Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Het algemene doel van deze procedure is om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in bilayer-eigenschappen te meten, zoals waargenomen door bilayer-overspannende eiwitten. Dit wordt bereikt door eerst fluor-geladen, grote unilamellaire vesicles te maken. De tweede stap van de procedure is het dopen van de vesicles met gramine.

De derde stap van de procedure is het toevoegen van een externe quencher en het meten van de quenchingsnelheid van de interne fluoro.Vier. De laatste stap van de procedure is het kwantificeren van de verandering in fluoro-quenching per gramin-activiteit door een gestrekte exponentiële functie te fitten aan het fluorescentietijdverloop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen om te evalueren of amfi-bestanden de eigenschappen van de lipide dubbellaag kunnen veranderen.

Hallo, ik ben Ola Anderson. Hallo, ik ben Helson. Hoi, ik ben Richie Kapo.

En ik ben Leah Sanford van het laboratorium van Dr. Olaf Anderson van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan het Weill Cornell Medical College. Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van veranderingen in de eigenschappen van lipidendubbellagen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de effecten van geneesmiddelen en kleine moleculen op de eigenschappen van lipidendubbellagen te bestuderen.

Laten we beginnen. Verwijder op de eerste dag van deze procedure de lipide uit de vriezer en laat deze equilibreren naar kamertemperatuur. Zodra de equilibratie is voltooid, voegt u 0,6 milliliter van een lipide- en chloroformoplossing van 25 milligram per milliliter toe aan een ronde bodemkolf van 25 milliliter. Droog vervolgens de oplossing onder stikstofgas terwijl de kolf continu wordt geroteerd, totdat al het chloroform is verdampt.

En een dunne witte lipidefilm bedekt de gehele onderste helft van de kolf; droog de lipiden verder in een desiccator onder vacuüm gedurende de nacht. Bereid een oplossing van 100 millimolair natriumnitraat, 25 millimolair ANTS en 10 millimolair HEPES met een pH van zeven. Vermijd bij het aanpassen van de pH van deze oplossing alle chloridebevattende oplossingen.

Aangezien de thallium-quencher op dag twee een onoplosbaar complex vormt met het chloride, rehydrateer de lipiden in 1,67 milliliter van deze elektrolytoplossing om een lipidesuspensie van 10 millimolair te verkrijgen. Zodra de juiste concentratie is bereikt, dek de suspensie af met parafilm en vortex deze grondig; bescherm het monster tegen licht met aluminiumfolie en laat het gedurende de nacht bij kamertemperatuur rijpen.

Sonicate het mengsel op dag drie gedurende één minuut met een sonicator op laag vermogen. Voer vervolgens een vries-dooi-cyclus uit door het monster vijf minuten op droogijs te plaatsen, gevolgd door vijf minuten in warm water; herhaal deze vries-dooi-cyclus vier tot vijf keer. Extrudeer de lipidsuspensie met een Avanti mini extruder.

Stel de mini-extruder in met een polycarbonaatfilter van 0,1 micron en filtersteunen; extrudeer de suspensie 21 keer heen en weer zodat er een bijna transparante suspensie in de tegenoverliggende spuit terechtkomt, wat resulteert in een suspensie van grote unilamellaire vesikels (LUV). Verwijder extern A NTS door de geextrudeerde suspensie over een PD-10 desaltingkolom te leiden die is geëquilibreerd met natriumbuffer. Voeg 1,5 milliliter van de LUV-suspensie plus één milliliter natriumbuffer toe aan de kolom.

Nadat de oplossing volledig in de kolom is opgenomen, worden de liposomen geëlueerd met drie milliliters natriumbuffer en wordt het eluaat opgevangen. De resulterende A NTS-gevulde LUV-stockoplossing moet ongeveer vier tot vijf millimolar lipide bevatten en er doorschijnend melkwit uitzien.

Bescherm de oplossing tegen licht met folie en bewaar deze bij 13 °C. Vortex volledig 24 uur vóór gebruik. De A NTS gevulde LUV stockoplossing. Aangezien UUV's een dichtheid hebben van meer dan 1 g/mL en kunnen sedimenteren.

Verdun vervolgens de LUV-stockoplossing gevuld met A NTS 1:20 met natriumbuffer. Incubeer driekwart van de liposomen met 260 nanogram abidin in DMSO. Voeg een gelijk volume DMSO zonder gramin toe aan het resterende kwart.

Om de oplosmiddelconcentratie in alle monsters constant te houden, dient het gramine gedurende 24 uur bij 13 °C te equilibreren tussen de binnenste en buitenste monolagen van de lipidevesikels. Hier wordt een Applied Photophysics SX point 20 stopped-flow spectrofluorimeter met temperatuurregeling gebruikt om de snelheid van fluorescentie-quenching te meten. Schakel de instrumenten een uur van tevoren in om de instrumentopwarming mogelijk te maken.

De spleet met rapporteurs voor excitatie moet 1/1 zijn en er moet een 455 nanometer high-pass filter worden gebruikt voor het vastleggen van de emissie met de pro data SX software. Stel eerst de opnamecondities in en stel de excitatiegolflengten van de monochromator in op 352 nanometers. Gebruik de instelling voor drukbehoud.

Stel de tijd in op één seconde en het aantal punten op 5.000. Stel het aantal herhalingen in op negen voor buffer-runs en op 13 voor quencher-runs. Monitor de temperatuur in het drive-profiel van de Essex-software.

Het aandrijfvolume moet worden ingesteld op 120 µL, waarbij 60 µL uit elke spuit wordt gemengd. Dit resulteert in een dode tijd van ongeveer 1,2 ms. Stel de hoogspanning of versterking op de fluorescentiedetector in op ongeveer 420 V.

Het doel is om een fluorescentiewaarde van ongeveer acht te verkrijgen; laat de eerder bereide NTS-geladen UUV's 10 minuten lang equilibreren bij 25 °C in het donker. Zodra ze geëquilibreerd zijn, vortex de sample en load deze vervolgens in de linker spuit. Load in de rechter spuit ofwel natriumbuffer of thallium-quencher.

Verwijder eventuele luchtbellen door de spuiten heen en weer te bewegen. Beide spuiten moeten gelijkmatig gevuld zijn. Voordat de kleppen voor het allereerste monster worden gesloten, dient de fluorescentie met natriumbuffer te worden geregistreerd.

Herhaal dit vier keer en pas de gain naar behoefte aan. Herhaal dit vervolgens nog vijf keer voor de overige monsters. Registreer negen herhalingen met natriumbuffer.

Vervang de natriumbuffer door de thallium-quencher en registreer 13 herhalingen. Spoel af met water en ga verder met de volgende monstercontroles. Neem monsters op zonder gramine en met oplosmiddel, en zonder gramine en met de maximale concentratie van de verbinding.

Lees na de fluorescentie-assay van zowel gramine als het oplosmiddel de gegevens in de MATLAB-software in voor analyse. Lees voor elk monster alle herhalingen van de buffer en de quencher in; de eerste vier herhalingen zullen verontreinigd zijn door wat zich voorheen in de slang bevond. In dit geval is het signaal afkomstig van het natriumbuffer-monster dat mengt met water uit de vorige spoeling.

Herhalingen vijf tot en met negen vertegenwoordigen het signaal van enkel het monster. Daarom sluiten we in elk geval altijd de eerste vier herhalingen uit. Om mengartefacten te vermijden, gaan we handmatig door de traces en verwijderen we alle foutieve herhalingen, zoals de rode trace die spikes of afwijkingen bevat door mengartefacten en/of bellen.

Normalise vervolgens de quencher-herhalingen ten opzichte van de gemiddelde startwaarde van de buffer-herhalingen voor elk monster per experimentele conditie; combineer de gemiddelden van alle monsters in één grafiek voor visualisatie. Monsters zonder gramicidine moeten vergelijkbaar zijn en vrijwel geen fluorescentiedoving vertonen. Bij monsters met gramicidine is er een langzame afname van het fluorescentiesignaal vanwege de langzame instroom van thalliumionen in de vesicles. Indien het fluorescentietijdverloop zichtbaar wordt beïnvloed door de verbinding, dan wijzigt de verbinding de eigenschappen van de lipide dubbellaag bij de geteste concentratie. Fit vervolgens een stretched exponential op de eerste 2 tot 100 milliseconden van de genormaliseerde fluorescentiedovingscurven.

Voer de individuele herhalingen uit en bereken de snelheid bij twee milliseconden. Bereken vervolgens de gemiddelden en standaarddeviaties voor een gegeven monster op basis van de individuele herhalingen. Het effect van capsaïcine, hier aangeduid als cap, werd waargenomen op het tijdsverloop van fluorescentie-quenching in afwezigheid of aanwezigheid van gramine, aangeduid als ga; het genormaliseerde fluorescentiesignaal wordt hier over één seconde weergegeven. Grijze stippen vertegenwoordigen de resultaten van alle herhalingen, terwijl de rode lijnen de gemiddelden zijn.

De eerste 100 milliseconden van het genormaliseerde fluorescentiesignaal worden getoond. De grijze stippen zijn resultaten van een enkele herhaling voor elke conditie. De rode lijnen zijn stretched exponential fits van deze herhalingen.

De gestippelde blauwe lijn geeft het tijdstip van twee milliseconden aan. Dit is het tijdstip waarop de quenching-snelheid wordt bepaald. De relatieve verandering in de quenching-snelheid wordt bepaald door de gegevens te normaliseren ten opzichte van de controlemonster met gramine en zonder modifier.

Wanneer capsaïcine zich bindt aan de lipide dubbellaag, verandert dit de eigenschappen van de dubbellaag. De verschuiving naar een zachtere dubbellaag zal zich uiten als een verschuiving in het mono-dimeer-evenwicht in het voordeel van de geleidende dimeer. We hebben zojuist een procedure gedemonstreerd om de perturberende effecten van een klein molecuul op de dubbellaag te meten.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de juiste controles voor elk experiment te gebruiken met dezelfde batch vesikels. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.