Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture
6 september 2010
In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met een In vitro Co-cultuur systeem. Rat corticale gliale cellen werden gekweekt tot confluentie en cocultured met zeer zuivere rat achterwortelganglia neuronen. Verschillende gliale cel invloed op de neuronen hechting en axongroei werd direct vergeleken in dezelfde cultuur. Deze methode biedt een nieuwe manier om direct de studie van de gliale cel heterogeniteit invloed op de hechting en neuron a
Het algemene doel van deze procedure is om de invloed van gliale heterogeniteit op de groei van DRG-axonen en celdeionisatie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de gliale cellen uit de cortex van neonatale ratten te isoleren. De tweede stap van de procedure is het kweken en zuiveren van DRG-neuronen uit rattenembryo's.
De derde stap van de procedure is het toevoegen van de gezuiverde DRG-neuronen aan de gliacellen. De laatste stap van de procedure is het observeren van de axonale groei in de cellen en het uitvoeren van celkleuring en kwantitatieve analyse. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden verkregen.
Dit toont aan dat de groei van DRG-neuronen wordt beïnvloed door heterogene gliacellen via time-lapse opname en immunofluorescentiemicroscopie. Hallo, ik ben verbonden aan het lab voor neuro-imaging van de afdeling Neurologie aan de UCRA. Vandaag laten we u een procedure zien om de heterogene invloed van gliacellen op de groei te bestuderen met een nieuwe methode voor neuronencultuur.
In ons laboratorium gebruiken we deze nieuwe methode om de interactie tussen neuronen en de ggl-cellen te bestuderen. Laten we de studie testen. Om een co-cultuur van glia- en wortelganglionneuronen (DRG's) op te zetten, beginnen we met het kweken van gliacellen onder een steriele laminaire flowkast. Bekleed de bodem van vooraf gesteriliseerde 24-wells cultuurplaten met gesteriliseerde ronde glazen dekglasjes; coat de dekglasjes in de wells van een 6-wells cultuurplaat met polylysine en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.
Was de dekglasjes en kweekplaten tweemaal met gedestilleerd water en laat ze aan de lucht drogen. Pipetteer vervolgens 200 µL of twee milliliters DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) met 10% foetaal kalfsserum (FBS) in respectievelijk elke 24-well of 6-well plaat. Incubeer de platen de volgende dag bij 37 °C in 5% CO₂.
Steriliseer de dissectiekap met positieve luchtstroom. Schakel de UV-lamp 20 minuten in en spray vervolgens alle oppervlakken onder de kap met 70% ethanol; wacht 15 minuten voor gebruik. Begin met de koppen van twee rattenpups (P2 tot P6) die door hypothermie zijn geanestheseerd.
Decapiteer vervolgens bij de basis van het foramen magnum met operatiescharen. Open het cranium langs de sagittale naad met iris-scharen en verwijder de schedel. Verwijder de voorhersenen, plaats deze in gekoeld levo wit's L 15 en herhaal dit bij de tweede kop.
Werk vervolgens onder een stereomicroscoop. Verwijder voorzichtig het dura mater, de peer-membranen en de bloedvaten die het brein bedekken. Isoleer de cortex en was deze meerdere keren met L 15-medium.
Gebruik microscharen om de cortex in kleine stukjes te knippen. Incubeer deze vervolgens in L 15-medium dat 0,125% tripsine in EDTA bevat bij 37 °C gedurende 15 minuten. Breng de weefselblokjes daarna over naar een buis van 50 ml met 20 ml DMEM met 20% FBS.
Voeg DS toe tot een uiteindelijke concentratie van 10 µg/mL. Gebruik vervolgens een vuurgepolijste Pasteurpipet om de weefseloplossing ongeveer 20 keer te agiteren om de cellen te scheiden. Was de cellen tot slot één keer met DMEM met 10% FBS en bepaal het celgetal met een hemocytometer.
Zaai vervolgens de cellen uit bij 5.000 tot 10.000 cellen per vierkante centimeter en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium tweemaal per week om DRG's te isoleren, te zuiveren en te kweken. Bereid eerst 24-wells platen voor met polylysine-gecoate glazen dekglasjes, zoals eerder gedemonstreerd.
Voeg 100 µL NVF-medium toe aan elk dekglas en incubeer de platen op 37 °C tot de volgende dag. Steriliseer de positivestroomkast zoals eerder beschreven. Begin vervolgens met rattenembryo's van E 12 tot E 15, die onder de stereomicroscoop uit de baarmoeder van een drachtige rat werden geïsoleerd na euthanasie met koolstofdioxide.
Isoleer de ruggenmergen samen met de verbonden dorsale wortelganglia en breng deze over naar 35 millimeter petrischalen met gekoeld levo v's. L 15 medium. Gebruik microschirurgische pincetten om de verbonden DRG's voorzichtig te dissekeren van de ruggenmergen in gekoeld L 15 medium, zonder de DRG's te beschadigen; snijd de verbonden axonen door.
Gewoonlijk worden er 20 tot 30 DRG's uit één ruggenmerg geïsoleerd wanneer alle DRG's uit de ruggenmergen zijn geïsoleerd. Incubeer alle geïsoleerde DRG's in 0,125% trypsin in EDTA gedurende 20 minuten bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Was de cellen eenmaal met DMEM met 20% FBS, voeg vervolgens DNAs toe en pipetteer meerdere keren met een vuurgepolijste Pasteurpipet om een uniforme celstroom te vormen, zoals gedemonstreerd bij de gliacellen. Voer een tweede wasbeurt uit in MBF-medium, tel de cellen en zaai de cellen vervolgens uit op de voorbereide dekglasjes in 24-wells platen met 5.000 cellen per well. Incubeer dit een nacht om de DRG-neuronen te zuiveren.
18 tot 24 uur na het uitplaten. Vervang het medium door neurobasaal medium met 20 micromolair 5-fluor-2-deoxyuridine; 72 uur later wordt de helft van het medium vervangen door neurobasaal medium zonder FUDR.
Het medium wordt vervolgens om de dag vervangen. Ongeveer 20 dagen na het uitzaaien van de gliacellen bereiken deze confluentie en zijn ze klaar voor co-cultuur met neuronen, 24 uur voordat de twee celtypen worden gecombineerd.
Vervang het gliale celmedium door MBF-medium. Bereid een enkelcel-suspensie van gezuiverde DRG's zoals eerder gedemonstreerd. Bepaal de celdichtheid.
Zaai vervolgens de neuronen in een dichtheid van 500 cellen per vierkante centimeter op de gliale cellen. De neuronale adhesie en neurietuitgroei op gliale cellen kunnen op verschillende tijdspunten worden geanalyseerd met behulp van beeldanalyse-software en immunochemie met celtype-specifieke antilichamen. Hier zijn voorbeelden van gliale cellen en DRG-neuronen die afzonderlijk en als co-cultuur zijn gekweekt; de gliale cellen worden na 20 dagen confluent.
In kweek. Onder een fasecontrastmicroscoop was duidelijk dat verschillende subpopulaties van gliacellen onderscheidende groeipatronen en morfologieën vormen. En via immunocytochemie bleek dat GFAP-positieve astrocyten verantwoordelijk waren voor meer dan 90% van de kweek.
Door onze behandelmethode met FUDR gedurende 72 uur toe te passen, zal de zuiverheid van DRG-neuronen binnen zes dagen een niveau van wel 99% bereiken en zullen zij hun unieke morfologieën vertonen met een hoge dichtheid aan neurietgroei in een co-cultuur van neuronen en gliacellen. De aanhechting van DRG-neuronen en de uitgroei van neurieten vonden gemakkelijk plaats op gliacellen binnen vier uur na het uitplaatzen; de aanhechting van neuronen en de neurietgroei werden beïnvloed door subpopulaties van gliacellen, die speciale groeipatroon-substructuren vormen die gemakkelijk konden worden geïdentificeerd onder een fasecontrastmicroscoop. En middels immunocytochemie zal ik u laten zien hoe u DRG-neuronen co-cultuurt met gliacellen om de invloed van de heterogeniteit van gliacellen op de neurale groei te bestuderen.
Bij het uitvoeren van deze sessie is het zeer belangrijk om het weefsel uiterst voorzichtig te behandelen en de cellen in het medium te houden. Stel ze nooit bloot aan de lucht en laat ze niet uitdrogen. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de invloed van gliale celheterogeniteit op axonale groei te onderzoeken met behulp van een in vitro co-cultuursysteem. Corticale gliale cellen van ratten worden ge-cocultuurd met gezuiverde neuronen uit de dorsale wortelganglia van ratten om hun effecten op neuronale adhesie en axonale groei te vergelijken.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurobiologie
Achtergrond
- Gliale cellen spelen een cruciale rol in het zenuwstelsel.
- Heterogeniteit tussen gliale cellen kan het neuronale gedrag beïnvloeden.
- Het begrijpen van deze interacties is essentieel voor neurobiologisch onderzoek.
- In vitro-modellen bieden een gecontroleerde omgeving om deze effecten te bestuderen.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe verschillende typen gliacellen de axonale groei beïnvloeden.
- Om de impact van de heterogeniteit van gliacellen op de adhesie van neuronen te beoordelen.
- Om een betrouwbaar co-culturesysteem te ontwikkelen voor toekomstige studies.
Gebruikte Methoden
- Isolatie van gliale cellen uit de cortex van neonatale ratten.
- Kweek en zuivering van neuronen uit de dorsale wortelknoppen (DRG) van rattenembryo's.
- Co-kweek van gezuiverde DRG-neuronen met gliale cellen.
- Observatie van axonale groei en celadhesie via kleuring en kwantificering.
Belangrijkste resultaten
- Verschillen in axonale groei werden waargenomen op basis van het type gliacel.
- Gliacellen hadden een significante invloed op de neurale adhesie.
- Het co-kweeksysteem bleek effectief voor het bestuderen van gliale-neurale interacties.
- De resultaten bieden inzicht in de rol van gliale heterogeniteit bij de neuronale ontwikkeling.
Conclusies
- Deze methode maakt directe studie mogelijk van de effecten van gliacellen op neuronen.
- De resultaten verbeteren het begrip van gliale-neuronale interacties.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit model om therapeutische toepassingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het begrijpen van de heterogeniteit van gliale cellen is essentieel voor het verminderen van risico's bij de validatie van neurotherapeutische targets, aangezien astrocyten-subpopulaties axonale groei en neuronale mechanismen verschillend beïnvloeden. Deze co-culturemethode maakt mechanistische screening van gliale-neuronale interacties mogelijk, wat het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase versterkt door permissieve of inhiberende micro-omgevingen te identificeren. De aanpak biedt een ziekterelevant systeem om te evalueren hoe gliale variabiliteit het regeneratieve potentieel beïnvloedt, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen in programma's voor CNS-herstel en neurodegeneratie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door axonale groei op verschillende astrocyten-subpopulaties onder identieke omstandigheden te vergelijken.
- Operationele waarde: Biedt een gezuiverd, reproduceerbaar systeem om glia-specifieke effecten op neuronale adhesie en neurietuitgroei te isoleren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij doelwitselectie door te onthullen hoe gliale heterogeniteit neuronale responsen moduleert, wat bijdraagt aan het mechanistische vertrouwen bij de selectie van signaalpaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde gliale monolagen met >90% GFAP+ astrocyten, wat consistente neuronale seeding en time-lapse analyse van axonale groei mogelijk maakt.
- Kwantitatieve output: Faciliteert immunochemische kleuring en beeldgebaseerde kwantificatie van neuritlengte en vertakking, ter ondersteuning van dosis-respons- of vergelijkende screening.
- Schaalbaarheid: Compatibel met het 24-wellplaatformaat, waardoor parallelle toetsing van gliale condities mogelijk is voor assay-optimalisatie en reagensscreening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert de heterogeniteit van gliale cellen in het CZS zoals waargenomen bij letsel en ziekte, waarbij astrocytenvariabiliteit het regeneratieve falen beïnvloedt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie door een menselijk relevant gliaal-neuronaal interactieplatform te bieden voor het testen van lead-verbindingen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt vroege identificatie van gliaal-gemedieerde inhiberende effecten mogelijk, waardoor uitval in een laat stadium van neuroregeneratieprogramma's wordt verminderd.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van doelwitvalidatie tot lead-identificatie, waarbij gegevens over gliale-neuronale interacties inzicht geven in de effecten van verbindingen op axonale groei in een ziekterelevant systeem.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over glia-gemedieerde modulatie van axonale groei, waardoor padspecifieke neuronale responsen worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve read-outs van neurietuitgroei, wat vergelijking tussen gliale condities of therapeutische kandidaten mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert meetbare metrieken voor axonale groei en adhesie via immunofluorescentie en time-lapse imaging, ter ondersteuning van statistische vergelijking van experimentele groepen.
- Translationeel Onderzoek: Modelleert gliale variabiliteit die relevant is voor menselijke CNS-pathologie, wat preklinische evaluatie van targets in een heterogene micro-omgeving mogelijk maakt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar co-culture platform dat toepasbaar is op meerdere CNS-targets, gliale typen en neuronale bronnen voor duurzame ontdekkingsprogramma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door gliale subpopulaties te koppelen aan differentiële resultaten van axonale groei.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde gliale zuivering, neuronale seeding en gedefinieerde cultuurtijdlijnen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door gliale condities te identificeren die regeneratie ondersteunen of remmen, wat de selectie van targets optimaliseert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de compatibiliteit met de gliale micro-omgeving, wat de kapitaalefficiëntie in CNS-portfolio's verhoogt.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie van primaire neurale en gliale cellen, steriele weefselkweek en immunofluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van polylysine-gecoate dekglasjes, neurobasaal medium, FUDR en fasecontrast-/fluorescentie-beeldvormingssystemen.
- Vereist standaardisatie van de gliale preparatie, neuronenzuivering en de timing van de co-cultuur voor reproduceerbaarheid tussen teams.
- Aanpassing aan menselijke iPSC-afgeleide glia of neuronen kan optimalisatie van de maturatie- en zuiverheidsprotocollen vereisen.
- Beperkt door variabiliteit in primair weefsel van knaagdieren en de afwezigheid van microgliale of oligodendrocyten-subsets in corticale gliale preparaten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Title
1:34
Establishing a Glial Cell Culture
4:29
Isolation, Purification, and Cuturing of Dorsal Root Ganglion Neurons (DRGs) and Coculturing of DRGs with Glial Cells
7:29
Representative Cultures of Glial Cells, DRG Neurons, and Cocultures of Both Cell Types
8:36
Conclusion
1:03
Introduction
