Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel
26 oktober 2010
De ziekte van Parkinson is gerelateerd aan de blootstelling aan pesticiden. Hier laten we een methode om pesticiden met behulp van een maagsonde in de gewenste concentratie en een methode om het effect te analyseren in de alfa-synucleïne accumulatie in het enterisch zenuwstelsel te leveren.
De symptomen van de ziekte van Parkinson, inclusief motorische en spraakstoornissen, zijn het gevolg van verminderde activiteit van dopamine-afscheidende cellen in de hersenen. Het enterische zenuwstelsel en de reukbol zijn de meest blootgestelde zenuwstructuren en de eersten die worden aangetast. De ziekte van Parkinson is in verband gebracht met blootstelling aan pesticiden.
Om de effecten van pesticiden op het enterische zenuwstelsel te analyseren, wordt het pesticide roone via orale sondevoeding aan muizen toegediend. De muizen worden vervolgens intracardiac geperfundeerd met 4% paraformaldehyde, hersenen en enterisch zenuwstelsel. Het weefsel wordt geëxtraheerd, voorbereid en geïmmunokleuring voor de PD-geassocieerde eiwitten.
Beeldvorming van bèta-drie-tubuline en alfa-synucleïne verkregen door confocale microscopie toont de accumulatie van alfa-synucleïne in neuronen van het enterische zenuwstelsel bij met pesticiden blootgestelde dieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals systemische toediening van rotenon, is dat met deze techniek wordt gegarandeerd dat het effect van rotenon beperkt blijft tot het enterische zenuwstelsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de ziekte van Parkinson, zoals de etiologie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie ervan.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie en diagnose van de ziekte van Parkinson omdat ze de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen en diagnostische methoden zullen mogelijk maken. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de studie van het effect van andere omgevingstoxines op het enterische, sympathische en parasympathische zenuwstelsel, evenals de darmwand. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden worstelen omdat het enige tijd duurt om de sondevoeding onder de knie te krijgen.
Ik kreeg het idee voor deze methoden voor het eerst toen ik las over de link tussen pesticiden en de ziekte van Parkinson. Het was ook nuttig om de hoge CORAs-conferentie te zien op het World Parkinson Congress in Berlijn in 2005. Vreedzame demonstratie van deze methode is noodzakelijk.
De methode om ol met de sondevoeding toe te dienen is moeilijk omdat muizen een andere anatomie hebben dan mensen. Aan de andere kant werd beeldanalyse uitgevoerd met aangepaste stappen voor deze beelden. Begin het protocol door het dier te wegen. Bereken het juiste volume rotenon.
Er zijn 0,01 milliliter nodig per gram lichaamsgewicht van het dier, wat overeenkomt met een dosis van vijf milligram per kilogram rotenon. Laad een steriele 1 ml spuit met de rotenonoplossing en laad vervolgens een tweede spuit met voertuig oplossing. Pak de muis op en houd de staart van de muis met één hand vast.
Trek de huid van de nek uit door hem met de eerste twee vingers van de andere hand te trekken. Zodra het hoofd tussen de twee vingers vastzit, leun het tegen de palm van de hand en draai het ondersteboven. Bevestig de staart.
Gebruik de vierde en vijfde vingers, houd het hoofd naar achteren gericht en druk op het gehemelte om de muis zijn mond te openen. Breng de sonde voorzichtig in de mond. Beweeg de sonde langzaam in de richting van de maag totdat deze volledig is ingebracht.
Om te voorkomen dat materiaal in de longen terechtkomt, dient de rotenonoplossing of voertuig toegediend te worden door voorzichtig op de embolus te drukken. Wanneer dit is voltooid, trekt u de sonde langzaam terug, plaatst u het dier terug in een andere kooi totdat alle dieren uit één kooi zijn afgehandeld. Na de behandeling worden de muizen intracardiac geperfundeerd met 4% paraformaldehyde.
In PBS worden de darmen vervolgens door dissectie geëxtraheerd en gedurende een nacht in 15% sucrose geplaatst. De volgende dag wordt het weefsel overgebracht naar 30% sucrose en opnieuw gedurende een nacht geïncubeerd bij vier graden Celsius. Het weefsel wordt vervolgens in een vriezer op minus 80 graden Celsius bewaard tot gebruik. Met behulp van een cryostaat wordt 20 micrometer darm gebruikt.
Dwarsdoorsneden worden overgebracht naar rost-dia's, blokkeer- en immunokleuringsprocedures. Met behulp van anti-bèta-drie-tubuline en anti-alfa-synucleïne-antilichamen worden vervolgens uitgevoerd. Het wordt aanbevolen dat een externe persoon een blinde analyse van de gegevens uitvoert.
Om de analyse te beginnen, opent u de Fiji-software. Open het confocale beeldbestand. Splits vervolgens de kanalen zodat u zoveel mogelijk onafhankelijk op elk kanaal kunt werken.
Sluit de kanalen die niet zullen worden gebruikt en selecteer, analyseer, instel, schaal en stel de pixelgrootte in op één. Stel de bekende afstand in op 0,13 en klik op globaal. De grootte van het beeld wordt nu weergegeven in micrometer.
Selecteer het alfa-synucleïnekanaal en selecteer ganglion. Zorg ervoor dat de selectie het ganglion in alle plakjes omsluit. Dupliceraat het beeld met het geselecteerde ganglion. Alleen een beeld van de grootte van het ganglion zal worden gedupliceerd.
Druk op bewerken wissen buiten het deel van het beeld buiten het geselecteerde gebied wordt zwart. Dupliceraat het beeld opnieuw om te bepalen hoe goed de procedure is verlopen. Beelden met een laag signaal-ruisverhouding mogen niet worden gebruikt voor beeldanalyse.
Selecteer beeld, pas drempelwaarde aan. Selecteer vervolgens max entropie. Beweeg vervolgens over de plakjes in het bijgesneden beeld en het originele om ervoor te zorgen dat de procedure goed is verlopen.
De tropische drempel selecteert een intensiteitssignaalniveau op basis van de beeldhistogram en alleen die pixels met intensiteiten hoger dan deze drempel worden weergegeven in een wit op zwart beeldselectieproces. Klik vervolgens op glad. Deze stap transformeert de pixelranden van de beelden in gladde randen selectieproces.
Klik vervolgens op binair en kies Make binary. Het beeld wordt weergegeven als een zwart-witbeeld.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de relatie tussen blootstelling aan pesticiden en de ziekte van Parkinson, met de nadruk op de effecten op het enterische zenuwstelsel. Er wordt een methode gepresenteerd voor het toedienen van pesticiden via een maagsonde en het analyseren van de accumulatie van alpha-synucleïne.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Neurotoxicologie
- Onderzoek naar de ziekte van Parkinson
Achtergrond
- Symptomen van de ziekte van Parkinson ontstaan door een verminderde dopamineactiviteit.
- Het enterische zenuwstelsel behoort tot de eerste gebieden die door de ziekte worden getroffen.
- Blootstelling aan pesticiden is gekoppeld aan het begin van de ziekte van Parkinson.
- Inzicht in de impact van pesticiden op neurale structuren is cruciaal voor de ontwikkeling van preventieve strategieën.
Doel van de studie
- Om de effecten van pesticiden op het enterisch zenuwstelsel te analyseren.
- Om een methode vast te stellen voor de nauwkeurige toediening van pesticiden in onderzoek.
- Om de accumulatie van alfa-synucleïne als marker voor de ziekte van Parkinson te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Toediening van het bestrijdingsmiddel roone aan muizen via orale gavage.
- Intracardiale perfusie van muizen met 4% paraformaldehyde.
- Tissue-extractie en voorbereiding voor analyse.
- Immunokleuring voor eiwitten geassocieerd met de ziekte van Parkinson.
Belangrijkste resultaten
- Een methode voor de toediening van pesticiden gedemonstreerd om de effecten ervan te bestuderen.
- Veranderingen in de accumulatie van alpha-synucleïne in het enterische zenuwstelsel geïdentificeerd.
- Inzichten verschaft in de neurotoxische effecten van pesticiden.
- De relevantie van het enterische zenuwstelsel in onderzoek naar de ziekte van Parkinson benadrukt.
Conclusies
- Blootstelling aan pesticiden kan bijdragen aan de pathogenese van de ziekte van Parkinson.
- De ontwikkelde methoden kunnen verder onderzoek in de neurotoxicologie faciliteren.
- Het begrijpen van deze mechanismen is essentieel voor preventie- en behandelstrategieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt gericht onderzoek mogelijk naar de effecten van omgevingsneurotoxines op het enterische zenuwstelsel, een cruciale vroege locatie in de pathogenese van de ziekte van Parkinson. Door lokale effecten te isoleren zonder systemische blootstelling, ondersteunt deze methode mechanische risicoreductie bij de validatie van targets voor neuroprotectieve strategieën. De aanpak biedt een reproduceerbaar model voor het screenen van door pesticiden geïnduceerde alpha-synucleïne-pathologie, wat bijdraagt aan preklinische risicobeoordelingen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de hypothese datv milieutoxines alfa-synucleïne pathologie in het ENS triggeren.
- Operationele waarde: Garandeert dat de werking van de verbinding beperkt blijft tot het ENS, waardoor storende variabelen in studies naar target engagement worden verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten van het oppervlak van alpha-synucleïne en de dichtheid van inclusies, genormaliseerd naar de grootte van het ganglion.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van semi-geautomatiseerde beeldanalyse met drempelwaarde-bepaling op basis van entropie voor reproduceerbare, schaalbare kwantificering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert de progressieve accumulatie van alpha-synucleïne van punctate patronen naar grotere inclusies in de loop van de tijd.
- Operationele waarde: Maakt tijdreeksstudies mogelijk om therapeutische interventievensters in synucleïnopathie-modellen te beoordelen.
Integratie van pipeline en workflow
Deze workflow ondersteunt vroege ontdekking door een ziekterelevant systeem te bieden om blootstelling aan environmental toxines te testen voordat men overgaat naar bredere neuro-inflammatoire of dopaminerge modellen.
- Discovery Biology: Test mechanistische verbanden tussen blootstelling aan pesticiden en synucleïne-aggregatie in een compartiment van het perifere zenuwstelsel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare immunohistochemische resultaten voor de vergelijking van het effect van verbindingen.
- Analytics: Levert genormaliseerde waarden voor de alpha-synucleïne-last en het aantal inclusies voor dosis-responsvariabelen en kinetische analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ENS-pathologie en modellen voor progressie van het centrale zenuwstelsel bij de ziekte van Parkinson.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Aanpasbaar aan andere neurotoxinen en doelwitten in het gastro-intestinale zenuwstelsel buiten rotenon.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door ENS-specifieke effecten van neurotoxische blootstelling te isoleren.
- Operationele waarde: Combineert nauwkeurige toediening via sonde met gevalideerde immunokleuring en beeldanalyse voor consistente resultaten.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen over omgevingsrisicofactoren in portfolio's voor neurodegeneratieve ziekten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt inspanningen voor biomarker-kwalificatie voor vroege detectie van synucleïnopathieën.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van knaagdieren, de gavage-techniek en confocale microscopie.
- Afhankelijk van HPLC-validatie om de afwezigheid van systemische blootstelling aan de verbinding te bevestigen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor weefselfixatie, coupesnijden en immunokleuring over verschillende batches.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de identificatie van ganglia en de instellingen voor beelddrempelwaarde (thresholding).
- Beperkt tot eindpunten die via immunohistochemie beoordeelbaar zijn; niet geschikt voor real-time functionele read-outs.
