Name: De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Leer hoe je organotypische hippocampus-sliceculturen genereert om neuronale letsels te modelleren met behulp van rattenhersenen. Deze methode behoudt de hippocampusarchitectuur en kwantificeert celdood in CA1, CA3 en dentate gebieden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefinancierd door NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

1. Voorbereiding Voordat u begint, verzamelen de benodigde chirurgische instrumenten, dissectie en cultuur media, en 7 dagen oude rat of muis pups. Het protocol is hetzelfde voor muis en rat preparaten. (I) materialen en apparatuur <ul><li> Operating schaar (rechte lengte 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro ontleden schaar, (lengte 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Koolstofstaal Dumont pincet (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Gewijzigd glas "overdracht" pipetten (onderkant van Pasteur pipet verwijderd en de rand glad) </li><li> Aclar plastic folie gesneden om 2 "in x 2" in vierkanten (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Cover sponzen 4 door 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 mm Millicell membraan inserts (0,4 micrometer, Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain Tissue chopper met tweesnijdende scheermesje (McILwain weefsel chopper, Vibratome Company, St. Louis, MO) </li><li> Omgekeerde microscoop met CCD-camera en beeldanalyse-software </li></ul> (Ii) Dissection Medium (DM, 1 liter bij een pH van 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Balanced Salt Hank's </td><td> 1 injectieflacon (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mm) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mm) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glucose (33,3 mm) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine (100x) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) Cultuur medium (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> *** Hank's Balance Salt (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Paard serum (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES buffer (een M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Voeg 12,8 g glucose naar Balance 500 ml Hank's Salt alvorens kweekmedium </td></tr></tbody></table> (Iv) Dieren 7 dagen oude rat of muis postnatale pups, meestal een nest per experiment. 2. Op de Dag van de Cultuur <ol><li> Alle dissectie werktuigen en Aclar film moet worden geweekt in 70% EtOH gedurende 30 minuten voordat u begint. Het oppervlak van de dissectie motorkap, blad, en weefsel chopper moeten worden gedesinfecteerd met ethanol. </li><li> Bereid een aantal (3-4) 6 well kultuur platen, voeg 1 ml kweekmedium per goed, en plaats een Millipore permeabel membraan in elk putje. Plaats 6-well platen in de 37 ° incubator pas klaar om plakjes te dragen. </li><li> Bereid een aantal (4-6) 60 mm platen met DM en leg ze op ijs. </li><li> Snel onthoofden met een schaar en duik in 70% EtOH, en snel de hersenen bloot te leggen met een saggital insnijding van de schedel. Voorzichtig onmiddellijk verwijderen van de hersenen en de plaats in koude DM. Scheiden in twee helften en leg elk halfrond mediale zijde naar beneden op een deksel spons voor 2-3 seconden. </li><li> Til en het halfrond plaats op de Aclar film plein en op het weefsel helikopter; coronaalwaarts snijd de hersenen in 350 micrometer secties. Wanneer u klaar bent, voorzichtig neem de Alcar plein met de doorsnede halfrond en onderdompelen in koud DM. </li><li> Met behulp van een dissectiemicroscoop, scheiden van de hippocampus secties. Voor de rat, moet er vijf secties verspreid over rostraal naar caudaal hippocampus, en voor de muis moeten er drie tot vier secties. </li><li> Haal de 6-well platen met membraan inserts uit de 37 ° weefselkweek incubator. Individueel overdracht hippocampale plakken op de doorlaatbare membranen met behulp van de glazen pipet overdracht. Als er te veel DM is losgelaten op het membraan, verwijder overtollige DM met een Pasteur pipet. Plaats vijf hippocampale plakken op elk membraan. Laat minstens 3 putten per aandoening, of 15 plakjes. </li><li> Incubeer de cultuur platen bij 37 ° in een 5% CO bevochtigde incubator voor 12-14 dagen voor het begin van de toxiciteit experiment. De cultuur medium kan twee keer per week worden gewijzigd. </li></ol> 3. Inducerende en kwantificeren van de hippocampus neuronen letsel bij Slice Cultuur <ol><li> Na 12-14 dagen in cultuur, voeg 5 ug / ml propidiumjodide (PI) aan de cultuur media. Deze stap zal visualisatie en kwantificatie van basale celdood. </li><li> De volgende dag, kwantificeren PIfluorescentie in het CA1 subregio (en / of CA3 of dentate indien gewenst) van elke plak hippocampus en het verkrijgen van: de PI-fluorescentie metingen die basale celdood (aangeduid als de tijd = 0 uur, of T 0). Voor het imago van acquisitie en kwantificering, gebruiken we Openlab software (Improvisation, VK), maar ook andere beeldacquisitie en analyse software kan worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit te kwantificeren. </li><li> Direct na het imago overname van T 0 PI fluorescentie, braken neuronale verwonding door je manier van keuze (we hebben gebruikt 10 uM NMDA, zuurstof-glucose ontbering, of LPS gedurende een uur tot 2,5 neuronale toxiciteit veroorzaken). Na de giftige stimulus, vervang medium met vers medium met 5 ug / ml PI en 's nachts te onderhouden plakjes. </li><li> Op dag 3, kwantificeren betekenen PI fluorescentie van de experimentele conditie bij 24 of T 24. </li><li> Na dit beeld overname, onmiddellijk verandering medium en voeg 10 uM NMDA en 5 ug / ml PI en incubeer plakken 's nachts om maximale neuronale dood te bereiken. </li><li> Op dag 4, kwantificeren betekenen PI fluorescentie van maximaal neuronale dood, gedefinieerd als T-max. Bereken procent celdood als volgt: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) Tijd lijn voor het genereren van de hippocampus en de daaropvolgende experimentele letsel en beeldacquisitie. (B) Representatieve beelden van de hippocampus plakken basaal (T 0), 24 uur na een 1 uur blootstelling aan 10 uM NMDA (T 24), en na nog eens 24 of 10 uM NMDA tot maximale neuronale verwonding (T max) te verkrijgen.

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Er zijn twee belangrijke punten om te volgen om reproduceerbare en consistente resultaten te waarborgen bij het repliceren van experimenten. Ten eerste is het belangrijk om de hippocampus plakken leeftijd verhuurd voor 12-14 dagen voor de experimenten. Met slice isolement, is er een significant microgliale reactie, en microglia geactiveerd blijven voor enige tijd, met een terugkeer naar een rustplaats vertakte staat die zich per dag 10 in vitro 3,6. Ten tweede, de gemiddelde PI fluorescentie-intensit...

de organotypische hippocampus slice cultuur model is voor de behandeling neuronale letsel

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypische hippocampale slice cultuur is een in vitro methode om de mechanismen van de neuronale schade in de basisarchitectuur en samenstelling van de hippocampus relatief behouden blijft een te onderzoeken. Het organotypische cultuur systeem maakt het mogelijk voor het onderzoek van neuronale, astrocytaire en microgliale effecten, maar als een ex vivo voorbereiding, wordt niet ingegaan op effecten van de bloedstroom, of aanwerving van perifere inflammatoire cellen. Te dien einde, is deze cultuur methode vaak gebruikt om excitotoxisch en hypoxische schade aan piramidale neuronen van de hippocampus te onderzoeken, maar is ook gebruikt om de ontstekingsreactie te onderzoeken. Hierin beschrijven we de methoden voor het genereren van de hippocampus slice culturen van postnatale knaagdieren hersenen, het toedienen van giftige stimuli om neuronale letsel veroorzaken, en het testen en kwantificeren van hippocampale neuronale dood.

De organoptypic hippocampus slice cultuur-model is een<em&gt; In vitro</em&gt; Model gebruikt om de neuronale verwonding in een verscheidenheid van paradigma te onderzoeken. In dit artikel beschrijven we de methoden voor het genereren van slice culturen en kwantificeren van neuronale verwonding.

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

Organotypische hippocampus-slicecultuur is een in vitro methode om mechanismen van neuronale beschadiging te onderzoeken, waarbij de basisarchitectuur en samenstelling van ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van organotypische hippocampusculturen van coupes, die gebruikt kunnen worden om neuronale schade te modelleren in reactie op diverse stimuli, waaronder NMDA, excitotoxiciteit, zuurstof- of glucosedeprivatie, of inflammatoire stimuli zoals lipopolysaccharide of amyloïde bèta-peptide. Dit wordt bereikt door eerst de postnatale hersenen te isoleren en elk hemisfeer in plakjes te snijden om coronale coupes te verkrijgen. De tweede stap van de procedure is het isoleren van de hippocampusregio's en het cultiveren daarvan op membraaninserts in six-well platen. Na het cultiveren worden de coupes gekleurd met propidiumjodide en wordt het niveau van spontane neuronale dood berekend.Ten slotte worden de coupes behandeld met een neurotoxisch middel en opnieuw gekleurd om de toxiciteitsrespons op de behandeling te meten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het percentage neuronale dood in de CA1-, CA3- en gyrus dentatus-regio's van de hippocampus over verschillende experimentele condities laten zien, door kwantificatie van propidiumjodide-fluorescentie met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een primaire neuronencultuur, is dat het mechanisme van neuronale beschadiging wordt onderzocht in een preparaat waarin de basisarchitectuur van de hippocampus relatief intact is.En het derde type omvat lichaamsbeweging. Microglia en ROY worden behouden voordat de dissectie begint. Plaats in elke een permeabel millipore-membraan.Voeg één milliliter kweekmedium toe aan elke put van meerdere zes-puts weefselkweekplaten. Warm de platen op in een incubator bij 37 °C.Dompel de onthoofde kop van een rattenpup van één dag oud kort in 70% ethanol. Gebruik, na desinfectie, microsdissectiescharen om een sagittale incisie door de schedel te maken om de hersenen bloot te leggen. Gebruik een pincet om de hersenen snel te verwijderen en over te brengen naar een schaal van 60 millimeter met dissectiemedium op ijs.Gebruik een pincet om de hersenen in twee hemisferen te scheiden. Plaats elke hemisfeer met de mediale zijde naar beneden gedurende twee tot drie seconden op een droge absorptiespons om overtollig vocht te verwijderen. Verplaats de hersenen naar een vierkant stuk clar-folie en plaats deze op het platform van een weefselsnijmachine om coronale coupes van 350 micron te maken, beginnend bij de rostraal.En ga voorzichtig verder. Til het A clar vierkant zachtjes op en dompel de plakjes onder in een schoon schaaltje met ijskoud dissectiemedium. Identificeer onder een dissectiemicroscoop de hippocampus, een C-vormige structuur die onder de cerebrale cortex ligt, grenzend aan het striatum.Gebruik een pincet om de hippocampus uit elke coronale sectie te scheiden. Gebruik een Pasteur-pipet, aangepast zoals beschreven in de tekst, om vijf hippocampussnedes naar elk membraan over te brengen. Plaats deze in de voorbereide warme six-wellplaten.Verwijder alle overtollige medium van het oppervlak van het membraan. Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 12 tot 14 dagen. Vervang het medium, zoals beschreven in de bijbehorende tekst, na 12 tot 14 dagen in cultuur, en voeg vijf µg/mL propidiumjodide toe, afgekort als PI, om visualisatie en kwantificering van basale celdood mogelijk te maken.Incubeer de plakjes gedurende de nacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is aangesloten op een CCD-camera. Maak op dit tijdstip beelden van het plakje bij een 40x vergroting. Registreer de PI-fluorescentie die overeenkomt met de basale niveaus van celsterfte op tijdstip nul uur of T0, direct na de beeldvorming. Induceer neuronale beschadiging in de plakjes met de voor het huidige experiment geprefereerde methode.Hier worden de coupes gedurende één uur geïncubeerd met vers medium dat 10 µM NMDA bevat, bij 37 °C en 5% CO2. Vervang na de neurotoxische behandeling het medium door vers cultuurmedium dat 5 µg/mL pi bevat.Incubeer de plakjes overnacht bij 37 °C en 5% CO₂; afbeelding van de PI-fluorescentie na neurotoxische behandeling. De gemiddelde fluorescentiemetingen voor dit tijdstip vertegenwoordigen de niveaus van celdood. Na 24 uur experimentele beschadiging, of T 24 uur, vervang het medium onmiddellijk door vers kweekmedium dat 10 µM NMDA en 5 µg/mL bevat.Incubeer de coupes overnacht met PI bij 37 °C en 5% CO2 om maximale neuronale sterfte te bereiken. Leg de laatste set beelden van PI-fluorescentie vast; dit zijn de gemiddelde fluorescentiemetingen voor dit tijdstip. Dit vertegenwoordigt de maximale niveaus van celdood of Tmax.Kwantificeer de PI-fluorescentie in het interessegebied met behulp van beeldanalyse-software zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Dit is een representatieve afbeelding van PI-kleuring van basale neuronale dood in de ca1-regio van de hippocampus. Hier is een representatieve afbeelding van PI-gekleurde neuronale dood.24 uur na een behandeling van één uur met 10 micromolar NMDA is een intensere kleuring zichtbaar, wat duidt op een hogere mate van celdood. Deze afbeelding toont maximale PI-kleuring na een incubatie gedurende één nacht met 10 micromolar NMDA. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u organische hippocampus-coupes bereidt en hoe u de mate van neuronale schade meet.

the-organotypic-hippocampal-slice-culture-model-for-examining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan ​​om een ​​interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.

Organotypische hippocampus Slice culturen

This video demonstrates a method for preparing organotypic hippocampal slice cultures from the brain of a rat pup. It outlines the steps involved in the dissection of the hippocampus, slicing, and culture conditions required to promote cell viability and growth in the hippocampal slices, ultimately generating organotypic slice cultures.

Preparation of Organotypic Slice Cultures from a Rat Pup&#39;s Hippocampus

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Een protocol voor entorhino-hippocampus organotypische slice culturen, die het mogelijk maakt het reproduceren vele aspecten van ischemisch hersenletsel, wordt gepresenteerd. Door het bestuderen van veranderingen in de neurovasculatuur naast veranderingen in de neuronen, dit protocol is een veelzijdig gereedschap plastic veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging.

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Hier beschrijven we de bereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Onder een geleidelijke en gecontroleerde deprivatie van serum, deze plakken verbeelden evoluerende epileptische-achtige gebeurtenissen en kan worden beschouwd als een ex vivo model van epileptogenese. Dit systeem is een uitstekend hulpmiddel voor het monitoren van de dynamiek van spontane activiteit, evenals voor het beoordelen van de progressie van neuro-inflammatoire kenmerken gedurende de loop van...

Een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

Leer hoe je organotypische hippocampus-sliceculturen genereert om neuronale letsels te modelleren met behulp van rattenhersenen. Deze methode behoudt de hippocampusarchitectuur en kwantificeert celdood in CA1, CA3 en dentate gebieden.

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

Meer video's verkennen