Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

Het algemene doel van het volgende experiment is het verkrijgen van driedimensionale beelden op micron-schaal van de zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen middels elektronenspinresonantie (ESR)-microscopie. Het protocol wordt gedemonstreerd met cyanobacteriën, wat veelvoorkomende fotosynthetische cellen zijn. Dit wordt bereikt door eerst een monster van cyanobacteriëncellen voor te bereiden in de monsterhouder voor ESR-microscopie.

Ingebed in een stabiele organische radicaaloplossing. De monsterhouder wordt in de beeldvormingsprobe geplaatst, die vervolgens in de statische elektromagneet van het ESR-microscoopsysteem wordt geschoven. Vervolgens worden met de ESR-microscoop meerdere driedimensionale ESR-microbeelden van de organische radicaaloplossing verkregen.

Dit wordt uitgevoerd voor verschillende varianten van pulsequenties en vaak onder diverse externe condities, zoals onder licht- en donkeromstandigheden. Vervolgens worden de ruwe databeelden door de computer verwerkt om de driedimensionale, ruimtelijk opgeloste relaxatietijden van het radicaal te extraheren. Deze relaxatietijden bieden via een vooraf bestaande kalibratie een directe maat voor de zuurstofconcentratie, wat leidt tot volledige driedimensionale zuurstofkaarten van de gemeten monsters onder verschillende externe condities.

Er zijn resultaten verkregen die duidelijk aantonen dat er geen zuurstof wordt geproduceerd door de cyanobacteriën wanneer er geen licht wordt toegepast. Bovendien wordt aangetoond dat er onder lichtbestraling een significante zuurstofgradiënt en zuurstofheterogeniteit ontstaan nabij de cellen van de cyanobacteriën. Hallo, ik ben al van het laboratorium van BLA in de S Faculteit Scheikunde aan het Technion, het Israel Institute of Technology in Haifa.

Vandaag tonen we u een procedure voor het in drie dimensies in kaart brengen van zuurstofconcentraties nabij levende cellen met een hoge ruimtelijke resolutie middels fluorescence lifetime imaging microscopy. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de zuurstofconsumptiesnelheid en de metabole activiteit van cellen te bestuderen. Laten we beginnen.

Elektronenspinresonantie of ESR is een spectroscopische techniek waarbij elektromagnetische straling met een specifieke frequentie wordt geabsorbeerd door paramagnetische soorten met een ongepaarde elektronenspin die zijn geplaatst in een extern statisch magnetisch veld. Het is een krachtige methode voor het bestuderen van de omgeving van paramagnetische moleculen in levende organismen, waaronder de concentraties van zuurstof en reactieve zuurstofverbindingen. Hier wordt een typisch beeld van de zuurstofconcentratie van een tumorhoudende muis getoond voor heterogene monsters.

ESR-spectrale informatie kan op ruimtelijk opgeloste wijze worden verkregen door gebruik te maken van magnetische veldgradiënten. Een stabiel, vrij organisch radicaal werd in de muis geïnjecteerd en de ESR-kenmerken hiervan geven de zuurstofconcentratie in de omgeving weer. De op ESR gebaseerde resultaten zijn overgeplaatst op een MRI-anatomisch beeld.

Tot nu toe werden dergelijke ESR-beeldvormingstechnieken van levende specimens slechts uitgevoerd met relatief grote monsters op millimeterschaal. Resolutie-ESR-microscopie omvat metingen van monsters met een grootte van een millimeter of submillimeter, waardoor driedimensionale ESR-beelden worden verkregen met een resolutie die één micron nadert.

Hier zijn twee voorbeelden van ESR-beelden op micronschaal met een hoge resolutie, van een gegenereerd monster met NNC 60-poeder en paramagnetische lithiumcyanoferraatkristallen. Een ESR-microscoop lijkt op een conventionele ESR-spectrometer en beschikt over een magneet voor het genereren van het statische veld, een microgolfsysteem voor spin-excitatie en signaaldetectie, een probe voor het vasthouden van het monster en een computergestuurde console om het acquisitieproces en de gegevensverwerking te regelen. Andere componenten van het systeem zijn magnetische veldgradiëntdrivers, die deel uitmaken van het elektronische systeem, en gradiëntspoelen die zich in de imaging-probe bevinden.

De gradiëntspoelen hebben ook een opening om lichtbestraling van het monster mogelijk te maken. Er wordt vochtige lucht met een gecontroleerde temperatuur op het monster toegepast om minimale dehydratie tijdens het experiment te waarborgen. De belangrijkste unieke kenmerken van ESR-microscopie zijn de geringe afmetingen van de probe en de gradiëntspoelen, de hogere spingevoeligheid van het systeem en de hoge sterkte van de magnetische veldgradiëntsturingen. Bereid vóór aanvang van deze procedure een suspensie van cyanobacteriën voor met een concentratie van 40 mg/mL.

Om te beginnen met de monsterpreparatie voor ESR-micro-imaging, neem dan met een fijne pincet een paar vierkantjes absorberend papier van ongeveer 400 bij 400 micron. Plaats deze vervolgens in een Eppendorf-buisje. Vul het buisje daarna met 1,2 milliliter van de cyanobacteriën-suspensie.

Centrifugeer de suspensie vervolgens gedurende twee minuten bij 6.000 RPM in een microcentrifuge. Verwijder na centrifugatie het supernatant volledig, behalve ongeveer 50 µL, dat wordt achtergelaten om dehydratatie van de cyanobacteriën te voorkomen. Dit proces resulteert in de verzadiging van het absorptiepapier met de cyanobacteriëncellen. Bereid vervolgens een speciaal geprepareerde bekerglasvormige monsterhouder voor, extraheer met een fijne pincet enkele vezels uit het papier en plaats deze op de bodem van de monsterhouder.

Voeg daarna drie millimolaire tridel en BG 11-oplossing toe, bereid zoals beschreven in het schriftelijke protocol, met een spuit van acht. Sluit vervolgens de monsterhouder af met UV-uithardende lijm door de lijm aan te brengen tussen de randen van de glazen monsterhouder en het bijbehorende dekglas, waarbij een kleine luchtuitlaat open blijft. Hard vervolgens de lijm twee seconden uit met UV-licht.

Om het beeldvormingsexperiment te starten, schakelt u het ESR-micro-beeldvormingssysteem in en plaatst u het monster in de resonator die zich in de beeldvormingsprobe bevindt. Gebruik nu de computerbesturingssoftware om het systeem in de tune-modus te zetten en bepaal de resonantie-microgolfrequentie van de probe, die gebruikt zal worden voor de ESR-metingen. Stel vervolgens het statische magnetische veld in op de waarde die overeenkomt met de toegepaste microgolfrequentie.

Stel de timingparameters voor de pulsequentie in en observeer het ESR-signaal om te controleren of het systeem goed functioneert en het monster correct is voorbereid. Stel vervolgens de beeldparameters in, zoals het aantal pixels, de sterkte van de gradiënten en de lengte van de gradiëntpulsen, op de vereiste waarden. Verzamel na de configuratie drie 3D ESR-beelden met een Han Echo Imaging-pulsequentie met interpuls-scheidingswaarden tau van 500 600 en 700 nanoseconden.

Zet op dit punt de lichtprojectie op het monster in indien dit vereist is voor de experimentele condities gedurende de acquisitie; de gegevens worden automatisch opgeslagen. Na het proces van data-acquisitie worden de ruwe databestanden via een MATLAB-softwareطscript verwerkt. Genereer met behulp van de software afbeeldingen van de concentratie van het trill-radicaal en de relaxatietijd.

T twee kaart vervolgens deze beelden via een bestaande kalibratiecurve die de zuurstofconcentratie koppelt aan de relaxatietijd om naar een zuurstofconcentratiebeeld te vertalen. Hier is T twee nul de spin-spin-relaxatietijd van de probe onder anoxische omstandigheden, afhankelijk van de concentratie C van de probe en de diffusiecoëfficiënt D ervan. Typische ruwe data-beelden van verschillende driedimensionale ESR-beeldvormingsexperimenten uitgevoerd op cyanobacteriën worden getoond. Deze beelden zijn verkregen met verschillende tau-waarden onder respectievelijk donkere of lichte omstandigheden.

Onder donkere omstandigheden zijn de resultaten zeer vergelijkbaar, behalve voor de afgenomen intensiteit bij grotere T-waarden als gevolg van de spin-spin-relaxatietijd T₂. Omgekeerd verandert onder lichtbestraling het beeldpatroon door de verschillende relaxatietijden in het monster. Deze gegevens worden vervolgens verwerkt om een amplitudebeeld uit dit beeld te verkrijgen.

Het is duidelijk dat de cyanobacteriën zich voornamelijk aan de rechterkant van de monsterhouder bevinden. De twee afbeeldingen worden omgezet in zuurstofconcentratiewaarden via een bestaande kalibratiecurve die de zuurstofconcentratie koppelt aan de relaxatietijd. De resultaten worden getoond voor cyanobacteriën in aanwezigheid en afwezigheid van licht.

Het is duidelijk dat de zuurstofproductie wordt geïnitieerd door licht en leidt tot een significante toename van de zuurstofconcentratie in de oplossing. Dit leidt tot een afname van het radicaal T twee, voornamelijk in de voxels nabij de absorberende papiervezels met de cyanobacteriën. We hebben u zojuist laten zien hoe u een monster voorbereidt met levende cellen en een stabiel vrij radicaal voor het in kaart brengen van de zuurstofconcentratie middels E ES R-microscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden deze zo kort mogelijk te houden om S-variabiliteit te waarborgen en degradatie van het monster te voorkomen.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.