Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering

Matrixgels geproduceerd uit gedecellulariseerd pericardiaal en myocardiaal weefsel behouden natuurlijke componenten van de extracellulaire matrix, waaronder diverse eiwitten, peptiden en glycosaminoglycanen. Deze weefselmatrixen kunnen worden gebruikt voor tissue engineering. In deze video worden matrixgels gefabriceerd door pericardiaal weefsel te decellulariseren om een acellulaire extracellulaire matrix te verkrijgen.

De extracellulaire matrix wordt vervolgens verwerkt om een gesolubiliseerde vloeibare versie te creëren. Vervolgens wordt de gesolubiliseerde matrix getest in een klein diermodel om de haalbaarheid als injecteerbaar steunstructuur (scaffold) te bepalen. Histologische en immunohistochemische analyses tonen aan dat het geïnjecteerde materiaal in vivo een poreuze fibreuze scaffold vormt die infiltratie van vasculaire cellen mogelijk maakt.

Hallo, mijn naam is Sonia Zeki. Ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Karen Chrisman aan de University of California San Diego. Vandaag gaan we gesolubiliseerde ECM fabriceren uit gedecellulariseerd weefsel en een in vivo-test demonstreren voor toepassingen in cardiac tissue engineering.

Deze technieken zijn belangrijk voor de ontwikkeling van een injecteerbare biomateriaaltherapie voor de behandeling van hartfalen. De chirurgische procedure na een myocardinfarct wordt gedemonstreerd door Pam, een veterinair neurochirurg in ons laboratorium. Laten we beginnen.

Begin dit protocol met het decellulariseren van het weefsel om alleen de extracellulaire matrix of ECM over te houden. Plaats eerst varkenspericard in een bekerglas met gedeïoniseerd water en was dit door 30 minuten lang bij kamertemperatuur te roeren. Plaats het weefsel na het wassen in 1x PBS met 1% SDS en 1% penicilline-streptomycine en roer dit gedurende 24 uur continu bij kamertemperatuur. Breng het weefsel de volgende dag terug in gedeïoniseerd water en roer vijf uur lang continu; schud een buis van 50 milliliter totdat al het schuim is verdwenen.

Kleuring met hematine en eosine moet de afwezigheid van kernen in gedecellulariseerd weefsel aantonen. Plaats het resterende gedecellulariseerde weefsel in een conische buis van 15 tot 50 milliliter. Plaats het weefsel vervolgens in de vriezer op -80 °C.

Lyofiliseer de bevroren monsters door middel van vriesdrogen onder zeer lage druk en zeer lage temperatuur tot ze volledig droog zijn. Afhankelijk van het gebruikte systeem en het watergehalte van de monsters kan dit 12 tot 72 uur duren. Zodra het gedecellulariseerde weefsel volledig droog is, wordt het overgebracht naar een Wiley Minim mill.

Maal het weefsel tot een fijn poeder met behulp van een zeef met een maaswijdte van 40 gauge. Zodra het grootste deel van het monster door het filter is gegaan, verwijdert u de opvangpot. Dit monster wordt vanaf nu aangeduid als extracellulaire matrix of ECM-poeder.

Op dit moment kan een tweede lyofilisatiestap worden uitgevoerd, indien men niet direct doorgaat naar de volgende stap. Dit waarborgt de nauwkeurigheid van het geregistreerde gewicht voor het solubiliseren van de ECM. Weeg de gewenste hoeveelheid ECM-poeder af in een steriel vloeistofvlakje.

Voeg steriel gefilterde waterstofchloride-oplossing toe met een concentratie van 1 mg/mL Pepcid aan het scintillatiebuisje met het ECM-poeder, zodanig dat de ECM-concentratie 10 mg/mL bedraagt. Voeg een roerstaafje toe en plaats het buisje op de roerplaat.

Roer continu gedurende 48 tot 60 uur en schraap periodiek de wanden van het vial schoon met een steriele WHE-lepel of spatel om volledige digestie van al het ECM-poeder te garanderen. Naarmate het ECM wordt gedigereerd, zal het in oplossing gaan.

Zodra de ECM is gesolubiliseerd, wordt het monster op ijs geplaatst en wordt de pH aangepast naar 7.4 met behulp van natriumhydroxide en zoutzuur. Nadat de pH is aangepast, wordt 10 keer PBS toegevoegd zodat de uiteindelijke zoutconcentratie van de oplossing 1 keer PBS is. Als u bijvoorbeeld 900 µL ECM-oplossing heeft, moeten er na de pH-aanpassingen 100 µL van 10 keer PBS worden toegevoegd.

Bepaal de concentratie van de gesolubiliseerde ECM-oplossing door de toegevoegde volumes voor neutralisatie en de verwijderde volumes voor de pH-meting bij elkaar op te tellen. Voeg vervolgens een volume PBS toe om de gewenste eindconcentratie te bereiken: 6 mg/mL.

Bereid op de dag van de operatie een injectie van 75 µL gesolubiliseerde ECM voor in een spuit van 0,1 mL met een naald van 30 gauge. Handhaaf de anesthesie van een geïntubeerde vrouwelijke Harlan dolly rat met 2,5% isofluraan. Sluit het oog, en verifieer vervolgens de anesthesie door een knijptest bij de teen uit te voeren.

Dien drie milliliters lactaatringeroplossing toe via een subcutane injectie in de onderbuik voor hydratatie. Plaats het dier vervolgens in rugligging op de operatietafel en plak de ledematen voorzichtig vast. Gebruik een trimmer om het haar op de buik te verwijderen en zuig de losse haren op.

Dien een reeks injecties van 50 µL 2% lidocaïne toe langs een diagonaal vanaf het xiphoïd-proces naar de rechteronderzijde van de buikwand. Scrub vervolgens drie keer met Betadine, beginnend in het midden en naar buiten toe bewegend. Herhaal het scrubben met isopropylalcohol.

Bedek het dier vervolgens met een steriel afdekdoek met een vooraf uitgesneden rond venster. Bevestig dit met een chirurgisch doek. Gebruik hiervoor een scalpel nr. 10.

Maak een incisie van drie tot vier centimeter vanaf het xiphoïd proces naar de rechteronderzijde van de buikwand. Lokaliseer het xiphoïd proces en ontleed verticaal naar beneden door de spier naar rechts, waarbij u voorzichtig bent om het grote vat aan de rechterzijde te vermijden. Gebruik vervolgens een schaar om lateraal door de spier te knippen, zodat het diafragma bloot komt te liggen.

Zorg ervoor dat de lever wordt vermeden met behulp van een 36 inch lange 3-0 Vicryl-hechtdraad en een paar hemostaten. Drijf één naald door het xiphoïd proces en trek de hechtdraad voor de helft door. Plak de uiteinden van de hechtdraad aan elkaar en bevestig deze op een punt boven en achter het dier, waarbij het xiphoïd omhoog wordt getild en het diafragma wordt blootgelegd met een andere 36 inch lange 3-0 Vicryl-hechtdraad.

Steek een naald door de spier die het dichtst bij het xiphoïdproces ligt en trek deze vervolgens door om het uiteinde aan een ander punt rechts van de operatietafel te bevestigen, zodat de chirurgische holte volledig is blootgesteld. Pak vervolgens met een klein rattentand micro-pincet het midden van het diafragma vast, trek dit naar buiten en maak een zeer kleine incisie met botte scharen. Zodra dit gat is gemaakt, zullen de longen zich terugtrekken.

Maak een verticale incisie van twee tot drie centimeter door het diafragma om het hart zichtbaar te maken. Steek vervolgens een wattenstaaf van drie inch aan de linkerzijde van de holte in en duw de longen opzij. Zet de wattenstaaf vast met een handdoekklem.

Verschuif met een ander wattenstaafje de rechterlong om het pericardium (het hartzakje) bloot te leggen. Scheur vervolgens met een micro-pincet en een grote gekartelde pincet door het pericardium om de apex van het hart vrij te maken. Pak de apex van het hart vast met de micro-pincet met tanden en steek de naald in om de gesolveerde matrix te injecteren, met de schuine zijde naar links gericht.

Op een derde van de afstand vanaf de apex, parallel aan het epicardiale oppervlak. Zorg ervoor dat de vena cardiaca magna wordt vermeden. Injecteer de gesolubiliseerde matrixgel en wacht een paar seconden voordat de naald wordt verwijderd.

Het weefsel moet wit uitslaan op de injectieplaats; veeg het bloed in de holte weg en verwijder de handdoekklem en het watje dat de rechterlong vasthoudt met gebogen micro-hemostaten, en maak een eerste knoop met een 30 inch lange 5-0 proline hechtdraad. Gebruik vervolgens ratentand-micro-pincetten om het diafragma te sluiten met een continue hechting en een taps toelopende naald voordat het volledig wordt gesloten. Voer PE 1 60 zuigslangen in en sluit deze af met behulp van een 10 milliliter spuit om de borstholte te legen.

Terwijl de hechting wordt aangetrokken, moet het diafragma concaaf zijn. Verlaag het ijs van fluor naar 1%. Verwijder beide 3-0 Vicryl-hechtingen die de holte openhouden. Hydrateer de spier en veeg het overschot weg met een wattenstaafje of steriel gaas.

Gebruik een nieuw stuk 3-0 hechtdraad om de spierlaag met onderbroken hechtingen te sluiten. Zet vervolgens de isofluraan uit. Reinig het gebied en gebruik nietjes om de huid te sluiten.

Breng vervolgens een triple-antibioticazalf aan op de incisieplaats. Laat de rat herstellen onder 100% zuurstof. Wanneer het dier rond de ventilator begint te ademen, wordt de tracheabuis verwijderd.

Zodra het dier weer op de poten staat, dient een subcutane injectie van 0,05 milligram per kilogram buprenorfinehydrochloride analgeticum te worden toegediend, waarna het dier op een steriele handdoek in de thuiskooi wordt geplaatst. Hartweefsel van ratten waarin oplosbare matrixgels waren geïnjecteerd, werd gesneden en gekleurd met hematoxiline en eosine voor macroscopische weefselanalyse op verschillende tijdstippen. Na de chirurgische ingreep op vroege tijdstippen is het geïnjecteerde gebied zichtbaar als een roze fibreus netwerk dat op latere tijdstippen interstitieel is verspreid.

Cellulaire influx wordt na twee weken waargenomen. Degradatie van de geïnjecteerde matrix is zichtbaar. Indien de ECM vóór injectie met biotine is gelabeld, kan deze directer worden gevisualiseerd door de biotine te kleuren met HRP-geconjugeerd streptavidine om de ingroei en vorming van vaten in het injectiegebied van de matrix in beeld te brengen.

De coupes zijn hier geco-gekleurd met een fitzy. Geconjugeerde selectine die bindt aan endotheelcellen is in het groen weergegeven, en een antilichaam tegen glad spieractinine is in het rood weergegeven; stamcellen kunnen mogelijk ook worden geïdentificeerd nabij de injectieregio.

Hier zijn ze gevisualiseerd met een immunohistochemische kleuring voor C kit. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u gesolubiliseerde ECM kunt creëren uit gedecellulariseerd weefsel en dit in vivo kunt testen voor toepassingen in cardiac tissue engineering. Vergeet niet dat hoewel we pericardiaal weefsel gebruiken, deze algemene procedure kan worden aangepast om met elke weefselbron te worden gebruikt.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.