Electroeluting DNA-fragmenten

Hallo.Vandaag laten we u zien hoe elektrolutie wordt uitgevoerd om DNA-fragmenten zoals verterings- en PCR-producten te zuiveren. Voor verdere doeleinden zoals klonen en sequentiebepaling kan elektrolutie een van de voorkeursmethoden zijn. Gebaseerd op de negatieve elektrische lading van DNA, wordt er een hoge celbarrière geplaatst binnen het elektroveld, waardoor de fragmenten vallen en voorkomen dat ze verder migreren.

Deze methode maakt de zuivering mogelijk van een breed scala aan DNA-fragmentgroottes uit verschillende bronnen met een relatief hoge efficiëntie tot 80%. Het lage kostenprofiel vertegenwoordigt een ander voordeel van elektrolutie in vergelijking met andere zuiveringsmethoden zoals kolommen, harskits, onder andere. De DNA-stapel wordt eerst gevisualiseerd door een tedium bromide gekleurde Aris-gelelektroforese om het gewenste fragment dat moet worden gezuiverd te visualiseren en te identificeren, elektroforese moet worden voortgezet.

Onder fragmenten zijn goed gescheiden, kan ondermaat precies worden bepaald. Na elektroforese. Het gewenste fragment wordt netjes uitgesneden uit de gel met behulp van een nieuw scheermesje en ervoor zorgen dat het gelsegment zo dicht mogelijk bij de band van interesse wordt gedraaid.

Deze procedure moet worden uitgevoerd met de juiste bescherming tegen UV-licht en het dragen van handschoenen. Nadat de elektroluter is gevuld met de geschikte verbrandingsbuffer en ervoor zorgt dat deze over het oppervlak van het middelste plateau wordt gemorst, wordt het gelsegment geplaatst in een van de wielen zo dicht mogelijk bij het V-kanaal. Er mogen geen luchtbellen in het vch-kanaal zijn.

Dit kan worden vermeden door het kanaal te spoelen met buffer om eventuele vastgelopen lucht te verwijderen. Vervolgens worden 100 microliters van de hoge zoutbarrière voorzichtig toegevoegd aan het V-kanaal vanaf de plaats dicht bij het putje. De kamer is gesloten en de elektroden zijn verbonden met de stroombron om elektrolutie te beginnen bij 100 tot 120 volt.

De tijdsafhankelijkheid hangt af van de fragmentgrootte voor grote fragmenten tot 20 kbs. 50 minuten tot een uur zou voldoende moeten zijn en kleine fragmenten moeten om de 10 minuten worden gecontroleerd met UV-licht om verdere elutie door de zoutoplossing en in de eindbufferketen te voorkomen. In dit geval hebben we 560 nanogram plasmide gedigest met de enzymen ND een en entry om een fragment van 900 basen per vrij te geven, gelijk aan 84 nanogram van een stapel.

Dienovereenkomstig, na het plaatsen van het gelsegment in het putje, zal elektrolutie gedurende 25 minuten bij 100 volt worden voortgezet. Zodra de elektro-oplossing is voltooid en DNA-fragmenten zijn gevangen in de zuidkussen binnen het V-kanaal, worden 400 microliters oplossing uit het kanaal teruggewonnen, vanaf de distale zijde van de emmer En geplaatst in een 1,5 microliter microbuis met behulp van een fijne punt bevestigd aan een microput, gaat u verder met alcoholprecipitatie door twee volumes koude absolute ethanol toe te voegen en vermengd door vortex. Bovendien kunnen twee tot drie microliters glycogeen worden toegevoegd om de opbrengst van DNA-herstel in klassieke buizen te verbeteren bij min 20 graden Celsius gedurende een uur of alternatief, bewaar deze op deze temperatuur een nacht, centrifugeer bij vier graden Celsius op volle snelheid gedurende 25 minuten.

Deze cardio-supernatant en wassen door één milliliter koude 70% ethanol toe te voegen. Centrifugeer bij vier graden Celsius op volle snelheid gedurende vijf tot tien minuten, gooi de supernatant weg en laat deze op kamertemperatuur drogen met de buizen in omgekeerde positie, gedrenkt in 10 tot 15 microliters nucleair vrij water en ga door met het bepalen van de concentratie van de stapel. In dit geval werd de gezuiverde stapel opgeschort in 10 microliters water en gekwantificeerd in een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nanometer, wat een concentratie van 6,3 nanogram per microliter vertoonde, wat overeenkomt met een efficiëntie van 75%. Je zou kunnen denken dat je beter zou kunnen investeren in slechts 10 minuten van je kostbare tijd met een kit.

Maar ondanks de tijd die nodig is voor dit proces, zul je in staat zijn om veel van de variabelen te beheersen die je in staat stellen om een ​​breder scala aan stapels te zuiveren met in de natuur voorkomende groottes en bronnen. Zoals je in het huidige geval hebt kunnen zien, werd een efficiëntie van 75% waargenomen, gelijk aan of beter dan de meeste DNA-zuiveringskits. Bedankt voor je deelname vandaag.

We hopen dat je dit protocol nuttig hebt gevonden voor je onderzoeksprojecten.