Electroeluting DNA-fragmenten

Hallo. Vandaag laten we u zien hoe electrolutie wordt uitgevoerd om DNA-fragmenten, zoals digestie- en PCR-producten, te zuiveren. Voor verdere doeleinden, zoals kloneren en sequencing, kan electrolutie een van de voorkeursmethoden zijn. Op basis van de negatieve elektrische lading van DNA wordt een hoge celbarrière in het elektrisch veld geplaatst, waardoor de fragmenten neerslaan en hun verdere migratie wordt voorkomen.

Deze methode maakt de zuivering mogelijk van een breed scala aan DNA-fragmentgroottes uit verschillende bronnen met een relatief hoge efficiëntie tot 80%. De lage kosten vormen een ander voordeel van elektro-elutie in vergelijking met andere zuiveringsmethoden, zoals kolommen en harskits, enzovoort. Het DNA-monster wordt eerst gevisualiseerd via agarosegelelektroforese met ethidiumbromide-kleuring om het gewenste te zuiveren fragment te visualiseren en te identificeren, waarna de elektroforese moet worden voortgezet.

Wanneer fragmenten goed gescheiden zijn, kan de grootte van te kleine fragmenten nauwkeurig worden bepaald. Na de elektroforese wordt het gewenste fragment zorgvuldig uit de gel gesneden met een nieuw scheermesje, waarbij erop wordt gelet dat de gelsectie zo dicht mogelijk bij de band van belang wordt uitgesneden.

Deze procedure dient te worden uitgevoerd met adequate bescherming tegen UV-licht en onder gebruik van handschoenen. Nadat de elueerder is gevuld met de geschikte elutiebuffer en zorgvuldig is gecontroleerd of deze over het oppervlak van het middelste plateau is verspreid, wordt de gelstrip in een van de wielposities geplaatst, zo dicht mogelijk bij het V-kanaal. Er mogen geen luchtbellen in het V-kanaal aanwezig zijn.

Dit kan worden voorkomen door het kanaal door te spoelen met buffer om eventuele ingesloten lucht te verwijderen. Vervolgens worden 100 µL van de high salt barrier voorzichtig aan het V-kanaal toegevoegd vanaf de zijde die zich het dichtst bij de put bevindt. De kamer wordt afgesloten en de elektroden worden aangesloten op de stroombron om de electrolutie te starten bij 100 tot 120 volt.

De tijdsduur van de elutie is afhankelijk van de fragmentgrootte; voor grote fragmenten tot 20 kb zijn 50 minuten tot een uur voldoende. Bij kleine fragmenten dient elke 10 minuten met UV-licht te worden gecontroleerd om verdere elutie door de zoutoplossing en in de uiteindelijke bufferketen te voorkomen. In dit geval hebben we 560 nanogram plasmid verteerd met de enzymen ND1 en entry om een fragment van 900 basenparen vrij te maken, wat gelijkstaat aan 84 nanogram van een monster.

Nadat het gelplakje in het putje is geplaatst, vindt de elektro-elutie plaats gedurende 25 minuten bij 100 volt. Zodra de elektro-elutie is voltooid en de DNA-fragmenten zijn opgevangen in het onderste kussen binnen het V-kanaal, worden 400 µL van de oplossing uit het kanaal teruggewonnen, vanaf de distale zijde van de houder, en met een fijne tip aan een micropipet in een 1,5 µL microcentrifugebuis geplaatst. Vervolg met alcoholprecipitatie door twee volumes koud absoluut ethanol toe te voegen en te mengen via vortexen. Daarnaast kunnen twee tot drie µL glycogeen worden toegevoegd om de opbrengst van het DNA-herstel te verbeteren. Bewaar de buisjes bij -20 °C gedurende één uur of alternatief een nacht bij deze temperatuur en centrifugeer vervolgens 25 minuten op maximale snelheid bij 4 °C.

Was deze supernatant en spoel door één milliliter koude, 70%ethanol toe te voegen. Centrifugeer bij vier graden Celsius op maximale snelheid gedurende vijf tot 10 minuten, verwijder de supernatant en laat het drogen op kamertemperatuur met de buisjes in omgekeerde positie. Resuspendeer in 10 tot 15 microliters nucleasevrij water en bepaal vervolgens de concentratie van het monster. In dit geval werd het gezuiverde monster geresuspendeerd in 10 microliters water en gekwantificeerd in een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nanometer, wat een concentratie van 6,3 nanogram per microliter liet zien, wat overeenkomt met een efficiëntie van 75%. U denkt wellicht dat het beter zou zijn om slechts 10 minuten van uw kostbare tijd aan een kit te besteden.

Ondanks de tijd die dit proces in beslag neemt, kunt u hiermee veel variabelen beheersen, waardoor u een breder scala aan monsters met verschillende groottes en bronnen kunt zuiveren. Zoals in dit geval kon worden waargenomen, werd een efficiëntie van 75% bereikt, wat gelijk is aan of beter is dan de meeste DNA-zuiveringskits. Bedankt dat u vandaag bij ons was.

We hopen dat u dit protocol nuttig heeft gevonden voor uw onderzoeksprojecten.