Directe analyse van enkele cellen met behulp van massaspectrometrie bij atmosferische druk

Het algemene doel van het volgende experiment is om de inhoud van een enkele levende cel uit te stoten en de vrijgekomen biomoleculen te ioniseren voor analyse met een massaspectrometer bij atmosferische druk. Dit wordt bereikt door een enkele cel te selecteren via een afstandsmicroscoop en de geselecteerde cel te ablateren met een laserpuls van 2,94 micrometer golflengte, afgeleverd via een verscherpte optische vezel. De ablatie van een enkele cel resulteert in de vorming van een microscopische pluim van neutraal particulate materiaal om de ablatiepluim te ioniseren.

Het wordt opgevangen door een electrospray. De geladen druppeltjes van de spray versmelten met de partikels van de ablatiepluim die afkomstig is van de cel. De resulterende druppels worden gezaaid met de moleculen uit de cel en produceren de bijbehorende ionen.

Er worden resultaten verkregen die een massaspectrum van een enkele cel laten zien. Het spectrum bevat talrijke pieken die gerelateerd zijn aan de metabolieten en lipiden van de cel. Hallo, ik ben Dr. Bin Drester van het Verese Laboratory van de afdeling Chemie aan de George Washington University.

Vandaag laten we u de procedure zien voor de directe analyse van enkelvoudige levende cellen via massaspectrometrie bij atmosferische druk. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om metabolieten en lipiden uit individuele plant- en diercellen te bestuderen. Laten we beginnen.

Laserablatie voor laserablatie-elektrosprayionisatie-massaspectrometrie, of LAESI-MS, wordt gegenereerd door een laserpuls van vijf nanoseconden bij een golflengte van 2,94 micrometer. In deze studie wordt een instelbare optische parametrische oscillator, aangedreven door een neodymium-YAG-laser, gebruikt voor de ablatie.

Begin met het monteren van het geëtste uiteinde van een optische vezel op een micromanipulator en breng dit in nauwe nabijheid van het celoppervlak. Voor een efficiënte energiedepositie dient het niet-geëtste uiteinde van een optische vezel met een bare-fiberklem vast te houden voor de optische uitlijning. De vezelklem is gemonteerd op een vijfassige translator.

Koppel de laserenergie in de vezel door de straal met een plano-convexe lens van calciumfluoride of een antireflectie-gecoate zinkselenidelens op het niet-geëtste uiteinde te focussen; gebruik beschermde goudspiegels om de mid-infrarood laserstraal naar de focuserende lens te sturen. Gebruik om de afstand tussen de geslepen vezeltip en het celoppervlak te handhaven een videomicroscoop voor grote afstanden, gemonteerd onder een hoek van 15 tot 30 graden ten opzichte van het oppervlak. Dit systeem bestaat tevens uit een vijf maal oneindig gecorrigeerde objectieflens, uitgerust met een CCD-camera voor monitoring en beeldvastlegging.

Een tweede videomicroscoop is haaks op het sample-oppervlak gemonteerd om de cellen van bovenaf te visualiseren en ze te selecteren voor analyse. Dit systeem biedt visuele feedback om de vezeltip boven de geselecteerde cel uit te lijnen voor ablatie en analyse. Het bestaat uit een precisie-zoomoptiek-behuizing met zevenvoudige vergroting, een 10x oneindig gecorrigeerde objectieflens met een grote werkafstand en een CCD-camera.

Het electrospray-systeem is geconstrueerd met behulp van een metalen koppeling met geleidende perfluor-elastomeer ferrule-fittingen, slang, een sleeve needle port en FU-siliciumdioxide-slangen. De aanbevolen emitter is gemaakt van roestvrij staal en heeft een taps toelopende tip met een diameter van 50 micrometer. Bereid een 50% methanol-oplossing met 0,1% azijnzuur voor de electrospray. Pomp de oplossing met een snelheid van 200 tot 300 nanoliters per minuut met een spuitenpomp.

Met behulp van een spuit van 500 µL wordt via een gereguleerde voeding een hoge spanning tussen 2,803,000 V aangelegd op de metalen verbinding. Om een stabiele electrospray te genereren, dient men ervoor te zorgen dat alle elektrische verbindingen stevig vastzitten en zijn afgeschermd met de afscherming, en dat deze correct zijn geaard, aangezien direct contact met blootgestelde hoge spanning kan leiden tot een elektrische schok. Verkrijg het levende weefsel- of celmonster uit een geschikte bron en bewaar deze zoals aanbevolen vóór de analyse.

De Allium cepa-bollen voor deze demonstratie werden gekocht bij een lokale winkel. Voor de monsterpreparatie van de Allium cepa-bol wordt de bol in de lengte doorgesneden met een chirurgisch scalpel om een segment van ongeveer twee vierkante centimeter van de schub van een uienbol af te snijden. Pel vervolgens een intacte monolaag van het binnenste epidermale weefsel af. Gebruik het natte oppervlak van de epidermis om het weefsel op een vooraf gereinigde glazen microscoopglasplaatje te monteren.

Houd de objectglas vast met een algemene platenhouder, gemonteerd op een translatiepodium met drie assen voor positionering. Neem direct na het monteren van het monster de massaspectra op om celdegradatie te voorkomen. Begin met het inschakelen van de laser, de elektrospray en de massaspectrometer.

Optimaliseer de geometrie van de lazy ion source door de positie van het ablatiepunt en de electrospray-emitter ten opzichte van elkaar en de opening van de massaspectrometer aan te passen. Om een maximale ionintensiteit te bereiken, selecteert u de cel van belang voor de analyse met behulp van het visualisatiesysteem voor het bovenaanzicht. Verplaats na selectie de monsterhouder om de geselecteerde cel direct onder de geslepen punt van de optische vezel te plaatsen.

Stel met behulp van de microscoop in zijzicht de afstand tussen de tip en het celoppervlak opnieuw in op ongeveer 20 micron. Zodra de juiste positie is bereikt, worden er via de geëtste vezeltip laserpulsen op de geselecteerde cel afgevuurd. Dit resulteert in de perforatie van de celwand en de uitstoot van het cytoplasma in de vorm van particulair materiaal.

Na ionisatie door de electrospray worden de geproduceerde ionen opgevangen door de massaspectrometer en worden de massaspectra geregistreerd. Zet na de gegevensverzameling de laser, de electrospray en de massaspectrometer in de stand-bymodus of schakel ze uit. Bewaar het geablateerde allium cper weefselmonster voor eventuele observatie via lichtmicroscopie; een succesvolle ablatie van een enkele cel resulteert in het openbarsten van de celwand en de registratie van een massaspectrum met een lage intensiteit.

Hier zijn de resultaten van de lazy MS-analyse van een enkele ingebedde epidermale cel van een Allium cepa-bol, waarbij een representatieve optische microscopie-afbeelding wordt getoond. Na de bemonstering van een cel is de celwand geperforeerd, waarbij de omvang van de perforatie wordt beperkt door de grenzen met de naburige cellen. De aangrenzende cellen lijken intact te zijn.

Hier wordt een representatief MALDI-massaspectrum getoond dat uit de cel is verkregen. Er worden diverse ionen gedetecteerd uit het allium-segment per cel, en op basis van hun accurate massa's, isotoopdistributiepatronen en tandem-massaspectra worden de ionen zorgvuldig toegewezen aan endogene metabolieten. De ionen die in een enkele cel werden gedetecteerd, waren vergelijkbaar met die welke werden waargenomen bij de analyse van hetzelfde weefsel via conventionele MALDI-MS van meerdere cellen.

We hebben zojuist aangetoond hoe enkelvoudige levende cellen geanalyseerd kunnen worden middels massaspectrometrie bij atmosferische druk. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een beschermbril te dragen om onbedoelde blootstelling aan infraroodlasers van klasse vier te voorkomen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.