Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties
14 augustus 2010
Dit protocol betreft een niet-radioactieve In-situ Hybridisatie procedure dat de gelijktijdige identificatie van twee transcript soorten mogelijk maakt, op een enkele cel resolutie, in dunne delen van de gewervelde hersenen.
Hallo, ik ben JA, postdoctoral research associate bij AL helping laboratory aan de University of Rochester. We zullen u de Process Institute hybride digestie in vers bevroren hersensecties laten zien om twee MRN-transcripten gelijktijdig te detecteren met een resolutie op enkelcelniveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals praktijkvragen met betrekking tot de anatomische, functionele, moleculaire en neurochemische organisatie van een specifiek hersencircuit.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in gen-coagulatie in neuronen van het AV-brein, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals knaagdieren, evenals op verschillende soorten neurale weefsels. Om deze procedure te starten, hydrateert u een adequate hoeveelheid SDX G 50-poeder met RNA's via water.
Meng de oplossing kort en bewaar deze twee tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Deze stap scheidt de SDX-beads van de dextrose in commercieel sedex-poeder na de Sedex G 50-precipitatie. Verwijder het supernatant en herhaal dit proces drie tot vijf keer. Suspendeer na de laatste wasbeurt de SX G 50-oplossing opnieuw in TE-buffer met een verhouding van één-op-één buffer ten opzichte van het bead-volume en bewaar deze bij 4 °C tot gebruik.
Bereid vervolgens de kolommen voor. Plaats geautoclaveerde glaswol in een steriele spuit van 1 milliliter en druk dit met de zuiger samen om een compacte laag aan de onderkant te vormen. Plaats de spuit daarna in een falconbuis van 15 milliliter.
Vul de kolommen met Sedex G 50-oplossing door te centrifugeren bij 1000 toeren per minuut gedurende 30 seconden met een Beckman-centrifuge voorzien van een C 0 6 5 0 vaste hoekrotor. Was na centrifugatie elke kolom door 200 microliters kolomwasbuffer toe te voegen en twee minuten te centrifugeren bij 1000 toeren per minuut.
Zoals voorheen. Breng tot slot 200 µL kolomblokkeringsbuffer aan op elke kolom en centrifugeer twee minuten bij 1000 rpm. Herhaal deze stap vier tot vijf keer om de kolom te equilibreren.
Bewaar de voorbereide kolommen bij 4 °C totdat de riboprobe is gelabeld en gereed is voor zuivering voor de dubbele fluorescentie in situ hybridisatie of D-FISH procedure die hier wordt getoond. Er worden twee RNA-probes voorbereid, één gelabeld met digoxigenine (DIG) en de andere metbiotine. Start het labelen van de probes door de labelingsoplossingen voor de riboprobe voor te bereiden en de labelingsreacties twee uur lang te incuberen in een waterbad bij 37 °C. Voeg aan het einde van de incubatie van twee uur 1 µL tRNA van 20 µg/µL en 39 µL kolomblokkeringsbuffer toe aan elke labelingsreactie.
Bereid vervolgens de EDEX G 50-kolommen voor op probe-zuivering door 50 µL blokkeringsbuffer aan elke kolom toe te voegen en drie minuten te centrifugeren bij 2000 rpm. Herhaal deze stap twee tot drie keer om de kolommen te equilibreren. Wanneer de kolommen gereed zijn, plaats dan een nieuwe EEND orph-buis onderaan de kolom.
Breng de probe-oplossing aan op de Sedex G 50-kolom en centrifugeer gedurende drie minuten bij 2000 toeren per minuut. Om de gezuiverde 50 µL Ribo probe-oplossing te verkrijgen, dient de kwaliteit en opbrengst van de gelabelde en gezuiverde ribo probe te worden beoordeeld. Voordat u overgaat tot hybridisatie met behulp van een cryostaat, verzamelt u twee of drie hersensecties op charge super frost plus objectglazen.
De dikte van het coupes moet 10 tot 12 microns zijn. De objectglazen kunnen tot aan het gebruik worden bewaard bij minus 80 °C. Incubeer de coupes gedurende vijf minuten in een koud, vers bereid 3% paraformaldehyde-oplossing.
Spoel de coupes vervolgens kort twee keer met PBS. Dehydrateer de coupes daarna via een standaard alcoholserie van 70, 95 en 100% ethanol-oplossingen gedurende twee minuten per oplossing. Incubeer de coupes na de dehydratie gedurende 10 minuten in vers bereide acetyleringsoplossing.
Spoel de coupes vervolgens drie keer met 2× SSPE en dehydrateer de coupes na acetylering opnieuw via de standaard alcoholserie zoals zojuist getoond. Start nu de hybridisatie met de ribo-probe. Breng een adequaat volume van de hybridisatie-oplossing aan op het weefsel, dek de objectglazen af met dekglasjes en plaats de objectglazen in een metalen objectglashouder.
Dompel de houder gedurende de nacht onder in een bad met minerale olie bij 65 °C. De volgende dag: verwijder de objectglashouder voorzichtig uit het bad met minerale olie en spoel deze kort af met chloroform om overtollige olie van de objectglazen te verwijderen.
Plaats de objectglazen gedurende vijf tot 10 minuten in een 2× SSPE-oplossing om het dekglas te verwijderen. Breng de objectglazen na het verwijderen van het dekglas over naar een nieuwe 2× SSPE-oplossing en bewaar ze gedurende één uur bij kamertemperatuur; warm aan het begin van deze incubatiestap een oplossing van 2× SSPE plus 50% formamide voor tot dezelfde temperatuur als bij de hybridisatiestap. Aan het einde van de incubatie van één uur.
Breng de objectglazen over naar de voorverwarmde 2× SSPE-oplossing voor maide en incubeer gedurende 1,5 uur. Verwarm aan het begin van deze incubatiestap een 0,1× SSPE-oplossing voor tot dezelfde temperatuur als bij de hybridisatiestap. Voltooi de wasstappen na de hybridisatie door de objectglazen over te brengen naar de VOORVERWARMDE 0,1× SSPE-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten.
Herhaal deze wasstap één keer. De hersendoorsneden zijn nu gereed voor de detectie en visualisatie van de gehybridiseerde riboprobes. Voeg 0,3% waterstofperoxide toe aan de TNT-buffer en incubeer de coupes gedurende 10 minuten in deze oplossing. Was de coupes vervolgens drie keer gedurende telkens 10 minuten in TNT-buffer met behulp van een deco pen.
Teken een ring rond het gebied met de hersensecties. Breng 150 µL TNB-buffer aan op elk objectglas en incubeer de secties gedurende 30 minuten in deze oplossing. Zorg ervoor dat de secties tijdens deze stap niet uitdrogen.
Breng vervolgens 150 µL TT NB-oplossing aan die geconjugeerd peroxidase anti-DIG-antilichaam bevat en bewaar de coupes twee uur in een vochtige kamer. Was de coupes aan het einde van de incubatie van twee uur drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Breng elke keer 150 µL Alexa 5 9 4-geconjugeerde T IDE-werkoplossing aan op elke coupe en bewaar de coupes gedurende één uur in een vochtige kamer.
Was na één uur de coupes drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Incubeer de coupes telkens 10 tot 30 minuten in een oplossing van 0,3% waterstofperoxide in TNT-buffer. De incubatietijd in de waterstofperoxide-oplossing is afhankelijk van de mRNA-overvloed en dient voorafgaand aan de DISH te worden getest.
Was de coupes vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Breng 150 µL TMB-buffer per objectglas aan en bewaar de objectglazen gedurende 30 minuten in een vochtkamer. Verwijder het overtollige TMB-oplossing door de objectglazen te kantelen.
Voeg 150 µL TMB-oplossing toe die geconjugeerd is met peroxidase-geconjugeerd anine-antilichaam en bewaar de coupes gedurende twee uur in een vochtkamer. Was de secties vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in TNT-buffer. Breng telkens 150 µL van een Alexa 488-geconjugeerde mite-werkoplossing aan op de coupes en incubeer de secties gedurende één uur.
Was de coupes vervolgens drie keer gedurende 10 minuten per keer in TNT-buffer. Nu beide riboprobes zijn gelabeld met antilichamen, worden de coupes twee minuten geïncubeerd in 150 µL gastoplossing. Was de coupes daarna drie keer gedurende vijf minuten per keer in TNT-buffer, voeg een fluorescentie-compatibel monteermedium zoals Vector Shield of Prolong Antifade toe aan de coupes, dek ze af met een dekglas en observeer ze onder een fluorescentiemicroscoop.
Deze representatieve fotomicrografieën zijn afkomstig van een D-visexperiment met hersensecties van zebravinken, specifiek uit de NCM-regio, het analogon van de auditieve cortex van zoogdieren bij zangvogels. Hersensecties werden gehybrideerd met twee probes: een gebiotineerde riboprobe gericht tegen par albumin, een marker voor een subpopulatie inhiberende neuronen, en een DIG-gelabelde riboprobe gericht tegen het activiteitsafhankelijke gen zinc, een betrouwbare marker voor zanggestuurde neuronen. Een overlay van de twee afbeeldingen toont een celpopulatie van inhiberende neuronen die worden geactiveerd door auditieve ervaring.
Pijlpunten geven cellen aan die uitsluitend zijn gelabeld met de riboprobe voor par. Pijlen voor albumine geven cellen aan die uitsluitend zijn gelabeld met de RIBA-probe voor zink, representatieve neuronen. Coex die beide transcripten van belang tot expressie brengen, zijn gemarkeerd met een asterisk. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u uw werkbank schoon moet houden en nucleasevrije oplossingen, plastics en glaswerk moet gebruiken.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gelijktijdig twee MA-soorten kunt detecteren met een resolutie van een enkele cel in vers bevroren hersensecties, om gen-coregulatie in de hersenen van de rat te bestuderen. Bedankt voor het bekijken van de video. Veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve in-situ hybridisatieprocedure waarmee twee transcriptsoorten gelijktijdig kunnen worden geïdentificeerd, met een resolutie op enkelcelniveau, in dunne coupes van het vertebratenbrein. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot de anatomische, functionele, moleculaire en neurochemische organisatie van hersencircuits.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genexpressieanalyse
- In-situ hybridisatietechnieken
Achtergrond
- Deze methode maakt de detectie van meerdere transcripten in één enkel experiment mogelijk.
- Het kan worden toegepast op diverse neurale weefsels, waaronder weefsels van knaagdieren.
- Het begrijpen van genexpressie in neuronen is essentieel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- De techniek biedt inzicht in de moleculaire organisatie van hersencircuits.
Doel van de studie
- Om gelijktijdig twee mRNA-transcripten in hersendoorsneden aan te tonen.
- Om genregulatie in specifieke neuronale populaties te onderzoeken.
- Om het begrip van de functionele organisatie van de hersenen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Niet-radioactieve in-situ hybridisatieprocedure.
- Bereiding van vers bevroren hersensecties.
- Simultane hybride digestie van transcripten.
- Visualisatie van transcripten met resolutie op enkelcelniveau.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van twee transcriptsoorten in hersensecties.
- De toepasbaarheid van de methode op diverse neurale weefsels is aangetoond.
- Inzichten verschaft in genexpressiepatronen in neuronen.
- Bijgedragen aan het begrip van de moleculaire basis van de hersenfunctie.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van genexpressie in de hersenen.
- Het kan worden toegepast in diverse onderzoekcontexten binnen de neurowetenschappen.
- Deze methode verbetert het vermogen om complexe neurale circuits te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze dFISH-methode maakt de gelijktijdige detectie van twee mRNA-transcripten op enkelcelresolutie mogelijk in vers ingevroren hersencoupes, wat mechanistische risicoanalyse bij doelwitvalidatie ondersteunt door co-regulatiepatronen van genen in gedefinieerde neuronale populaties te onthullen. De aanpak biedt voorspellende zekerheid voor downstream-assays door ruimtelijke en functionele relaties tussen transcripten in sensorische circuits vast te stellen, wat hypothese-gedreven screeningsstrategieën informeert. De aanpasbaarheid over gewervelde diersoorten en niet-neurale weefsels verbetert de translationele continuïteit en het hergebruik van het platform in discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de co-expressie van markergenen (bijv. par albumine en zink) te visualiseren in inhiberende neuronen die zijn geactiveerd door zintuiglijke ervaringen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe observatie van de ruimtelijke relaties van transcripten in vers ingevroren weefsel, waardoor de afhankelijkheid van indirecte gevolgtrekkingen wordt verminderd.
- Strategische waarde: Ondersteunt portfolio-triage door data op single-cell resolutie te leveren over neurochemische en activiteitsafhankelijke genexpressie in ziekterelevante circuits.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door de probe-specificiteit en hybridisatie-efficiëntie in hersendoorsneden te bevestigen.
- Operationele waarde: Richt zich op de standaardisatie en reproduceerbaarheid van de assay via geoptimaliseerde probe-labeling, zuivering en hybridisatiestappen met behulp van Sedex G 50-kolommen en gecontroleerde buffercondities.
- Strategische waarde: Benadrukt de screeningbereidheid en het hergebruik van het platform door de toepasbaarheid bij muizen, ratten en zangvogels aan te tonen, met een verwachte uitbreiding naar andere gewervelde diersoorten en niet-neurale weefsels.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door exploratie van de anatomische organisatie en neurochemische eigenschappen in centrale sensorische circuits, waarbij gen-coregulatie wordt gekoppeld aan functionele uitkomsten.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale analyse mogelijk te maken van de impact van sensorische ervaringen op genexpressie in hetzelfde weefselformaat.
- Strategische waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicovermindering door mechanistische inzichten te verschaffen in hoe sensorische stimuli transcriptionele programma's in gedefinieerde neuronale subtypen veranderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van Early Discovery tot Lead Identification, en ondersteunt het testen van hypothesen en de verduidelijking van signaalpaden in neurobiologische targets voorafgaand aan de compound screening.
- Discoverybiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing ondersteunt door co-gereguleerde transcripten (bijv. activiteitsafhankelijk zink en de remmende neuronmarker paralbumine) te detecteren als reactie op sensorische ervaringen.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via reproduceerbare stappen voor probe-zuivering en hybridisatie die kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen op single-cell resolutie opleveren.
- Analytica: Benadrukt metingen zoals fluorescentiesignaalintensiteit en co-lokalisatiepatronen (bijv. met een asterisk gemarkeerde co-expresserende cellen) die vergelijking van condities tussen experimentele groepen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door de toepasbaarheid aan te tonen in vers ingevroren hersensecties van meerdere soorten, wat cross-species validatie van target engagement ondersteunt.
- Hergebruik in de praktijk: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, gezien de aanpasbaarheid aan diverse neurale en niet-neurale weefsels en de gestandaardiseerde kolomgebaseerde workflow voor probe-zuivering.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in studies naar gen-coregulatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door kolomgebaseerde zuivering van probes en gedefinieerde hybridisatie-/wasbuffers.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologisch risico in een laat stadium door co-expressiepatronen van targets vroeg in de ontdekkingsfase te bevestigen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van ruimtelijk opgeloste transcriptgegevens in ziekterelateerde hersencircuits.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in moleculaire histologie, sonde-labeling en fluorescentiemicroscopie.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een cryostaat, centrifuge, mineraaloliebad en fluorescentiemicroscoop met passende filtersets.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de preparatie van sondes, hybridisatiecondities en drempelwaarden voor signaaldetectie.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, inclusief aanpassingen voor weefseldikte, permeabilisatie en hybridisatietijd op basis van soort en target-abundantie.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: de incubatietijd van waterstofperoxide moet vóór DISH empirisch worden getest op basis van de mRNA-abundantie om over- of onderdetectie te voorkomen.
