Name: Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Leer dubbele fluorescentie in situ hybridisatie voor neurobiologisch onderzoek met verse hersensneden. Deze methode detecteert twee mRNA-transcripten tegelijkertijd op enkelcelresolutie in vertebraat hersenweefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk ondersteund door subsidies van het NIH / NIDCD, toont en de Schmitt Stichting RP.

Dit protocol is ontwikkeld en verfijnd op basis van standaard radioactief en niet-radioactieve in-situ hybridisatie methoden, die eerder door ons ontwikkelde en anderen om een of twee transcript soorten op te sporen in het hersenweefsel 1-7. Het protocol hieronder beschreven heeft een totale lengte van 2 of 3 dagen, afhankelijk van het aantal procedurele onderbrekingen gekozen door de eindgebruiker. Alle stappen hieronder weergegeven dienen te worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, met uitzondering van de riboprobe hybridisatie stap en post-hybridisatie wast. De oplossingen en buffers die nodig zijn voor alle stappen die betrokken zijn bij deze methode is te vinden op het einde van dit protocol. 1. Tissue Voorbereiding en snijden <ol><li> Onthoofden en snel extract onder voorbehoud van de hersenen, en plaats deze in een plastic mal van voldoende grootte. </li><li> Bedek hersenen met Tissue-Tek inbedding medium en snel de plastic mal plaats in een dry-ice/alcohol bad voor een snelle invriezen. Bevroren weefsel kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Met behulp van een cryostaat, verzamelen 2 of 3 hersenen secties per slide op betalen Superfrost Plus dia's. Dikte van de rubrieken moeten gegevens worden 10 tot 12 micrometer. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. De voorbereiding van Sephadex G50 kolommen voor Probe Zuivering "Sephadex kolommen kunnen worden gekocht uit commerciële bronnen, echter, bieden wij onder een low-cost alternatief voor het genereren van kolommen, die nodig zijn voor probe zuivering. <ol><li> Hydraat voldoende hoeveelheid Sephadex G50 poeder met RNase-vrij, DEPC behandeld water (bijvoorbeeld 2 g poeder in 100 ml DEPC behandelde water), meng-oplossing kort en bewaar bij kamertemperatuur voor het neerslaan van overtollige Sephadex G50. </li><li> Verwijder de bovendrijvende (bovenste laag van het water) naar aanleiding van Sephadex G50 neerslag. </li><li> Herhaal het proces boven de 3 - 5 keer. </li><li> Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de Sephadex G50-oplossing in TE-buffer (1:1-verhouding), en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Plaats geautoclaveerd glaswol in een steriele 1 ml spuit en deze comprimeren met de zuiger om een ​​compacte laag op de bodem te maken, en vervolgens de spuit te plaatsen in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Meng goed de oplossing van Sephadex G50 in TE. Vul de spuit / kolom met deze oplossing. </li><li> Centrifugeer de kolom gedurende 30 seconden bij 1000 tpm. </li><li> Herhaal deze procedure tot de kolom is bijna volledig gevuld met Sephadex G50 kralen. </li><li> Van toepassing zijn 200 ul van kolom wasbuffer de kolom en centrifugeer het voor 2 min bij 1000 rpm. Gooi flow-through. </li><li> Van toepassing zijn 200 ul van kolom blokkeerbuffer de kolom en spin het voor 2 min bij 1000 rpm. Herhaal deze stap 4-5 keer naar kolom evenwicht. Kolommen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik als afgesloten met Parafilm. </li></ol> 3. Etikettering en de zuivering van riboprobes Hieronder geven we detail het genereren en zuivering van een enkele riboprobe. Voor dFISH, zal de voorbereiding van elke probe te betrekken dezelfde methode, behalve dat een van de probes zal gelabeld worden met digoxigenine (DIG)-tagged UTP terwijl de andere met biotine-gelabeld UTP. <ol><li> Maak een geconcentreerde (&gt; 150 ng / ul) en gezuiverd gelineariseerde cDNA-oplossing van belang is voor zowel zin (controle) of antisense riboprobes genereren. </li><li> In een 1,5 ml microfugebuisje, voeg 0,5-1 ug van gezuiverd cDNA template, 2 pi van 5x sonde etikettering buffer, 1 ui 10X DIG (of biotine)-labeling mix, 0,5 pi RNasin en 1 ul van de juiste RNA-polymerase , en breng het uiteindelijke volume van de oplossing tot 10 ul met RNAse-vrij (DEPC behandeld) water. </li><li> Incubeer de oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Voeg 1 ui van tRNA (materieel; 20 pg / pl), en 39 ul van kolom blokkeerbuffer aan de oplossing. </li><li> Bereid de Sephadex G50 kolom voor probe zuivering. Te dien einde, voeg 50 ul blokkeerbuffer de kolom en spin deze voor 10 sec bij 1000 tpm. Herhaal deze stap 2-3 keer naar de kolom (dat wil zeggen, de volle 50 ul aangebracht op de kolom worden teruggewonnen na de cyclus van centrifugeren) evenwicht. </li><li> Breng de sonde oplossing voor de Sephadex G50 kolom, de positie van een nieuwe microfugebuis aan de onderkant van de kolom, en spin het voor 3 min bij 1000 rpm de gezuiverde 50 ul van riboprobe oplossing te verkrijgen. </li><li> Beoordeel de kwaliteit en opbrengst van gelabelde riboprobe met behulp van een standaard-formaldehyde-agarose RNA-gel, of een spectrofotometer. </li></ol> 4. Post-fixatie, acetylering en hybridisatie <ol><li> Verwijder secties van de -80 ° C vriezer en zorgen voor een kamertemperatuur van het evenwicht. Vervolgens incuberen secties in een koud, vers gemaakte 3% paraformaldehyde-oplossing gedurende 5 minuten. </li><li> Kort spoelen secties in phosphate gebufferde zoutoplossing (PBS) twee keer. </li><li> Uitdrogen delen via een standaard alcohol-serie (70, 95, en 100%, 2 minuten elk), en laat ze drogen aan de lucht. </li><li> Incubeer afdelingen in een acetylering oplossing gedurende 10 minuten. </li><li> Spoel secties 3 keer in 2X SSPE. </li><li> Uitdrogen secties opnieuw via de standaard alcohol-serie hierboven beschreven, en laat ze aan de lucht drogen. </li><li> Bereid een voldoende volume van de hybridisatie-oplossing en voeg beide riboprobes aan de oplossing (probe concentratie: 1 ng / ul voor elke probe). Totale volume van de hybridisatie-oplossing wordt bepaald op basis van het aantal secties worden gehybridiseerd (16 ul van hybridisatie-oplossing per sectie). </li><li> Van toepassing zijn voldoende volume van de hybridisatie-oplossing om weefsel en dekglaasje dia's ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen overlay het weefsel. </li><li> Plaats de glaasjes in een metalen houder. Dompel de houder in een minerale olie bad op 65 ° C gedurende de nacht. Zorg ervoor dat coverslips naar boven gericht zijn (dat wil zeggen, de laterale aspect van de dia houder moet in contact komen met de bodem van de minerale olie container). </li></ol> 5. Post-hybridisatie Wast <ol><li> De volgende dag, verwijder voorzichtig de diahouder van de minerale olie bad en spoel het kort in chloroform om overtollige olie te verwijderen uit de dia's. </li><li> Plaats de glaasjes in een 2X SSPE oplossing voor 5-10 minuten. Dekglaasjes moeten los te maken van dia's, terwijl in oplossing. </li><li> Overdracht van de dia's om een ​​nieuw 2X SSPE-oplossing, en bewaar ze voor 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Transfer secties in een oplossing met 2X SSPE plus 50% formamide. De temperatuur van deze oplossing moet overeenkomen met de temperatuur die in de nacht hybridisatie procedure. Houden dia's in deze oplossing voor de 1,5 uur. </li><li> Overdracht sectie om een ​​0.1X SSPE-oplossing voorverwarmd tot dezelfde temperatuur van de hybridisatie stap. Incubeer secties in deze oplossing gedurende 30 minuten. Herhaal deze stap voor een extra 30 minuten. </li></ol> 6. Detectie en visualisatie van riboprobes <ol><li> Overdracht dia's aan TNT buffer waaraan 0,3% waterstofperoxide is toegevoegd, gedurende 10 minuten. </li><li> Was secties in TNT buffer, 3 keer (10 minuten). </li><li> Met behulp van een DAKO pen, trek een goed rond het gebied met de hersenen secties. Belangrijk is, moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de onderdelen niet droog. </li><li> Van toepassing zijn 150 ul van TNB buffer aan elke dia, en incubeer secties in deze oplossing gedurende 30 min, in een vochtige kamer. </li><li> Verwijder het teveel TNB oplossing door het kantelen van dia's. </li><li> Van toepassing zijn 150 ul van TNB oplossing met peroxidase-geconjugeerd anti-DIG antilichaam, en op te slaan dia's in een vochtige kamer voor 2 uur. Antilichaamconcentratie moet individueel worden bepaald voor elk transcript van belang voorafgaand aan het uitvoeren van dFISH. </li><li> Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk. </li><li> Van toepassing zijn 150 ul van Alexa 594-geconjugeerde tyramide werkende oplossing voor elke dia, en bewaar ze in een vochtige kamer gedurende 1 uur. Deze oplossing moet worden bereid volgens de aanwijzingen van de fabrikant. </li><li> Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk. </li><li> Incubeer secties in TNT buffer om die 0,3% waterstofperoxide is toegevoegd voor 10 - 30 minuten. </li><li> Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk. </li><li> Van toepassing zijn 150 ul van TNB buffer per dia, en bewaar ze in een vochtige kamer gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder het teveel TNB oplossing door het kantelen van dia's. </li><li> Voeg 150 ul van TNB oplossing met peroxidase-geconjugeerd anti-biotine antilichaam, en op te slaan dia's in een vochtige kamer voor 2 uur. </li><li> Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk. </li><li> Van toepassing zijn 150 ul van een Alexa 488-geconjugeerde tyramide werkende oplossing om de dia's en incubeer secties voor 1 uur. Deze oplossing moet worden bereid volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Was secties in TNT buffer, 3 keer, 10 minuten per stuk. </li><li> Voeg 150 ul van Hoechst-oplossing (1:1000 in TNT buffer) aan de secties en bewaar ze in de vochtige kamer gedurende 2 minuten. </li><li> Was de secties in TNT buffer, 3 keer, 5 min per stuk. </li><li> Dekglaasje secties met een fluorescentie-compatibele montage medium (bv. Vectashield of verlengen antifade). </li></ol> 7. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. We laten hier vertegenwoordiger dFISH resultaten van de zebravink hersenen. Getoond zijn microfoto verkregen uit de caudomedial nidopallium (NCM), de zangvogel analogon van de zoogdieren auditieve cortex. Brain secties werden gehybridiseerd met een gebiotinyleerde riboprobe gericht tegen parvalbumin (A), een marker voor een subpopulatie van de remmende neuronen, en een DIG-gelabelde riboflaprobe gericht tegen de activiteit-afhankelijke gen Zenk (B), een betrouwbare marker voor lied-driven neuronen. C) Overlay van (A) en (B) toont een populatie van remmende neuronen die worden geactiveerd door auditieve ervaring. Pijlen en pijlpunten geven aan cellen uitsluitend gelabeld met elk van de twee riboprobes, en sterretjes zien vertegenwoordiger van neuronen die co-expressie beide transcripties van belang. Schaalbalk = 25 pm.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Wij hebben gebruik gemaakt van dit protocol te onderzoeken hoe de gewervelde hersenen neurochemisch en functioneel georganiseerd, en hoe gedragsmatig-relevante zintuiglijke prikkels invloed hebben op de genomische machinerie van neuronen in het volwassen brein 80-10 te bepalen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode in hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar verwachten dat dit protocol zal worden eenvoudig aan te passen aan de hersenen verkregen na een reeks van gewervelde soorten ...

Oplossingen <ol><li> Column wassen buffer: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 ug / ul tRNA, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-behandeld water. </li><li> Column blokkerende buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-behandeld water. </li><li> TNT buffer: 60 ml van 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl en 1,8 ml van Triton X-100 in 600 ml DEPC-behandeld water. </li><li> TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 ng / ul BSA, 0,15 M NaCl en 3% Triton X-100 in DEPC-behandeld water. </li><li> TE-buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 en 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetylering oplossing: 2,7 ml van triethanolamine plus 0,5 ml azijnzuuranhydride in 200 ml DEPC-behandeld water. </li><li> Hybridisatie-oplossing: 50% formamide, 2x SSPE, 2 ug / ul tRNA, 1 ug / ul BSA en 1 ug / ul poly A in DEPC-behandeld water. Het moet 16 l per sectie. </li></ol>

dubbele fluorescentie in situ hybridisatie in fresh brain secties

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Hier beschrijven we een aangepaste versie van een dubbele fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (dFISH) methode geoptimaliseerd voor het detecteren van twee mRNA&#39;s van de interesse in vriesverse hersenen secties. Onze groep heeft met succes gebruik gemaakt van deze aanpak van de gen co-regulering te bestuderen. Meer specifiek, hebben we gebruik gemaakt van deze dFISH methode om de anatomische organisatie, neurochemische eigenschappen en de impact van de zintuiglijke ervaring in het centrum van zintuiglijke circuits te verkennen, op enkele cel resolutie. Dit protocol is gevalideerd in het hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar zal naar verwachting worden eenvoudig aan te passen aan andere gewervelde diersoorten, alsmede op een array van niet-neurale weefsels. In deze film geven we een gedetailleerde demonstratie van de belangrijkste stappen van deze procedure.

Dit protocol betreft een niet-radioactieve<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisatie procedure dat de gelijktijdige identificatie van twee transcript soorten mogelijk maakt, op een enkele cel resolutie, in dunne delen van de gewervelde hersenen.

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Hier beschrijven wij een aangepaste versie van een methode voor dubbele fluorescentie in situ hybridisatie (dFISH), geoptimaliseerd voor het detecteren van twee mRNA's van belang in verse ...

Hallo, ik ben JA, postdoctoral research associate bij AL helping laboratory aan de University of Rochester. We zullen u de Process Institute hybride digestie in vers bevroren hersensecties laten zien om twee MRN-transcripten gelijktijdig te detecteren met een resolutie op enkelcelniveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals praktijkvragen met betrekking tot de anatomische, functionele, moleculaire en neurochemische organisatie van een specifiek hersencircuit.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in gen-coagulatie in neuronen van het AV-brein, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals knaagdieren, evenals op verschillende soorten neurale weefsels. Om deze procedure te starten, hydrateert u een adequate hoeveelheid SDX G 50-poeder met RNA's via water.Meng de oplossing kort en bewaar deze twee tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Deze stap scheidt de SDX-beads van de dextrose in commercieel sedex-poeder na de Sedex G 50-precipitatie. Verwijder het supernatant en herhaal dit proces drie tot vijf keer. Suspendeer na de laatste wasbeurt de SX G 50-oplossing opnieuw in TE-buffer met een verhouding van één-op-één buffer ten opzichte van het bead-volume en bewaar deze bij 4 °C tot gebruik.Bereid vervolgens de kolommen voor. Plaats geautoclaveerde glaswol in een steriele spuit van 1 milliliter en druk dit met de zuiger samen om een compacte laag aan de onderkant te vormen. Plaats de spuit daarna in een falconbuis van 15 milliliter.Vul de kolommen met Sedex G 50-oplossing door te centrifugeren bij 1000 toeren per minuut gedurende 30 seconden met een Beckman-centrifuge voorzien van een C 0 6 5 0 vaste hoekrotor. Was na centrifugatie elke kolom door 200 microliters kolomwasbuffer toe te voegen en twee minuten te centrifugeren bij 1000 toeren per minuut.Zoals voorheen. Breng tot slot 200 µL kolomblokkeringsbuffer aan op elke kolom en centrifugeer twee minuten bij 1000 rpm. Herhaal deze stap vier tot vijf keer om de kolom te equilibreren.Bewaar de voorbereide kolommen bij 4 °C totdat de riboprobe is gelabeld en gereed is voor zuivering voor de dubbele fluorescentie in situ hybridisatie of D-FISH procedure die hier wordt getoond. Er worden twee RNA-probes voorbereid, één gelabeld met digoxigenine (DIG) en de andere metbiotine. Start het labelen van de probes door de labelingsoplossingen voor de riboprobe voor te bereiden en de labelingsreacties twee uur lang te incuberen in een waterbad bij 37 °C. Voeg aan het einde van de incubatie van twee uur 1 µL tRNA van 20 µg/µL en 39 µL kolomblokkeringsbuffer toe aan elke labelingsreactie.Bereid vervolgens de EDEX G 50-kolommen voor op probe-zuivering door 50 µL blokkeringsbuffer aan elke kolom toe te voegen en drie minuten te centrifugeren bij 2000 rpm. Herhaal deze stap twee tot drie keer om de kolommen te equilibreren. Wanneer de kolommen gereed zijn, plaats dan een nieuwe EEND orph-buis onderaan de kolom.Breng de probe-oplossing aan op de Sedex G 50-kolom en centrifugeer gedurende drie minuten bij 2000 toeren per minuut. Om de gezuiverde 50 µL Ribo probe-oplossing te verkrijgen, dient de kwaliteit en opbrengst van de gelabelde en gezuiverde ribo probe te worden beoordeeld. Voordat u overgaat tot hybridisatie met behulp van een cryostaat, verzamelt u twee of drie hersensecties op charge super frost plus objectglazen.De dikte van het coupes moet 10 tot 12 microns zijn. De objectglazen kunnen tot aan het gebruik worden bewaard bij minus 80 °C. Incubeer de coupes gedurende vijf minuten in een koud, vers bereid 3% paraformaldehyde-oplossing.Spoel de coupes vervolgens kort twee keer met PBS. Dehydrateer de coupes daarna via een standaard alcoholserie van 70, 95 en 100% ethanol-oplossingen gedurende twee minuten per oplossing. Incubeer de coupes na de dehydratie gedurende 10 minuten in vers bereide acetyleringsoplossing.Spoel de coupes vervolgens drie keer met 2× SSPE en dehydrateer de coupes na acetylering opnieuw via de standaard alcoholserie zoals zojuist getoond. Start nu de hybridisatie met de ribo-probe. Breng een adequaat volume van de hybridisatie-oplossing aan op het weefsel, dek de objectglazen af met dekglasjes en plaats de objectglazen in een metalen objectglashouder.Dompel de houder gedurende de nacht onder in een bad met minerale olie bij 65 °C. De volgende dag: verwijder de objectglashouder voorzichtig uit het bad met minerale olie en spoel deze kort af met chloroform om overtollige olie van de objectglazen te verwijderen.Plaats de objectglazen gedurende vijf tot 10 minuten in een 2× SSPE-oplossing om het dekglas te verwijderen. Breng de objectglazen na het verwijderen van het dekglas over naar een nieuwe 2× SSPE-oplossing en bewaar ze gedurende één uur bij kamertemperatuur; warm aan het begin van deze incubatiestap een oplossing van 2× SSPE plus 50% formamide voor tot dezelfde temperatuur als bij de hybridisatiestap. Aan het einde van de incubatie van één uur.Breng de objectglazen over naar de voorverwarmde 2× SSPE-oplossing voor maide en incubeer gedurende 1,5 uur. Verwarm aan het begin van deze incubatiestap een 0,1× SSPE-oplossing voor tot dezelfde temperatuur als bij de hybridisatiestap. Voltooi de wasstappen na de hybridisatie door de objectglazen over te brengen naar de VOORVERWARMDE 0,1× SSPE-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten.Herhaal deze wasstap één keer. De hersendoorsneden zijn nu gereed voor de detectie en visualisatie van de gehybridiseerde riboprobes. Voeg 0,3% waterstofperoxide toe aan de TNT-buffer en incubeer de coupes gedurende 10 minuten in deze oplossing. Was de coupes vervolgens drie keer gedurende telkens 10 minuten in TNT-buffer met behulp van een deco pen.Teken een ring rond het gebied met de hersensecties. Breng 150 µL TNB-buffer aan op elk objectglas en incubeer de secties gedurende 30 minuten in deze oplossing. Zorg ervoor dat de secties tijdens deze stap niet uitdrogen.Breng vervolgens 150 µL TT NB-oplossing aan die geconjugeerd peroxidase anti-DIG-antilichaam bevat en bewaar de coupes twee uur in een vochtige kamer. Was de coupes aan het einde van de incubatie van twee uur drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Breng elke keer 150 µL Alexa 5 9 4-geconjugeerde T IDE-werkoplossing aan op elke coupe en bewaar de coupes gedurende één uur in een vochtige kamer.Was na één uur de coupes drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Incubeer de coupes telkens 10 tot 30 minuten in een oplossing van 0,3% waterstofperoxide in TNT-buffer. De incubatietijd in de waterstofperoxide-oplossing is afhankelijk van de mRNA-overvloed en dient voorafgaand aan de DISH te worden getest.Was de coupes vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Breng 150 µL TMB-buffer per objectglas aan en bewaar de objectglazen gedurende 30 minuten in een vochtkamer. Verwijder het overtollige TMB-oplossing door de objectglazen te kantelen.Voeg 150 µL TMB-oplossing toe die geconjugeerd is met peroxidase-geconjugeerd anine-antilichaam en bewaar de coupes gedurende twee uur in een vochtkamer. Was de secties vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Breng telkens 150 µL van een Alexa 488-geconjugeerde mite-werkoplossing aan op de coupes en incubeer de secties gedurende één uur.Was de coupes vervolgens drie keer gedurende 10 minuten per keer in TNT-buffer. Nu beide riboprobes zijn gelabeld met antilichamen, worden de coupes twee minuten geïncubeerd in 150 µL gastoplossing. Was de coupes daarna drie keer gedurende vijf minuten per keer in TNT-buffer, voeg een fluorescentie-compatibel monteermedium zoals Vector Shield of Prolong Antifade toe aan de coupes, dek ze af met een dekglas en observeer ze onder een fluorescentiemicroscoop.Deze representatieve fotomicrografieën zijn afkomstig van een D-visexperiment met hersensecties van zebravinken, specifiek uit de NCM-regio, het analogon van de auditieve cortex van zoogdieren bij zangvogels. Hersensecties werden gehybrideerd met twee probes: een gebiotineerde riboprobe gericht tegen par albumin, een marker voor een subpopulatie inhiberende neuronen, en een DIG-gelabelde riboprobe gericht tegen het activiteitsafhankelijke gen zinc, een betrouwbare marker voor zanggestuurde neuronen. Een overlay van de twee afbeeldingen toont een celpopulatie van inhiberende neuronen die worden geactiveerd door auditieve ervaring.Pijlpunten geven cellen aan die uitsluitend zijn gelabeld met de riboprobe voor par. Pijlen voor albumine geven cellen aan die uitsluitend zijn gelabeld met de RIBA-probe voor zink, representatieve neuronen. Coex die beide transcripten van belang tot expressie brengen, zijn gemarkeerd met een asterisk. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u uw werkbank schoon moet houden en nucleasevrije oplossingen, plastics en glaswerk moet gebruiken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gelijktijdig twee MA-soorten kunt detecteren met een resolutie van een enkele cel in vers bevroren hersensecties, om gen-coregulatie in de hersenen van de rat te bestuderen. Bedankt voor het bekijken van de video. Veel succes met uw experimenten.

double-fluorescence-in-situ-hybridization-in-fresh-brain-sections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal...

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

Source: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of mRNA within cholinergic axons in fixed mouse hippocampal slices using fluorescent in situ hybridization and antibody staining. Fluorescence microscopy reveals the spatial localization of probe-tagged mRNAs and choline acetyltransferase in cholinergic neurons.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Leer dubbele fluorescentie in situ hybridisatie voor neurobiologisch onderzoek met verse hersensneden. Deze methode detecteert twee mRNA-transcripten tegelijkertijd op enkelcelresolutie in vertebraat hersenweefsel.

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Meer video's verkennen