Name: Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer hoe gliale celheterogeniteit axongroei beïnvloedt met een nieuwe co-cultuurmethode. Ratcorticale gliale cellen worden gekweekt met dorsale wortelganglia-neuronen om neuronadhesie en axongroei te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door FMMU nieuwe vinding fundering en gedeeltelijk NIH financiering.

1. Glia Cel Cultuur Gliale cellen kunnen worden gekweekt uit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel. Het hele proces is weergegeven in figuur proces. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="Proces 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Proces 1"> Dag 1 Coating cultuur plaat en dekglaasjes <ol><li> Droog gesteriliseerd glas microscoop ronde dekglaasjes in een autoclaaf. </li><li> Het bord van de gesteriliseerde dekglaasjes in gesteriliseerde 24-well plaat cultuur. </li><li> Coat de dekglaasjes met poly-lysine en incubeer gedurende 2 uur onder wortel temperatuur. </li><li> Coat 6-well platen cultuur op dezelfde manier als in stap 3. </li><li> Twee keer was de dekglaasjes en 6-well cultuur plaat met gedestilleerd water en de lucht drogen in de cultuur kap. </li><li> Voeg 200 pi DMEM medium (met 10% FBS) in elk putje in 24-well plaat en 2 ml in elk putje in 6-wells plaat en leg ze in de broedmachine onder 37 graden met 5% CO 2 </li></ol> Dag 2 isoleren cortex en gliale celculturen <ol><li> Steriliseer de positieve stroom dissectie kap. </li><li> Schakel UV-licht gedurende 20 minuten. </li><li> Spray alle oppervlakken met 70% ethanol en wacht 15 minuten voor gebruik. </li><li> verandering tijd: Verdoof rat pups (P2-P6) door onderkoeling, en onthoofden aan de voet van het framen magnum met behulp van operationele schaar. </li><li> Open de schedel langs de pijlnaad met behulp van een iris schaar en pel de schedel. </li><li> Verwijder de voorhersenen en zet ze in gekoelde L15 medium, onder stereomicroscoop, zorgvuldig schoon de dura en de pia membraan met bloedvaten, isoleren van de cortex en was meerdere malen met L15 medium. </li><li> Snijd de cortex in kleine stukjes met microchirurgie schaar. </li><li> Voeg 0,125% trypsine-EDTA met L15 bereid medium in de cortex stukken en incubeer bij 37 graden gedurende 15 minuten. </li><li> Overdracht weefsel blokken in 20 ml DMEM medium met 20% FBS in 50 ml tube, voeg DNase stockoplossing aan uiteindelijke concentratie 10ug/mL, het weefsel oplossing op aspireren en neer voor 20 keer met vuur gepolijst glas Pasteure pipet, het verzamelen van de individuele cellen ophanging. </li><li> Was de celsuspensie een keer met DMEM-medium, opnieuw te schorten cellen in DMEM met 10% FBS, cellen te tellen onder de microscoop met een hemocytometer, zaad cellen in 5000-10000/cm 2. Behouden cellen in een 37 graden 5% incubator, veranderen de helft van het medium 2 keer per week. </li></ol> 2. Achterwortelganglia Neuronen Isolatie, Cultuur en zuivering Dag 1 Maak Cultuur Materiaal <ol><li> De vacht van de gesteriliseerde dekglaasjes met poly-lysine, wassen coverslips tweemaal met gedistilleerd water en lucht drogen, zet ze in 24-well platen. </li><li> Voeg 100μL Neurobasal medium met 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml), zet plaat in 37 graden 5% CO 2. </li></ol> Dag 2 Isoleer DRG's uit embryo's <ol><li> Gesteriliseerd de stroming kap op dezelfde manier als gliale cel cultuur. </li><li> Euthanaseren een zwangere rat (E15) door een overdosis met CO 2, gesteriliseerd buik met 70% ethanol, werd geïsoleerd uit embryo's baarmoeder en in gekoelde L15 medium. </li><li> Isoleer ruggenmerg met de aangesloten achterwortelganglia onder stereomicroscoop en transfer naar 35mm gerechten met gekoelde L15 medium. </li><li> Verzamel enkele celsuspensie en was een keer met NBF medium (Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml)). </li></ol> Dag 3 Zuiver DRG neuronen <ol><li> 18u-24u na het neuron zaaien, voeg dan een een mM geconcentreerde FUDR stockoplossing aan het neuron cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM en een uiteindelijk volume van 200 pi. </li><li> 72h later, vervang dan de helft van de medium met Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50ng/mL) zonder FUDR. Daarna, wijzigt u het medium om de andere dag. </li></ol> 3. Coculture DRG neuronen met gliacellen <ol><li> Wanneer gliale celcultuur samenloop (ongeveer 20 dagen na zaaien) bereikt, waren ze klaar voor coculture met neuronen. </li><li> 24 uur voor het toevoegen van de gezuiverde neuronen, werden gliacellen medium veranderd in Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml). </li><li> Gezuiverde neuronen werden verzameld van cultuur putten, waren enkele cellen ophanging verkregen door mechanische passeren vuur gepolijst Pasteure pipet. </li><li> Na het tellen van het aantal, werden neuronen gezaaid op 500/cm 2 op confluent gliale cellen in Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50ng/mL). </li><li> Neuronen hechting en neurieten groei op gliale cellen kunnen worden opgenomen en geanalyseerd op verschillende tijdstippen door beeldanalyse-software en met behulp van immunocytochemie celtype specifieke antilichamen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <ol><li> Gliale celculturen: Na het zaaien, zal gliacellen worden samenvloeiende ongeveer 20 dagen. Onder fase contrast MicroscOPE, was het gemakkelijk te herkennen dat verschillende morfologische gliale cel subpopulaties ander groeipatroon onderbouw gevormd en de GFAP positieve astrocyten goed voor meer dan 90% zoals blijkt uit immuocytochemisty techniek (figuur 1, figuur 2). </li><li> DRG neuronen cultuur: In onze methode, na 72 uur FUDR behandeling, de zuiverheid van de DRG neuronen zal zo hoog als 99% te bereiken binnen 6 dagen, DRG neuronen toonden hun unieke morfologie en met een hoge dichtheid van neurieten groei (Figuur 3, Figuur 4). </li><li> Gliale cellen en neuronen coculture: DRG neuronen hechting en neurietuitgroei zich gemakkelijk op de gliale cellen binnen de 4 uur na het uitzaaien, is een zorgvuldige observaties toonden aan dat neuron hechting en groei van neurieten werden beïnvloed door gliale cel subpopulaties die speciale groeipatroon onderbouw gevormd, kan dit gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd onder fasecontrastmicroscoop en door middel van immunocytochemie (Figuur 5, Figuur 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Morfologie van confluerende gliacellen. Corticale gliale cellen werden uitgeplaat op polylysine gecoate dekglaasje en gekweekt gedurende 20 dagen, de verschillende groeipatroon van gliacellen nota, cellen aan de linkerkant gerangschikt in een uitgestraald manier. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Confluente gliacellen gelabeld door gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) antilichaam. Let op de uitgestraalde opstelling van GFAP (rood) positieve cellen aan de rechterkant. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Achterwortelganglia neuronen groeide in vitro zonder FUDR behandeling. Contaminerende cellen gevormd neuronen 'achtergrond DRG. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Achterwortelganglia neuronen groeide in vitro na FUDR behandeling. De achtergrond contaminerende cellen was volledig geëlimineerd. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Achterwortelganglia neuronen gekweekt op gliacellen. Neuronen hechting en neurieten groei werd geremd op de uitgestraalde geregeld cellen en beperkt aan de rechterkant gliacellen. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Achterwortelganglia neuronen groeien op gliale cellen gelabeld door neurofilament antilichaam. De neurieten (groen) geremd op de uitgestraalde geregeld linkerkant gliacellen en beperkt aan de rechterkant, werden alle gliale cellen gelabeld door GFAP antilichaam (rood).

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

Dit experiment protocol is ontworpen om twee doelen te bereiken gliacellen, in het bijzonder astrocyten heterogeniteit van invloed op de neuron hechting en neurieten groei te bestuderen. Het eerste doel was om astrocyten heterogeniteit zoveel mogelijk, in dit experiment te houden, was de samenvloeiing gliale cel cultuur verrijkt astrocyten gemengde primaire cultuur zonder enige chemische behandeling en de spijsvertering voortplanting, die verder kan schade aan de cel en veroorzaken letsel reactie van astrocyten. De laat...

<table><tbody><tr><td>DMEM(hoog glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>L15 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>poly-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>cultuurkwaliteit</td></tr><tr><td>NGF(2.5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>neurofilament antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

studie gliale cel heterogeniteit invloed op axon groei met een nieuwe methode coculture

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In het centrale zenuwstelsel van alle zoogdieren, afgesneden axonen na verwonding niet in staat zijn te regenereren in hun oorspronkelijke doelen en functioneel herstel is zeer slecht 1. Het falen van regeneratie van axonen is een gecombineerde resultaat van verschillende factoren, waaronder de vijandige gliale cel omgeving, remmende myeline verwante moleculen en een verminderde intrinsieke neuron regeneratievermogen 2. Astrocyten zijn de meest overheersende gliale celtype in het centrale zenuwstelsel en spelen een belangrijke rol in het axon taken uit hoofde van fysiologie en pathologie voorwaarden 3. Tegenstelling tot de homologe oligodendrocyten, astrocyten zijn een heterogene celpopulatie samengesteld door verschillende astrocyten subpopulaties met verschillende morfologie en gen-expressie 4. De functionele betekenis van deze heterogeniteit, zoals hun invloeden op axon groei, is grotendeels onbekend. De studie van de gliale cel, in het bijzonder de functie van astrocyte heterogeniteit in het gedrag van neuron, hebben we een nieuwe methode door de co-kweken van hoog gezuiverde achterwortelganglia neuronen met gliacellen verkregen uit de rat cortex. Door deze techniek konden we neuron hechting en axongroei direct vergelijken op verschillende subpopulaties astrocyten onder dezelfde voorwaarde. In dit rapport geven we de gedetailleerde protocol van deze methode voor astrocyten isolatie en cultuur, achterwortelganglia neuronen isolatie en zuivering, en de co-cultuur van de DRG neuronen met astrocyten. Deze methode kan ook worden uitgebreid tot andere gebieden van de hersenen om de cellulaire of regionaal specifieke interactie tussen neuronen en gliacellen te bestuderen.

In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-cultuur systeem. Rat corticale gliale cellen werden gekweekt tot confluentie en cocultured met zeer zuivere rat achterwortelganglia neuronen. Verschillende gliale cel invloed op de neuronen hechting en axongroei werd direct vergeleken in dezelfde cultuur. Deze methode biedt een nieuwe manier om direct de studie van de gliale cel heterogeniteit invloed op de hechting en neuron axon groei.

Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture

In het centrale zenuwstelsel van alle zoogdieren zijn doorgesneden axonen na letsel niet in staat om te regenereren naar hun oorspronkelijke doelcellen en het functionele herstel is ...

Het algemene doel van deze procedure is om de invloed van gliale heterogeniteit op de groei van DRG-axonen en celdeionisatie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de gliale cellen uit de cortex van neonatale ratten te isoleren. De tweede stap van de procedure is het kweken en zuiveren van DRG-neuronen uit rattenembryo's.De derde stap van de procedure is het toevoegen van de gezuiverde DRG-neuronen aan de gliacellen. De laatste stap van de procedure is het observeren van de axonale groei in de cellen en het uitvoeren van celkleuring en kwantitatieve analyse. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden verkregen.Dit toont aan dat de groei van DRG-neuronen wordt beïnvloed door heterogene gliacellen via time-lapse opname en immunofluorescentiemicroscopie. Hallo, ik ben verbonden aan het lab voor neuro-imaging van de afdeling Neurologie aan de UCRA. Vandaag laten we u een procedure zien om de heterogene invloed van gliacellen op de groei te bestuderen met een nieuwe methode voor neuronencultuur.In ons laboratorium gebruiken we deze nieuwe methode om de interactie tussen neuronen en de ggl-cellen te bestuderen. Laten we de studie testen. Om een co-cultuur van glia- en wortelganglionne

study-glial-cell-heterogeneity-influence-on-axon-growth-using-new

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Leer hoe gliale celheterogeniteit axongroei beïnvloedt met een nieuwe co-cultuurmethode. Ratcorticale gliale cellen worden gekweekt met dorsale wortelganglia-neuronen om neuronadhesie en axongroei te analyseren.

Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture

Meer video's verkennen