolinium (Gd), die met ingang van Gd-gebaseerde nanodeeltjes aangetroffen. Afbeeldingen van chemische elementen bereikt een resolutie van 100 micrometer en kwantitatieve sub-mm gevoeligheid. De verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel om meerdere beelden van een zelfde biologisch weefsel te bieden.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes&#39;s Mapping en kwantificering in orgaanweefsel

Hier presenteren we protocollen om zowel ambient massaspectrometrie beeldvorming (MSI) van weefsels en in-situ live enkele cel MS (SCMS) analyse uit te voeren met behulp van de enkele sonde, een geminiaturiseerd multifunctioneel apparaat voor MS analyse.

Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Een massaspectrometrie-beeldvormingsbron (MSI) die op atmosferische druk werkte, werd ontwikkeld door mid-infrarood laserdesorbentie te koppelen met post-ionisatie door middel van elektrospray. Exogeen ijsmatrix werd gebruikt als de energieabsorberende matrix om resonante desorbentie van weefselgerelateerd materiaal te vergemakkelijken. Dit manuscript biedt een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van IR-MALDESI MSI van een neonatale muis in zijn geheel.

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Een protocol voor het karakteriseren van de chemische samenstelling van uitgeademde adem in real-time met behulp van ionisatie van de secundaire nanoelectrospray gekoppeld aan hoge resolutie massa spectrometrie wordt aangetoond.

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.

Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Dit protocol beschrijft enkelcel massaspectrometrie beeldvorming van OVCAR-8-cellen met behulp van desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan Orbitrap-massaspectrometers voor metabolomische analyse met hoge ruimtelijke resolutie.

Single-cell massaspectrometriebeeldvorming met desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan orbitrap-massaspectrometers

Ontdek LAESI-massaspectrometrie voor moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms onder atmosferische druk. Deze methode analyseert monsters direct zonder voorbehandeling.

Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Meer video's verkennen