Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

De symptomen van de ziekte van Parkinson, waaronder motorische stoornissen en spraakdefecten, zijn het gevolg van een verminderde activiteit van dopamine-secreterende cellen in de hersenen. Het enterisch zenuwstelsel en de bulbus olfactorius zijn de meest blootgestelde zenuwstructuren en de eerste die worden aangetast. De ziekte van Parkinson is in verband gebracht met blootstelling aan pesticiden.

Om de effecten van pesticiden op het enterische zenuwstelsel te analyseren, wordt het pesticide roone via orale gavage toegediend aan muizen. De muizen worden vervolgens intracardiaal geperfuseerd met 4%paraform aldehyde voor de fixatie van de hersenen en het enterische zenuwstelsel. Het weefsel wordt geëxtraheerd, geprepareerd en immunogekleurd voor de met PD geassocieerde eiwitten.

Afbeeldingen van bèta-tubuline III en alfa-synucleïne verkregen via confocale microscopie tonen de accumulatie van alfa-synucleïne aan binnen neuronen van het enterische zenuwstelsel bij dieren die zijn blootgesteld aan pesticiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals systemische toediening van rotenon, is dat met deze techniek wordt gegarandeerd dat het effect van rotenon beperkt blijft tot het enterische zenuwstelsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ziekte van Parkinson, zoals de etiologie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie ervan.

De implicaties van deze techniek reiken verder dan de therapie en diagnose van de ziekte van Parkinson, omdat ze de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelwitten en diagnostische methoden mogelijk maken. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de studie naar het effect van anderestoxische omgevingsfactoren op het enterische, sympathische en parasympathische zenuwstelsel, alsook op de darmwand. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methoden moeite hebben, omdat het enige tijd kost om de gavage onder de knie te krijgen.

Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methoden toen ik las over de link tussen pesticiden en de ziekte van Parkinson. Het was ook nuttig om de conferentie van high CORAs bij te wonen tijdens het World Parkinson Congress in Berlijn in 2005. Een rustige demonstratie van deze methode is noodzakelijk.

De methode om ol via gavage toe te dienen is moeilijk omdat muizen een andere anatomie hebben dan mensen; daarnaast is de beeldanalyse uitgevoerd met aangepaste stappen voor deze afbeeldingen. Begin het protocol met het wegen van het dier. Bereken het juiste volume rotenon.

Er is 0,01 milliliters nodig per gram lichaamsgewicht van het dier, wat overeenkomt met een dosis roone van vijf milligram per kilogram. Vul een spuit van één milliliter met de roone-oplossing en vul vervolgens een tweede spuit met de vehicle-oplossing. Pak de muis op en houd de staart van de muis met één hand vast.

Span de huid van de nek door deze met de eerste twee vingers van de andere hand weg te trekken. Zodra de kop tussen de twee vingers is gefixeerd, wordt deze tegen de handpalm geleund en ondersteboven gedraaid. Fixeer de staart.

Druk met de ringvinger en de pink, terwijl de kop naar achteren wordt gehouden, op het gehemelte om de bek van de muis te openen. Voer de sonde voorzichtig in de bek in. Beweeg de sonde langzaam in de richting van de maag totdat deze volledig is ingebracht.

Om te voorkomen dat er materiaal in de longen terechtkomt, dient de roone-oplossing of het vehikel te worden toegediend door voorzichtig op de embolus te drukken. Trek na voltooiing de sonde langzaam terug en plaats het dier terug in een andere kooi totdat alle dieren uit één kooi zijn behandeld. Na de behandeling worden de muizen intracardiaal geperfuseerd met 4%paraform aldehyde.

In PBS worden de darmen vervolgens door dissectie verwijderd en gedurende de nacht in 15% sucrose geplaatst. De volgende dag wordt het weefsel overgebracht naar 30% sucrose en opnieuw een nacht geïncubeerd bij vier graden Celsius. Het weefsel wordt vervolgens in een vriezer van minus 80 graden Celsius geplaatst en bewaard tot gebruik. Met behulp van een cryostaat worden coupes van 20 micron van de darm gemaakt.

Dwarsdoorsneden worden overgebracht naar objectglazen, waarna blokkerings- en immunokleuringprocedures worden uitgevoerd. Hiervoor worden anti-beta drie tubuline- en anti-alfa synucleïne-antilichamen gebruikt. Het wordt aanbevolen dat een externe persoon een blinde analyse van de gegevens uitvoert.

Om met de analyse te beginnen, opent u de Fiji-software. Open het confocale afbeeldingsbestand. Splits vervolgens de kanalen, zodat het mogelijk is om elk kanaal onafhankelijk te bewerken.

Sluit de kanalen die niet worden gebruikt en selecteer vervolgens 'analyze', 'set', 'scale' en stel de pixelgrootte in op één. Stel de bekende afstand in op 0.13 en klik op 'global'. De afmeting van de afbeelding wordt nu weergegeven in microns.

Selecteer het alpha-synucleïne-kanaal en selecteer het ganglion. Zorg ervoor dat de selectie het ganglion in alle coupes omsluit. Dupliceer het beeld met alleen het geselecteerde ganglion; er wordt een beeld gedupliceerd met de afmetingen van het ganglion.

Druk op bewerken; het gedeelte van de afbeelding buiten de geselecteerde regio wordt zwart. Dupliceer de afbeelding opnieuw om te bepalen hoe succesvol de procedure was. Afbeeldingen met een lage signaal-ruisverhouding mogen niet worden gebruikt voor beeldanalyse.

Selecteer image adjust threshold. Selecteer vervolgens max entropy. Ga daarna door de coupes van de bijgesneden afbeelding en de originele afbeelding om te controleren of de procedure correct is verlopen.

De tropische drempelwaarde selecteert een intensiteitssignaalniveau op basis van het beeldhistogram, waarbij alleen pixels met intensiteiten boven deze drempelwaarde worden weergegeven in een wit-op-zwart selectieproces. Klik vervolgens op gladstrijken. Deze stap transformeert de gepixelde randen van de beelden naar gladde randen in het selectieproces.

Klik vervolgens op 'binary' en kies 'Make binary'. De afbeelding wordt weergegeven als een zwart-witafbeelding; om de volgende stap op de gedupliceerde afbeelding uit te voeren, klikt u op 'analyze' en vervolgens op 'analyze particles'. Selecteer daarna 'show outlines' en klik op 'summarize'.

De overige instellingen kunnen op de standaardwaarden blijven staan. Deze functie herkent het totaal aantal pixels met een signaal en groepeert deze tot het totale oppervlak van pixels met signaal. Daarnaast worden het aantal pixelgroepen en de gemiddelde grootte gerapporteerd.

Vergelijk en selecteer de coupes met het grootste totale oppervlak dat goed is aangepast. De coupe wordt gemarkeerd. Kopieer de datatabel met het totale alpha synuclein oppervlak, het aantal inclusies en de gemiddelde partikelgrootte.

Plak de gegevens in een Excel-spreadsheet of noteer deze elders. Keer terug naar Fiji. Zoek de eerder geselecteerde slice in het bètatubuline-kanaal en selecteer deze.

Selecteer het gangliongebied en klik op analyze. Selecteer vervolgens measure. Er verschijnt een andere tabel waarin het totale oppervlak van het ganglion wordt weergegeven.

Exporteer de gegevens uit de tabel naar een Excel-spreadsheet nabij de meting van alfa-synucleïne of kopieer deze elders naar Excel. Deel de verschillende parameters die zijn verkregen bij de meting van alfa-synucleïne door het ganglioppervlak om het totale alfa-synucleïne-oppervlak en het aantal inclusies genormaliseerd naar de grootte van het ganglion te verkrijgen. Om de effecten van rotenon dat lokaal inwerkt op het enterische zenuwstelsel te analyseren, werd 5 mg/kg van het pesticide rotenon toegediend via orale gavage aan 1 jaar oude C57BL/6 muizen. Het hier getoonde chromatogram laat de aanwezigheid van een rotenonpiek zien één uur na toediening; controlemuizen werden behandeld met 20 mg/kg rotenon en 5 mg/kg rotenon.

Rotenonspiegels in bloed- en hersen- en hersenstamextracten werden bepaald middels HPLC, zoals hier wordt getoond. Toediening van vijf milligram per kilogram rotenon via orale gavage resulteert niet in meetbare spiegels in het bloed één, twee of drie uur na de behandeling, zoals bepaald door HPLC. Deze grafiek toont de rotenonspiegels in de hersenen en de hersenstam van behandelde muizen.

Eén uur na toediening van 10 milligram per kilogram of minder rotenon werden geen rotenonspiegels aangetroffen in hersen- of hersenstammonsters. Eén uur na toediening werd de activiteit van mitochondriaal complex I beoordeeld in spier- en hersenmonsters van muizen van 1,5 maand die waren behandeld. Er is geen significant verschil tussen de groepen, wat wijst op geen inhibitie van mitochondriaal complex I, waarmee wordt bevestigd dat er geen rotenon in deze regio's aanwezig was.

Analyse van alpha-synucleïne, een component van Lewy-lichaampjes bij de ziekte van Parkinson, na toediening van rone maakt een betrouwbare bepaling mogelijk van de totale hoeveelheid alpha-synucleïne aan het oppervlak, de aanwezigheid van alpha-synucleïne-inclusies en het alpha-synucleïne-patroon in de cel. Deze figuur toont anti-beta-tubuline 3, alpha-synucleïne en DAPI-kleuring in coupes van het duodenum en ileum, zoals hier te zien is. Een behandeling van 1,5 maand met roach induceerde een verhoogd punctaat patroon van alpha-synucleïne binnen de ganglia van het enterisch zenuwstelsel, zelfs vergeleken met controles van drie maanden.

Dit patroon kan worden waargenomen in zowel het ileum als het duodenum. Na drie maanden behandeling is de vorming van grotere alfa-synucleïne-inclusies zichtbaar; immunofluorescentiekleuring met anti-alfa-synucleïne, theof, flavine en DPI toont aggregatie van grotere alfa-synucleïne-accumulaties alleen na drie maanden aan. Dit experiment is geanalyseerd met behulp van automatische segmentatie en entropie-gebaseerde drempelwaarde-methoden.

In de grafiek links stelt elke kolom de totale verhouding van alfa-synucleïne-oppervlak ten opzichte van het ganglionoppervlak voor. In de grafiek rechts stelt elke kolom het totale aantal alfa-synucleïne-inclusies per genomen ganglionoppervlak voor. Samen suggereren deze gegevens dat lokale toediening van rotenone leidt tot fosforylering, accumulatie en aggregatie van alfa-synucleïne met gliose in ganglia van het enterische zenuwstelsel. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, indien correct uitgevoerd, in één minuut per dier worden voltooid.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de sonde voorzichtig in te brengen; indien er obstructies worden aangetroffen, is het raadzaam deze te verwijderen en opnieuw in te brengen volgens deze stappen. Andere methoden zoals HPLC, immunokleuring en beeldanalyse kunnen worden toegepast. Dit maakt het mogelijk om andere regio's, de effecten van de stof, of zelfs de aanwezigheid van de stof in het bloed na ontwikkeling te analyseren.

Deze techniek maakte de weg vrij voor neurowetenschappers om de effecten van omgevingsneurotoxinen op het enterische zenuwstelsel te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om de gauge correct toe te passen en de beelden uit de immunochemie te analyseren. Vergeet niet dat het werken met rotten extreem gevaarlijk kan zijn.

Daarom raden wij het gebruik van handschoenen en maskers aan tijdens het uitvoeren van deze procedure.