Single Cell Transfectie in kippenembryo's
25 september 2010
Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele cellen van chique somiten of neurale buizen te injecteren met een plasmide dat codeert voor groen fluorescent eiwit. Dit wordt bereikt door eerst micro-injectiepipetten te trekken met een geschikte tipopeningsdiameter. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van een plasmide stock voor injecties.
De derde stap van de procedure is het voorbereiden van de embryo's voor injectie. De vierde stap van de procedure is het laden van de micropipetten met plasmide DNA. De laatste stap van de procedure is het injecteren van de gewenste weefsels.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het bereik van derivaten in het aantal cellen laten zien dat wordt geproduceerd door enkele gelabelde voorlopers in gekozen som en neurale buis subdomeinen door middel van immunofluorescentiemicroscopie. Hallo, ik ben Rael van het Lab van Professor Heim in de afdeling Medische Neurobiologie aan de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem. Vandaag laten we u een procedure zien voor het injecteren van enkele cellen van kippene somiten en neurale buizen.
We gebruiken deze procedure in het lab om de lijn segregatie van somite en neurale buis cellen te bestuderen. Dus laten we beginnen Om enkele getransfecteerde cellen in kippene embryo's te genereren, beginnen we met het trekken van micropipetten. We trekken onze pipetten op een standaard Naga PP 83 pipettrekker met een warmte-instelling van 13.5.
De precieze instelling moet worden gekalibreerd om een pipettipdiameter van tussen de acht en 10 microns te bereiken. We gebruiken filament bevattende Boris silicaatglasbuizen met een buitendiameter van één millimeter en een binnendiameter van 0,75 tot 0,78 millimeter. Je kunt ook commercieel verkrijgbare micropipetten gebruiken, die geen filament hebben van één millimeter buitendiameter en 0,75 millimeter binnendiameter.
De voorbereide pipetten worden bewaard in een plastic schaal met de tips beschermd tegen contact met de rand van de schaal. Om het DNA voor micro-injectie voor te bereiden, wordt het gewenste plasmide getransfecteerd in DH vijf alfa e coli. Met behulp van standaardprocedures wordt het volgende dag het plasmide gezuiverd met behulp van een Maxi prep kit voor niet-klonale injecties, we gebruiken een DNA-concentratie van één microgram per microliter.
Voor experimenten waarbij individuele klonen gewenst zijn, zal de plasmideconcentratie veel lager zijn en moet worden aangepast. Voor P-C-A-G-G-F-P-A werkt een concentratie van 0,05 tot 0,1 microgram per microliter goed. Zodra de optimale concentratie is bepaald, raden we aan om de volledige gezuiverde plasmide stock te verdunnen in plaats van individuele bereidingen tot een vooraf bepaalde concentratie.
Dit laatste kan enige variatie in succespercentages introduceren, waarschijnlijk vanwege variaties in zuiverheid en andere parameters, zoals de verhouding van supercoiled plasmide om eieren voor micro-injectie voor te bereiden kippen eieren die zijn geïncubeerd terwijl ze op hun lange assen liggen tot het gewenste ontwikkelingsstadium, worden afgeveegd met 70%ethanol en mogen drogen. Prik vervolgens het puntige uiteinde van het ei met chirurgische schaar. Gebruik een 10 milliliter spuit en een 19 gauge naald om twee milliliter albumine uit het ei te trekken, verzegel de gaten met hete paraffine vóór de injectie.
Gebruik chirurgische schaar om een venster bovenaan de eischaal te openen om te voorkomen dat vuil in het gat komt. Plak een stuk tape over het venster en snijd er een gat doorheen. Om het embryo te helpen visualiseren, gebruik je een met vuur getrokken capillair gemonteerd op een afzuiger om een niet-toxische inkt zoals pelican 17 onder de geblazen derm te injecteren.
Ga vervolgens naar het embryo door de vitale en/of amniotische membranen te snijden en om te leiden met behulp van 0,14 millimeter insectenpins gemonteerd op een naaldhouder om het DNA in de getrokken pijp te laden Eloqua en voeg een kleine hoeveelheid fast green poeder toe met behulp van de capillair. Trek een minimale hoeveelheid plasmide gemonteerde capillair van voldoende diameter op een afzuiger. Steek het vervolgens in het uiteinde van de pijp tegenover de aangescherpte punt en laad het DNA zo dicht mogelijk bij het aangescherpte uiteinde.
Bevestig vervolgens de pijp op een manuele luchtdruk injector gemonteerd op een micro manipulator. Breng indien nodig een minimale hoeveelheid druk aan om de plasmideoplossing tot aan de punt van de pijp te laten komen. Manipulateer de pijp in het vloeibare medium van het ei terwijl je wat luchtdruk toepast om verstopping van de pijppunt te voorkomen.
Zodra het relevante weefseldomein is doorboord, is de verandering in druk vaak voldoende om het plasmide met zichtbaar fast green vrij te geven. Als dit niet gebeurt, oefen lichte druk uit op de spuit totdat het plasmide fast green mengsel wordt uitgestoten. Herhaal deze procedure langs de as van het embryo, waarna PBS kan worden toegevoegd.
Versluit ten slotte het venster met plakband en breng de eieren terug in de incubator. Vermijd ventilatie en plaats kleine bakjes met water in de incubator om vocht te behouden en de opbrengsten te verhogen. Als de doelsite van de injectie oppervlakkig genoeg was om gemakkelijk zichtbaar te zijn, zoals binnen de dorsale somiten neurale buis of ectoderm, kan men de succesgraad van het experiment meten door een volledige bergingswaarneming uit te voeren met behulp van een fluorescerend binoculair.
Deze stap is bijzonder nuttig voor het evalueren of er te veel of te weinig cellen zijn gelabeld. Als verdere incubatie gewenst is, voeg je na het bekijken antibiotica bevattende PBS oplossing toe aan het ei en vervang je het plakband. Bovendien kan men de succesgraad van de injectie beoordelen door de embryo's serieel te secteren en immunohistochemie uit te voeren.
Na vier uur of meer worden post-injectie embryo's gefixeerd en verwerkt voor paraffine sectie. Glas gemonteerde secties worden vervolgens gedefinaliseerd en geïmmunohistochemisch gekleurd voor reporter visualisatie. Amplificatiemethoden zoals biotin-streptavidine kunnen wenselijk zijn. Ten slotte worden de seriële secties gescand om gelabelde cellen in geïnjecteerde segmenten te detecteren.
Als bij eerste pogingen meerdere in plaats van enkele cellen worden verkregen, moet de plasmide stock worden verdund en het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het injecteren van plasmide-DNA in individuele cellen van kipsomieten of neurale buizen met behulp van micropipetten met een fijne punt. Het doel is om clonale populaties van getransfecteerde cellen te creëren die groen fluorescent proteïne tot expressie brengen.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetische modificatie
Achtergrond
- Microinjectietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van genfuncties.
- Kippenembryo's worden veel gebruikt als modelorganisme.
- Plasmid-DNA kan worden gebruikt om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen voor visualisatie.
- Transfectie van enkelvoudige cellen maakt de analyse van clonale celpopulaties mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het injecteren van plasmide-DNA in specifieke weefsels.
- Het genereren van enkelvoudig getransfecteerde cellen voor verder onderzoek.
- Het faciliteren van de observatie van genexpressie in levende embryo's.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van microinjectiepijpetten met passende tipdiameters.
- Voorbereiding van plasmid-voorraadoplossingen voor injectie.
- Voorbereiding van kiजembryo's voor microinjectie.
- Injectie van plasmid-DNA in somieten of neurale buizen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle injectie van plasmide-DNA in doelweefsels.
- Generatie van enkelvoudige getransfecteerde cellen die zich ontwikkelen tot clonale populaties.
- Visualisatie van genexpressie via groen fluorescent eiwit.
- Vaststelling van een protocol voor toekomstige studies naar genfunctie.
Conclusies
- De micro-injectietechniek is effectief voor transfectie van enkelvoudige cellen.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse studies binnen de ontwikkelingsbiologie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om genfuncties in vivo te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Transfectie van enkelvoudige cellen in kiजembryo's maakt nauwkeurige lineage tracing en genetische manipulatie mogelijk, wat bijdraagt aan de validatie van targets in ontwikkelingspaden. Deze methode biedt mechanistische risicovermindering door het gedrag van progenitorcellen te koppelen aan fenotypische uitkomsten, wat vroege beslissingen in het ontdekkingsproces ondersteunt. De reproduceerbaarheid en kwantitatieve clonale analyse verhogen het voorspellende vertrouwen in preklinische modelsystemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het volgen van clonale nakomelingen van enkele progenitorcellen in subdomeinen van het somiet en de neurale buis.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van afgeleide celtypen (bijv. dermis en spierweefsel) vanuit gelabelde precursoren.
- Strategische waarde: Faciliteert portfolio-triage door genetisch gemanipuleerde clonale populaties te vergelijken met controles voor een functionele beoordeling van targets.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via sporadische transfectie van individuele cellen in gedefinieerde weefseldomeinen.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door gecontroleerde plasmidconcentraties (0,05–0,1 µg/µl voor clonale labeling) en consistente micro-injectieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de screeningbereidheid door schaalbare, platformcompatibele lineage tracing mogelijk te maken over meerdere embryonale segmenten (6–12 per embryo).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door clonale dynamiek in vertebraten-embryogenese te modelleren, wat relevant is voor onderzoek naar aangeboren afwijkingen.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via immunohistochemie en seriële sectieanalyse van getransfecteerde segmenten.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang door clonale succespercentages te kwantificeren (~10% transfectie, >93% clonaliteit onder positieven) om de opschaling van experimenten te informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, variërend van hypothese-toetsing in de vroege biologie tot lead-identificatie via clonale functionele analyse, en preklinisch werk door middel van longitudinale fenotype-tracking.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door lineage tracing van enkelvoudige progenitorcellen mogelijk te maken, om zo de diversificatie van het lot in somiet- en neurale buislijnen te verhelderen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door reproduceerbare micropipetpreparatie (8–10 µm tipdiameter) en gestandaardiseerde DNA-laadprotocollen.
- Analyses: Levert kwantitatieve output via immunofluorescentiemicroscopie en doorsnedescaning om clonale expansie en de bijdrage van derivaten in de loop van de tijd te meten.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door vergelijking van gemanipuleerde clonale populaties met controles mogelijk te maken tot drie dagen na injectie.
- Herbruikbaarheid binnen de Organisatie: Functioneert als een herbruikbare capaciteit over verschillende studies heen dankzij gestandaardiseerde embryo-preparatie, pipetkalibratie en plasmiddilutieworkflows.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in lineage-relaties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van single-cell transfectie over verschillende ontwikkelingsmomenten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege clonale fenotypering.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van kwantitatieve metrics van clonale afgeleide.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in het trekken van micropipetten en het hanteren van embryo's om tipdiameters van 8–10 µm en een succesvolle weefselpenetratie te bereiken.
- Benodigde instrumentatie omvat een micromanipulator, een luchtdrukinjector en fluorescentiemicroscopie voor clonale tracking.
- Standaardisatie tussen teams vereist een consistente plasmidverdunning (bijv. 0,05–0,1 µg/µl) en embryo-stadiëringsprotocollen om reproduceerbare transfectiepercentages te waarborgen.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen omvatten het aanpassen van de injectiedruk en de DNA-concentratie op basis van de weefseltoegankelijkheid en de embryonale geometrie.
- Praktische beperkingen omvatten een lage transfectie-efficiëntie (~10%), waardoor verdunning van de stock en herhaalde injecties noodzakelijk zijn om een resolutie op single-cell niveau te bereiken.
