Name: Electroeluting DNA-fragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer hoe je DNA-fragmenten efficiënt zuivert met elektro-elutie, een kosteneffectieve methode die opbrengsten tot 80% behaalt. Deze techniek is ideaal voor kloneren en sequencen in moleculair biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in Dr Bermudez laboratorium werd gefinancierd door Conacyt (Grant # 82622). Wij danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez en Ximena Rodriguez-Torres voor video-opname van de electroleution procedure.

<ol><li> Met het oog op DNA-fragmenten van belang worden gezuiverd te selecteren, moeten deze worden opgelost in agarose gels of acrylamide gel gekleurd met ethidiumbromide door middel van elektroforese met 0.5X TBE buffer (Tris boraat, EDTA) bij 120 volt gedurende 1 uur. Voor deze, ~ 700 ng van het plasmide pProEx-GdMre11S (6000-bp) eerder verteerd met Ndel en HindIII werd gebruikt om een ​​900-bp fragment (560 ng van plasmide en 84 ng van het fragment) release. </li><li> De electroeluter tank (figuur 1) moet worden gevuld met 0.5X TBE gelijk verdeeld aan elke kant van het midden van de plateau de verzorging van niet morsen het op het midden van de plateau. </li><li> De geselecteerde band (of banden) wordt gesneden uit de gel, en geplaatst in monsterkamer zo dicht mogelijk bij de V-kanaal (een slice per putje). Running buffer moet worden toegevoegd aan elke kamer; net genoeg om de gel slice te dekken. </li><li> Elke gebruikte V kanaal moet worden gespoeld met een Pasteur pipet aan een ingesloten luchtbel te elimineren. </li><li> Dan 100 ul van 10 M NH 4-acetaat (voor visualisatie te vergemakkelijken een kleine hoeveelheid broomfenolblauw is toegevoegd, net genoeg om het kleur) worden voorzichtig aan de binnenzijde van de V-kanaal. </li><li> Het deksel moet voorzichtig worden gesloten voor een resuspensie van de hoge zoute kussen te voorkomen. </li><li> Elektro is begonnen op 100 volt voor 25 minuten. </li><li> Wanneer electrolution is voltooid, worden 400 ul verwijderd van V-kanaal, en geplaatst in een microfugebuis te worden neergeslagen met twee volumes van de koude ethanol en glycogeen (aanbevolen om DNA herstel te verbeteren) bij 4 ° C gedurende 1 uur of 's nachts. </li><li> Centrifugeer gedurende 20 minuten, verwijder supernatant en wassen met 70% ethanol. </li><li> Droge buis en te kwantificeren DNA bij OD 260 nm. </li><li> Verkregen Het herstel was 75% (63 ng hersteld toen 84 ng werden geplaatst op de V-kanaal). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Electroeluter diagram. Geanod een kathode worden aangegeven op elke kant van de tank, DNA in gel gesneden (geïllustreerd als een zwart vierkant) zal migreren naar de kathode als gevolg van de negatieve lading. Dan zal het gevangen zitten in het zout kussen (voorgesteld als een omgekeerde zwarte driehoek) gelegen in het V-kanaal.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

De duur van de termijn zal sterk afhangen van de grootte van de fragmenten, die normaal voor de fragmenten van maximaal 20 kb 50 minuten tot 1 uur is genoeg, terwijl voor kleine fragmenten UV-licht controle op elke 10 minuten is vereist om het fragment te voorkomen om door de zout kussen en bijgevolg de anodal buffer kamer afnemende herstel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat wanneer u uw voeding op 100 volt, is er een stroom van ten minste 10 MAMP. De DNA-band kan worden gecontroleerd met behulp van een UV-lamp en de hand detecteren wanneer dit verlaat de gel slice. Het kussen zout kan ook gemaakt worden met 3 M Na-acetaat. Deze procedure laat de zuivering van DNA of RNA-fragmenten van verschillende afmetingen met een goede recovery (~ 80%), voor radioactief, verteerd door restrictie-enzymen, verwerkt door aanpassing van enzymen, etc.

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; acetaat</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biofotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Elektro&amp;#8211;eluteerder</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting dna-fragmenten

Electroeluting DNA Fragments

Gezuiverde DNA-fragmenten worden gebruikt voor verschillende doeleinden in Moleculaire Biologie en ze kunnen worden bereid door verschillende procedures. De meesten van hen vereisen een eerdere elektroforese van de DNA-fragmenten, om de band van belang te scheiden. Dan is deze band weggesneden uit een agarose-of acrylamide gel en gezuiverd door middel van: binding en elutie van glazen of silica deeltjes, DEAE-cellulose membranen, &quot;crush en genieten methode&quot;, elektro of heel vaak dure commerciële zuivering kits. Zo zal het selecteren van een methode grotendeels afhankelijk zijn van wat er beschikbaar is in het laboratorium. De elektro-procedure maakt het mogelijk om te zuiveren zeer schoon DNA te worden gebruikt in een groot aantal toepassingen (sequencing, radiolabeling, enzymatische beperking, enzymatische modificatie, klonen etc). Deze procedure bestaat uit het plaatsen van DNA-band-bevattende agarose of acrylamide sneetjes in monster putjes van de electroeluter, dan is toepassing van de huidige zal het DNA-fragment op de agarose te verlaten en dus gevangen in een kussen zout zijn om later worden teruggevorderd door ethanolprecipitatie.

Deze procedure laat de zuivering van DNA-fragmenten met een hoog rendement.

Electroeluting DNA-fragmenten

Gezuiverde DNA-fragmenten worden voor verschillende doeleinden in de moleculaire biologie gebruikt en kunnen via diverse procedures worden geprepareerd. De meeste hiervan vereisen een ...

Hallo. Vandaag laten we u zien hoe electrolutie wordt uitgevoerd om DNA-fragmenten, zoals digestie- en PCR-producten, te zuiveren. Voor verdere doeleinden, zoals kloneren en sequencing, kan electrolutie een van de voorkeursmethoden zijn. Op basis van de negatieve elektrische lading van DNA wordt een hoge celbarrière in het elektrisch veld geplaatst, waardoor de fragmenten neerslaan en hun verdere migratie wordt voorkomen.Deze methode maakt de zuivering mogelijk van een breed scala aan DNA-fragmentgroottes uit verschillende bronnen met een relatief hoge efficiëntie tot 80%. De lage kosten vormen een ander voordeel van elektro-elutie in vergelijking met andere zuiveringsmethoden, zoals kolommen en harskits, enzovoort. Het DNA-monster wordt eerst gevisualiseerd via agarosegelelektroforese met ethidiumbromide-kleuring om het gewenste te zuiveren fragment te visualiseren en te identificeren, waarna de elektroforese moet worden voortgezet.Wanneer fragmenten goed gescheiden zijn, kan de grootte van te kleine fragmenten nauwkeurig worden bepaald. Na de elektroforese wordt het gewenste fragment zorgvuldig uit de gel gesneden met een nieuw scheermesje, waarbij erop wordt gelet dat de gelsectie zo dicht mogelijk bij de band van belang wordt uitgesneden.Deze procedure dient te worden uitgevoerd met adequate bescherming tegen UV-licht en onder gebruik van handschoenen. Nadat de elueerder is gevuld met de geschikte elutiebuffer en zorgvuldig is gecontroleerd of deze over het oppervlak van het middelste plateau is verspreid, wordt de gelstrip in een van de wielposities geplaatst, zo dicht mogelijk bij het V-kanaal. Er mogen geen luchtbellen in het V-kanaal aanwezig zijn.Dit kan worden voorkomen door het kanaal door te spoelen met buffer om eventuele ingesloten lucht te verwijderen. Vervolgens worden 100 µL van de high salt barrier voorzichtig aan het V-kanaal toegevoegd vanaf de zijde die zich het dichtst bij de put bevindt. De kamer wordt afgesloten en de elektroden worden aangesloten op de stroombron om de electrolutie te starten bij 100 tot 120 volt.De tijdsduur van de elutie is afhankelijk van de fragmentgrootte; voor grote fragmenten tot 20 kb zijn 50 minuten tot een uur voldoende. Bij kleine fragmenten dient elke 10 minuten met UV-licht te worden gecontroleerd om verdere elutie door de zoutoplossing en in de uiteindelijke bufferketen te voorkomen. In dit geval hebben we 560 nanogram plasmid verteerd met de enzymen ND1 en entry om een fragment van 900 basenparen vrij te maken, wat gelijkstaat aan 84 nanogram van een monster.Nadat het gelplakje in het putje is geplaatst, vindt de elektro-elutie plaats gedurende 25 minuten bij 100 volt. Zodra de elektro-elutie is voltooid en de DNA-fragmenten zijn opgevangen in het onderste kussen binnen het V-kanaal, worden 400 µL van de oplossing uit het kanaal teruggewonnen, vanaf de distale zijde van de houder, en met een fijne tip aan een micropipet in een 1,5 µL microcentrifugebuis geplaatst. Vervolg met alcoholprecipitatie door twee volumes koud absoluut ethanol toe te voegen en te mengen via vortexen. Daarnaast kunnen twee tot drie µL glycogeen worden toegevoegd om de opbrengst van het DNA-herstel te verbeteren. Bewaar de buisjes bij -20 °C gedurende één uur of alternatief een nacht bij deze temperatuur en centrifugeer vervolgens 25 minuten op maximale snelheid bij 4 °C.Was deze supernatant en spoel door één milliliter koude, 70%ethanol toe te voegen. Centrifugeer bij vier graden Celsius op maximale snelheid gedurende vijf tot 10 minuten, verwijder de supernatant en laat het drogen op kamertemperatuur met de buisjes in omgekeerde positie. Resuspendeer in 10 tot 15 microliters nucleasevrij water en bepaal vervolgens de concentratie van het monster. In dit geval werd het gezuiverde monster geresuspendeerd in 10 microliters water en gekwantificeerd in een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nanometer, wat een concentratie van 6,3 nanogram per microliter liet zien, wat overeenkomt met een efficiëntie van 75%. U denkt wellicht dat het beter zou zijn om slechts 10 minuten van uw kostbare tijd aan een kit te besteden.Ondanks de tijd die dit proces in beslag neemt, kunt u hiermee veel variabelen beheersen, waardoor u een breder scala aan monsters met verschillende groottes en bronnen kunt zuiveren. Zoals in dit geval kon worden waargenomen, werd een efficiëntie van 75% bereikt, wat gelijk is aan of beter is dan de meeste DNA-zuiveringskits. Bedankt dat u vandaag bij ons was.We hopen dat u dit protocol nuttig heeft gevonden voor uw onderzoeksprojecten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

Een basisprotocol voor het scheiden van DNA-fragmenten met agarose gel elektroforese beschreven.

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

In this video, we analyze the size distribution of cell-free DNA or cfDNA fragments using automated capillary electrophoresis. This technique helps gain insights into the profile of DNA fragments released by cancer cells during apoptosis.

Automated Capillary Electrophoresis Based Fragment Size Distribution Analysis of cfDNA: A DNA Microchip-based Method to Study Size Distribution of DNA Fragments Isolated from Biofluids

This video describes the microfluidic capillary electrophoresis technique to separate PCR amplicons based on their size. This technique helps in fragment sizing using fluorescent dyes and standard molecular size markers.

Microfluidic Capillary Electrophoresis for Fragment Sizing of PCR Products: A Microchip-Based Electrophoretic Separation Technique to Separate DNA Fragments Based on Size

We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

Verbeterde Gereduceerde Representatie Bisulfiet Sequencing is een methode voor de voorbereiding van sequencingbibliotheken voor DNA-methylatieanalyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine bisulfietconversie. Dit protocol vereist 50 ng aan uitgangsmateriaal en levert data met base-paarresolutie op GC-rijke genomische regio's.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

Traditionele platengelektroforese (SGE) experimenten vereisen een ingewikkeld apparaat en een hoog chemisch verbruik. Dit werk bevat een protocol dat een goedkope methode om DNA-fragmenten te scheiden binnen een kort tijdsbestek beschrijft.

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Leer hoe je DNA-fragmenten efficiënt zuivert met elektro-elutie, een kosteneffectieve methode die opbrengsten tot 80% behaalt. Deze techniek is ideaal voor kloneren en sequencen in moleculair biologisch onderzoek.

Electroeluting DNA-fragmenten

Meer video's verkennen