Name: Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer elektronspinresonantie-microscopie voor driedimensionale zuurstofmapping bij levende cyanobacteriën. Deze methode maakt micron-schaalbeeldvorming van zuurstofconcentraties mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidie ​​niet. 213/09 van de Israëlische Science Foundation, geef geen. 2005258 van de BSF stichting, verlenen geen. 201.665 van de European Research Council (ERC), en door de Russell Berrie Nanotechnologie Instituut aan de Technion. Wij erkennen de hulp van Prof Noam Adir en Faris Salame van de Schulich Faculteit Chemie van de Technion met betrekking tot de levering en behandeling van de cyanobacteriën. De hulp en de ondersteuning van Svetlana Yoffis van het Technion Micro-Nano Fabrication Unit wordt zeer gewaardeerd.

1. Overzicht van de ESR Micro-imaging Eerst geven we een korte uitleg van de ESR, ESR microscopie, en de verschillende onderdelen van ons systeem, en dan zullen we de werkelijke imaging experimenten. Elektron spin resonantie is een spectroscopische techniek waarbij elektromagnetische straling op een bepaalde frequentie wordt geabsorbeerd door moleculen met ongepaarde elektron spins, geplaatst onder een extern statisch magnetisch veld (figuur 1). ESR is werkzaam in grote gebieden van de wetenschap, zoals scheikunde, biologie, natuurkunde en materiaalkunde, voor de detectie en identificatie van vrije radicalen en paramagnetische centra. Het is een krachtige methode voor het bestuderen van het milieu van paramagnetische moleculen in levende soorten en geeft informatie over de zuurgraad (pH), viscositeit, zuurstof en reactive oxygen species concentraties van 3. Voor heterogene monsters, kan ESR spectrale informatie worden verkregen in een ruimtelijk opgelost manier (dat wil zeggen, door het verkrijgen van een afbeelding), door het gebruik van het magnetisch veld gradiënten 4. Dit is zeer vergelijkbaar met de meer gebruikelijke methode van magnetic resonance imaging (MRI) die vooral merkt proton spins. Tot nu toe werden dergelijke ESR beeldvormende technieken toegepast voor levende specimens met een relatief grote omvang van een paar centimeter omhoog en in mm-schaal resolutie. (Bijvoorbeeld: zie figuur 2, overgenomen uit referentie 5.) Een relatief recente ontwikkeling in de ESR beeldvorming is de uitbreiding van de mogelijkheden uit te kijken naar kleine dieren in millimeter-schaal resolutie van de metingen van millimeter-en sub-millimeter-size monsters met een micron-schaal resolutie. Dit veld staat bekend als ESR microscopie, die vandaag de dag kunnen 3D-beelden te leveren ESR met een resolutie naderen een micron 2 (zie representatieve voorbeelden in figuur 3). Een ESR microscoop is in wezen vergelijkbaar met een conventionele ESR spectrometer. Het is een magneet voor het genereren van het statische veld, een magnetron voor spin-excitatie en signaal-detectie, een sonde voor het houden van het monster, en een geautomatiseerde console om de overname proces-en data handling controle. Andere componenten die uniek de ESR beeldvorming in het algemeen en ook in de bestaande ESR microkopie zijn magnetisch veld gradiënt bronnen, die deel uitmaken van het elektronische systeem, en gradiëntspoelen die zich in de beeldvorming sonde. Meer details over onze specifieke systeem zijn weergegeven in het protocol film en beschreven in referentie 2. 2. ESR Micro-imaging Monstervoorbereiding Deze fase beschrijft de methode voor monstervoorbereiding voor de ESR micro-imaging experiment. Aan het eind van deze fase cellen zijn geplaatst op de bodem van een speciaal bereide glas ESR microscopie monsterhouder, samen met een trityl radicale 6 bufferoplossing. Dit protocol beschrijft de meting van cyanobacteriën cellen en daarmee, voor andere soorten cellen, de juiste aanpassingen kunnen nodig zijn bij de monstervoorbereiding podium. <ol><li> Eerst worden een paar vierkanten van absorberend papier met een afmeting van ~ 400 400 micrometer genomen en ingebracht in een eppendorfbuisje, die vervolgens wordt gevuld met 1,2 ml van de cyanobacteriën suspensie (met een concentratie van 40 mg / ml). </li><li> De suspensie wordt gecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij 6000 rpm in een microcentrifuge. </li><li> Na deze, is het supernatant buffer volledig verwijderd, behalve voor ~ 50 uL, die worden overgelaten aan cyanobacteriën uitdroging te voorkomen. Als gevolg van dit proces, is het absorberend papier nu verzadigd door de cyanobacteriën cellen. </li><li> Met behulp van fijne pincet, zijn een paar vezels uit de krant en op de bodem van een cup-achtige speciaal geprepareerde glas monsterhouder 7. Naar aanleiding van dat een 3 mM van trityl in BG-11-oplossing 8, 9 (zie Schema 1) wordt toegevoegd aan de monsterhouder met behulp van een fijne spuit. De houder wordt vervolgens afgedicht met behulp van UV-lijm, waardoor een kleine luchtuitlaat te openen. <table border="1"><tbody><tr><td> Voorraad 4 </td><td> Voorraad 3 </td><td> Voorraad 2 </td><td> Voorraad 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Ijzer ammoniumcitraat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Citroenzuur: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schema 1. Voorbereiding van de BG-11 medium. </li></ol> 3. ESR Micro-imaging experimenten <ol><li> Om te beginnen de beeldvorming experiment, zet de ESR micro-imaging-systeem en breng het monster in de resonator, dat gaat in de imaging-sonde. </li><li> Nu, met behulp van de computer te bedienen software, zet het systeem op "Tune" mode en vind de resonantie microgolf frequentie van de sonde, die zal worden gebruikt voor de ESR metingen. </li><li> Naar aanleiding van dat, het statisch magnetisch veld ingesteld op de waarde die de toegepaste microgolf frequentie wedstrijden, de timing parameters voor de pulssequentie en observeer de ESR signaal om ervoor te zorgen dat het systeem goed functioneert en het monster is goed voorbereid. </li><li> Stel vervolgens de imaging parameters, zoals het aantal pixels, de sterkte van de hellingen, en de lengte van het verloop pulsen om de vereiste waarden. </li><li> Na de installatie, het verzamelen van drie 3D-beelden door een ESR Hahn echo imaging pulssequentie (figuur 4) met interpulse scheiding, de waarden van  500, 600 en 700 ns. </li><li> Licht geprojecteerd op het monster is in-of uitgeschakeld, afhankelijk van de vereiste experimentele omstandigheden. </li><li> Tijdens de overname, worden de gegevens automatisch opgeslagen. Scripties ruwe data bestanden worden vervolgens verwerkt via Matlab software script om beelden van de trityl radicale concentratie en de relaxatietijd T 2 kaart, die wordt vertaald naar een zuurstofconcentratie afbeelding via reeds bestaande calibratie te bieden. </li></ol> 4. Representatieve resultaten De uitkomsten van het experiment zijn verschillende drie-dimensionale ESR micro-beelden die op verschillende τ waarden. Typische ruwe data beelden worden gegeven in figuur 5. De top drie beelden, gemeten onder donkere omstandigheden, zijn zeer vergelijkbaar, behalve voor vermindering van het signaal intensiteit. Aan de andere kant, het beeld patroon verandert onder lichte bestraling te wijten aan de verschillende relaxatietijden in verschillende delen van het monster. Deze gegevens kunnen worden verwerkt tot een een amplitude beeld te verkrijgen, zoals weergegeven in figuur 6, maar ook beelden van de relaxatietijd, T 2 (figuur 7). De T 2 beelden worden omgezet in zuurstof waarden via een reeds bestaande calibratie curve die de zuurstof concentratie naar de relaxatietijd via de vergelijking links: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Vergelijking 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 1"> Hier, T 2 0 is de spin-spin relaxatietijd van de sonde onder zuurstofloze omstandigheden (afhankelijk van de concentratie van de sonde, C, en de diffusiecoëfficiënt, D), en k een evenredigheidsconstante. In de meeste gevallen, is de diffusie coëfficiënt niet veel afwijken van levende monsters (hoewel, indien nodig, het kan in principe ook direct worden geëvalueerd door ESR 6, 10), en de spin concentratie is verkregen tijdens het beeldvormingsproces. Daarom kan deze relatie worden gebruikt om rechtstreeks te meten zuurstofconcentratie. Terug te gaan naar figuur 6, blijkt uit de amplitude beeld dat de cyanobacteriën cellen bevonden zich vooral op de rechterkant van de monsterhouder. Bovendien, op basis van figuur 7, is het duidelijk dat licht de productie van O 2 initieert en leidt tot een aanzienlijke toename van O van de oplossing 2-concentratie, vooral in de voxels de buurt van de cyanobacteriën. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Energie niveaus in elektron spin resonantie. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: Typische zuurstofconcentratie beeld van een tumor dragende muizen. De afbeelding aan de linkerkant toont de anatomische informatie, op basis van een MRI-beeld. Een stabiele vrije organische radicaal werd geïnjecteerd om de muis en de ESR kenmerken bieden de zuurstofconcentratie in de omgeving (rechts). ESR-based resultaten zijn bovenop MRI anatomische beeld. Gezichtsveld is 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Twee voorbeelden van hoge resolutie micro-schaal ESR beelden van photolithographically gegenereerde monster met N @ C 60 poeder (links) en LiPc paramagnetische kristallen (rechts) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: Typische Hahn beeldvorming pulssequentie met de magnetron (MW) en de gradiënt, G x, y G en G z pulsen. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: Typische raw-data ESR micro-beelden: a, b, en c de ruwe gegevens van de cyanobacterie monster zonder licht gemeten verlichtingssterkte voor τ = 500600700 ns, respectievelijk. Items d, e, en zijn hetzelfde als a, b en c maar met licht verlichting. Intensiteit is uitgezet in willekeurige schaal (maar is consistent binnen elke set van drie donkere of lichte ruwe data beelden) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6: Amplitude afbeelding die overeenkomt met de radicale concentratie in de oplossing (willekeurige schaal). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7: T 2 foto's en de bijbehorende [O 2] waarden onder donker (links) en licht (rechts) omstandigheden.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

Dit protocol laat zien hoe ESR micro-imaging kan worden toegepast op de zuurstofconcentratie in de buurt wonen kleine monsters kaart. Een ruimtelijke resolutie van ~ 30 x 30 x 100 micrometer is aangetoond, met een bijna micromolair zuurstofconcentratie gevoeligheid en sub-femtomole absolute zuurstof gevoeligheid per voxel. Het gebruik van ESR micro-imaging voor zuurstof in kaart brengen van in de buurt van cellen een aanvulling op de thans beschikbare technieken op basis van micro-elektroden of fluorescentie / fosforescentie. Bovendien, met de juiste paramagnetische sonde, zal het gemakkelijker toepasbaar voor intracellulaire zuurstof micro-imaging, een mogelijkheid die andere methoden vinden heel moeilijk te bereiken. In de nabije toekomst zijn we van plan op het verder verbeteren van deze methodologie om te leven monster beelden te leveren met een resolutie van enkele microns, waardoor het contrast parameters, zoals superoxide concentratie, zuurgraad (pH), probe diffusiecoëfficiënt en, natuurlijk, de zuurstofconcentratie. Deze mogelijkheden zijn complementair aan de huidige optische-based methoden, zowel in termen van contrast soort en ook van de monsters kenmerken (bv. niet-transparante dikke monsters en in sommige gevallen, intracellulaire vs extracellulaire metingen).

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Pergedeutereerd triarylmethyl (trityl) radicaal</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Gesynthetiseerd in Novosibirsk met de methode beschreven in referentie &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>BG-11 buffer</td><td></td><td></td><td>Voor instructies voor de bereiding, zie Schema 1 en referenties 8, 9.</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet uitharding</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63, of NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

electron spin resonantie micro-imaging van live species voor zuurstof in kaart brengen

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Dit protocol beschrijft een elektron spin resonantie (ESR) micro-imaging methode voor driedimensionaal in kaart brengen van zuurstof in de directe omgeving van levende cellen met micron-schaal resolutie van 1. Zuurstof is een van de belangrijkste moleculen in de cyclus van het leven. Het dient als de terminale elektron acceptor van oxidatieve fosforylering in de mitochondriën en wordt gebruikt bij de productie van reactieve zuurstof species. Metingen van zuurstof van belang zijn voor de studie van mitochondriële en metabolische functies, signaalwegen, effecten van verschillende stimuli, membraanpermeabiliteit, en ziekte differentiatie. Zuurstofverbruik is dan ook een informatieve marker van cellulaire stofwisseling, die breed toepasbaar op verschillende biologische systemen van mitochondriën naar de cellen tot hele organismen. Vanwege het belang ervan, zijn vele methoden ontwikkeld voor het meten van zuurstof in levende systemen. Huidige pogingen om hoge-resolutie zuurstof imaging bieden zijn voornamelijk gebaseerd op optische fluorescentie en fosforescentie methoden die geen bevredigende resultaten geven als zij in dienst hebben sondes met een hoge foto-toxiciteit en een lage zuurstof-gevoeligheid. ESR, die het signaal van exogene paramagnetische sondes in de steekproef maatregelen, is bekend om zeer nauwkeurige metingen van de zuurstofconcentratie te bieden. In een typisch geval, ESR metingen kaart brengen van de sonde lineshape verbreding en / of ontspanning-time verkorten die rechtstreeks verband houden met de lokale zuurstofconcentratie. (Oxygen is paramagnetisch, daarom, bij botsen met de exogene paramagnetische sonde, het kortademigheid haar relaxatietijden.) Traditioneel, dit soort experimenten worden uitgevoerd met een lage resolutie, millimeter-schaal ESR voor kleine dieren beeldvorming. Hier hebben we laten zien hoe ESR beeldvorming ook kan worden uitgevoerd in het micron-schaal voor het onderzoek van kleine live-samples. ESR micro-imaging is een relatief nieuwe methode die het verwerven van ruimtelijk-opgelost ESR-signalen met een resolutie nadert een micron bij kamertemperatuur 2 mogelijk maakt. Het voornaamste doel van dit protocol-paper is te zien hoe deze nieuwe methode, samen met de nieuw ontwikkelde zuurstof-gevoelige probes, kunnen worden toegepast op het in kaart brengen van het zuurstofgehalte in kleine live-samples. Een ruimtelijke resolutie van ~ 30 x 30 x 100 micrometer is aangetoond, met een bijna micromolair zuurstofconcentratie gevoeligheid en sub-femtomole absolute zuurstof gevoeligheid per voxel. Het gebruik van ESR micro-imaging voor zuurstof in kaart brengen van in de buurt van cellen een aanvulling op de thans beschikbare technieken op basis van micro-elektroden of fluorescentie / fosforescentie. Bovendien, met de juiste paramagnetische sonde, zal het ook goed toepasbaar voor intracellulaire zuurstof micro-imaging, een mogelijkheid die andere methoden vinden heel moeilijk te bereiken.

Dit protocol beschrijft een methode voor micronschaal drie-dimensionale beeldvorming van zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen door electron spin resonantie microscopie.

Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

Dit protocol beschrijft een methode voor elektronenspinresonantie (ESR) micro-imaging voor driedimensionale mapping van zuurstofniveaus in de directe omgeving ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het verkrijgen van driedimensionale beelden op micron-schaal van de zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen middels elektronenspinresonantie (ESR)-microscopie. Het protocol wordt gedemonstreerd met cyanobacteriën, wat veelvoorkomende fotosynthetische cellen zijn. Dit wordt bereikt door eerst een monster van cyanobacteriëncellen voor te bereiden in de monsterhouder voor ESR-microscopie.Ingebed in een stabiele organische radicaaloplossing. De monsterhouder wordt in de beeldvormingsprobe geplaatst, die vervolgens in de statische elektromagneet van het ESR-microscoopsysteem wordt geschoven. Vervolgens worden met de ESR-microscoop meerdere driedimensionale ESR-microbeelden van de organische radicaaloplossing verkregen.Dit wordt uitgevoerd voor verschillende varianten van pulsequenties en vaak onder diverse externe condities, zoals onder licht- en donkeromstandigheden. Vervolgens worden de ruwe databeelden door de computer verwerkt om de driedimensionale, ruimtelijk opgeloste relaxatietijden van het radicaal te extraheren. Deze relaxatietijden bieden via een vooraf bestaande kalibratie een directe maat voor de zuurstofconcentratie, wat leidt tot volledige driedimensionale zuurstofkaarten van de gemeten monsters onder verschillende externe condities.Er zijn resultaten verkregen die duidelijk aantonen dat er geen zuurstof wordt geproduceerd door de cyanobacteriën wanneer er geen licht wordt toegepast. Bovendien wordt aangetoond dat er onder lichtbestraling een significante zuurstofgradiënt en zuurstofheterogeniteit ontstaan nabij de cellen van de cyanobacteriën. Hallo, ik ben al van het laboratorium van BLA in de S Faculteit Scheikunde aan het Technion, het Israel Institute of Technology in Haifa.Vandaag tonen we u een procedure voor het in drie dimensies in kaart brengen van zuurstofconcentraties nabij levende cellen met een hoge ruimtelijke resolutie middels fluorescence lifetime imaging microscopy. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de zuurstofconsumptiesnelheid en de metabole activiteit van cellen te bestuderen. Laten we beginnen.Elektronenspinresonantie of ESR is een spectroscopische techniek waarbij elektromagnetische straling met een specifieke frequentie wordt geabsorbeerd door paramagnetische soorten met een ongepaarde elektronenspin die zijn geplaatst in een extern statisch magnetisch veld. Het is een krachtige methode voor het bestuderen van de omgeving van paramagnetische moleculen in levende organismen, waaronder de concentraties van zuurstof en reactieve zuurstofverbindingen. Hier wordt een typisch beeld van de zuurstofconcentratie van een tumorhoudende muis getoond voor heterogene monsters.ESR-spectrale informatie kan op ruimtelijk opgeloste wijze worden verkregen door gebruik te maken van magnetische veldgradiënten. Een stabiel, vrij organisch radicaal werd in de muis geïnjecteerd en de ESR-kenmerken hiervan geven de zuurstofconcentratie in de omgeving weer. De op ESR gebaseerde resultaten zijn overgeplaatst op een MRI-anatomisch beeld.Tot nu toe werden dergelijke ESR-beeldvormingstechnieken van levende specimens slechts uitgevoerd met relatief grote monsters op millimeterschaal. Resolutie-ESR-microscopie omvat metingen van monsters met een grootte van een millimeter of submillimeter, waardoor driedimensionale ESR-beelden worden verkregen met een resolutie die één micron nadert.Hier zijn twee voorbeelden van ESR-beelden op micronschaal met een hoge resolutie, van een gegenereerd monster met NNC 60-poeder en paramagnetische lithiumcyanoferraatkristallen. Een ESR-microscoop lijkt op een conventionele ESR-spectrometer en beschikt over een magneet voor het genereren van het statische veld, een microgolfsysteem voor spin-excitatie en signaaldetectie, een probe voor het vasthouden van het monster en een computergestuurde console om het acquisitieproces en de gegevensverwerking te regelen. Andere componenten van het systeem zijn magnetische veldgradiëntdrivers, die deel uitmaken van het elektronische systeem, en gradiëntspoelen die zich in de imaging-probe bevinden.De gradiëntspoelen hebben ook een opening om lichtbestraling van het monster mogelijk te maken. Er wordt vochtige lucht met een gecontroleerde temperatuur op het monster toegepast om minimale dehydratie tijdens het experiment te waarborgen. De belangrijkste unieke kenmerken van ESR-microscopie zijn de geringe afmetingen van de probe en de gradiëntspoelen, de hogere spingevoeligheid van het systeem en de hoge sterkte van de magnetische veldgradiëntsturingen. Bereid vóór aanvang van deze procedure een suspensie van cyanobacteriën voor met een concentratie van 40 mg/mL.Om te beginnen met de monsterpreparatie voor ESR-micro-imaging, neem dan met een fijne pincet een paar vierkantjes absorberend papier van ongeveer 400 bij 400 micron. Plaats deze vervolgens in een Eppendorf-buisje. Vul het buisje daarna met 1,2 milliliter van de cyanobacteriën-suspensie.Centrifugeer de suspensie vervolgens gedurende twee minuten bij 6.000 RPM in een microcentrifuge. Verwijder na centrifugatie het supernatant volledig, behalve ongeveer 50 µL, dat wordt achtergelaten om dehydratatie van de cyanobacteriën te voorkomen. Dit proces resulteert in de verzadiging van het absorptiepapier met de cyanobacteriëncellen. Bereid vervolgens een speciaal geprepareerde bekerglasvormige monsterhouder voor, extraheer met een fijne pincet enkele vezels uit het papier en plaats deze op de bodem van de monsterhouder.Voeg daarna drie millimolaire tridel en BG 11-oplossing toe, bereid zoals beschreven in het schriftelijke protocol, met een spuit van acht. Sluit vervolgens de monsterhouder af met UV-uithardende lijm door de lijm aan te brengen tussen de randen van de glazen monsterhouder en het bijbehorende dekglas, waarbij een kleine luchtuitlaat open blijft. Hard vervolgens de lijm twee seconden uit met UV-licht.Om het beeldvormingsexperiment te starten, schakelt u het ESR-micro-beeldvormingssysteem in en plaatst u het monster in de resonator die zich in de beeldvormingsprobe bevindt. Gebruik nu de computerbesturingssoftware om het systeem in de tune-modus te zetten en bepaal de resonantie-microgolfrequentie van de probe, die gebruikt zal worden voor de ESR-metingen. Stel vervolgens het statische magnetische veld in op de waarde die overeenkomt met de toegepaste microgolfrequentie.Stel de timingparameters voor de pulsequentie in en observeer het ESR-signaal om te controleren of het systeem goed functioneert en het monster correct is voorbereid. Stel vervolgens de beeldparameters in, zoals het aantal pixels, de sterkte van de gradiënten en de lengte van de gradiëntpulsen, op de vereiste waarden. Verzamel na de configuratie drie 3D ESR-beelden met een Han Echo Imaging-pulsequentie met interpuls-scheidingswaarden tau van 500 600 en 700 nanoseconden.Zet op dit punt de lichtprojectie op het monster in indien dit vereist is voor de experimentele condities gedurende de acquisitie; de gegevens worden automatisch opgeslagen. Na het proces van data-acquisitie worden de ruwe databestanden via een MATLAB-softwareطscript verwerkt. Genereer met behulp van de software afbeeldingen van de concentratie van het trill-radicaal en de relaxatietijd.T twee kaart vervolgens deze beelden via een bestaande kalibratiecurve die de zuurstofconcentratie koppelt aan de relaxatietijd om naar een zuurstofconcentratiebeeld te vertalen. Hier is T twee nul de spin-spin-relaxatietijd van de probe onder anoxische omstandigheden, afhankelijk van de concentratie C van de probe en de diffusiecoëfficiënt D ervan. Typische ruwe data-beelden van verschillende driedimensionale ESR-beeldvormingsexperimenten uitgevoerd op cyanobacteriën worden getoond. Deze beelden zijn verkregen met verschillende tau-waarden onder respectievelijk donkere of lichte omstandigheden.Onder donkere omstandigheden zijn de resultaten zeer vergelijkbaar, behalve voor de afgenomen intensiteit bij grotere T-waarden als gevolg van de spin-spin-relaxatietijd T₂. Omgekeerd verandert onder lichtbestraling het beeldpatroon door de verschillende relaxatietijden in het monster. Deze gegevens worden vervolgens verwerkt om een amplitudebeeld uit dit beeld te verkrijgen.Het is duidelijk dat de cyanobacteriën zich voornamelijk aan de rechterkant van de monsterhouder bevinden. De twee afbeeldingen worden omgezet in zuurstofconcentratiewaarden via een bestaande kalibratiecurve die de zuurstofconcentratie koppelt aan de relaxatietijd. De resultaten worden getoond voor cyanobacteriën in aanwezigheid en afwezigheid van licht.Het is duidelijk dat de zuurstofproductie wordt geïnitieerd door licht en leidt tot een significante toename van de zuurstofconcentratie in de oplossing. Dit leidt tot een afname van het radicaal T twee, voornamelijk in de voxels nabij de absorberende papiervezels met de cyanobacteriën. We hebben u zojuist laten zien hoe u een monster voorbereidt met levende cellen en een stabiel vrij radicaal voor het in kaart brengen van de zuurstofconcentratie middels E ES R-microscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden deze zo kort mogelijk te houden om S-variabiliteit te waarborgen en degradatie van het monster te voorkomen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze techniek maakt het gebruik van hoge-resolutie magic angle spinning proton MR spectroscopie (HRMAS 1H-MRS) voor de moleculaire karakterisering van...

Magnetische Resonantie Spectroscopie van leven Drosophila melanogaster Met behulp van Magic Angle Spinning

Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd gebruikt om stikstofoxide te detecteren van runderen aorta endotheelcellen en superoxide radicaal anion van menselijke neutrofielen met behulp van ijzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe...

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.

Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven het gebruik van een nieuwe, frequentie-domein luminescentie Lifetime camera voor het in kaart brengen van 2D O2 -distributies met optische sensor folies. Het camerasysteem en beeldanalyse procedures worden beschreven samen met de voorbereiding, kalibratie en toepassing van sensor folies voor het visualiseren van de O2 micro-omgeving in de rizosfeer van waterplanten.

Luminescentie Lifetime beeldvorming van O2 met een op frequentiedomein gebaseerd camera systeem

Het protocol beschrijft high-throughput sferoïde generatie voor bioprinting met behulp van de multi-parametrische analyse van hun oxygenatie en celdood op een standaard fluorescentiemicroscoop. Deze aanpak kan worden toegepast om de levensvatbaarheid van de sferoïden te controleren en standaardisatie uit te voeren, wat belangrijk is bij het modelleren van 3D-weefsel, tumormicro-omgeving en succesvolle (micro)weefselbiofabricage.

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Kwantitatieve 3D-zuurstofkaarten van muizentumoren werden niet-invasief in beeld gebracht met behulp van Pulse Electron Paramagnetic Resonance. Echografie B-modus en Power Doppler werden gebruikt voor anatomie en vasculaire structuur. Beelden van beide modaliteiten werden over elkaar heen gelegd, waardoor multiparametrische tumoranalyse mogelijk werd.

Beoordeling van tumorhypoxie: in vivo 3D-zuurstofbeeldvorming door middel van paramagnetische resonantie met elektronen 

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Leer elektronspinresonantie-microscopie voor driedimensionale zuurstofmapping bij levende cyanobacteriën. Deze methode maakt micron-schaalbeeldvorming van zuurstofconcentraties mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

Meer video's verkennen