Name: Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer eiwit-eiwit interacties beoordelen op het celoppervlak van endotheelcellen met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheidsassay. Deze methode maakt visualisatie van receptorinteracties tijdens angiogenese mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Dr Scott Henderson erkennen voor hulp bij confocale microscopie. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health 1RO1CA127501 om WAB als proefproject financiering van de Massey Cancer Center en de School of Medicine (VCU) om WAB Microscopie werd uitgevoerd bij de VCU-Dept. voor Neurobiologie en Anatomie Microscopy Facility, ondersteund, voor een deel, met geld van NIHNINDS Center kern te verlenen 5P30NS047463.

Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen. De eerste, stap het klonen van je gen van belang in een zoogdier expressievector amino-terminaal aan de monomere versies van het GVB en / of YFP zal slechts kort worden besproken. De tweede en derde stap, transfectie van vector-DNA in EA.hy926 endotheelcellen, en confocale beeldvorming met FRET, staan ​​beschreven in meer diepte beneden. 1. Bouw van CFP en YFP chimère receptoren Receptoren van de rente moeten amino-terminaal worden gekloond om monomere verbeterde versies van het GVB en YFP. Bepaling van het FRET is empirisch en is sterk afhankelijk van de lengte van tussen de linker transmembraan spanning regio en begin van de fluorofoor 1. Daarom moet een aantal verschillende lengten van de linker worden onderzocht voor elke nieuwe receptor paar in onderzoek. <ol><li> In de pcDNA3.1 hygro R-of neo R vector die monomere C-of YFP (deze vector kunnen worden verkregen bij ons lab), kloon je receptor van belang in de Nhel / EcoRI plaatsen. * NB-Indien nodig, Nhel is compatibel diverse andere enzymen waaronder Spel en Xbal. </li><li> Transformeer uw ligatiereactie in een geschikte endA1 recA bevoegde cellijn (we routinematig gebruik van mach1). Scherm kolonies op de aanwezigheid van insert, gevolgd door DNA-sequencing om de afwezigheid van mutaties te controleren. </li><li> Na het verkrijgen van conformatie van een succesvolle moleculair klonen, voorbereiden transfectie-grade vector-DNA in gesteriliseerd water of TE behulp van Qiagen, of iets dergelijks, DNA-kits. Evalueer de concentratie en zuiverheid met behulp van UV-spectroscopie. Typische rendementen van DNA moet worden in het bereik van 100-200 ug, die routinematig wordt verdund tot een werkvoorraad van 1 ug / ul. </li></ol> 2. Transfectie van EA.hy 926 cellen <ol><li> Split EA.hy 926 cellen 4, gekweekt in volledige-DMEM (DMEM + 10% foetaal runderserum + Pen. / Strep.) In MatTek dekglaasje (nr. 0) 35 mm gerechten met 2 ml medium. U kunt conservatief verkrijgen ~ 15 gerechten (~ 90% confluent de volgende dag) van een 15 cm samenvloeiend schotel. Bereid een schotel om de expressie van ieder individu receptor, maar ook een schotel voor elke receptor paar te evalueren. </li><li> Laat de cellen een nacht incuberen in 5% CO 2 atmosfeer bij 37 ° C. De volgende dag, moeten de culturen ~ 70-90% confluent. </li><li> Op de dag van de transfectie, bereiden de nucleolipid complexen door het mengen van 2 ug van het chimère receptor vector DNA (2 pi) met 8 pi van Fugene6 in 200 pi van de voorverwarmde OptiMEM. Voor de receptor paren, transfecteren met 1 ug van elke receptor, voor een totaal van 2 ug (zie ook bespreking hieronder). </li><li> Meng voorzichtig door de inversie. </li><li> Blijf op kamertemperatuur incuberen gedurende 30 minuten. </li><li> Tijdens de incubatietijd, de voorbereiding van de cellen voor transfectie. Aspireren uit vers medium en was elk bord voorzichtig en kort met warm PBS vóór de toevoeging van 2 ml voorverwarmde compleet-DMEM zonder antibiotica (DMEM + FBS). Het is belangrijk om te voorkomen dat de aanwezigheid van penicilline en streptomycine, omdat ze aanzienlijk meer giftig voor cellen tijdens de behandeling met Fugene6. </li><li> Voeg de complexe druppelsgewijs naar de cellen en incubeer gedurende een extra 20-24 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 atmosfeer. </li><li> Na 24 uur, voorzichtig zuigen de media uit de cellen en pipet verse compleet-DMEM met antibiotica. Na transfectie, levensvatbaarheid van de cellen moeten blijven relatief hoog, dat wil zeggen weinig tot geen drijvende cellen moeten in acht worden genomen. </li><li> Genexpressie is meestal maximaal na een extra 48 tot 60 uur na transfectie. Maar beeldvorming is meestal haalbaar zo kort als 24 uur. Tijdsverloop experimenten voor een optimale genexpressie moet worden uitgevoerd. </li></ol> 3. Confocale Imaging en FRET-analyse Live-cell imaging wordt uitgevoerd op een Leica TCS-SP2 AOBS confocale laser scanning microscoop uitgerust met blauwe diode (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm). groene HeNe (543 nm), oranje HeNe (594 nm), en rood HeNe (633 nm) lasers, een HCX PI Apo 63x/1.3 na glycerine-immersie objectief, een gemotoriseerde XY fase (Märzhäuser), en een milieuvriendelijke gecontroleerd ( temperatuur, vochtigheid en CO 2) stadium incubator (Pecon). Experimentele controles zijn essentieel voor fluorofoor overspraak tussen de emissie-kanalen en te evalueren uitdrukking kwesties en niet-specifieke fluorofoor multimerization te elimineren. Als zodanig zijn enkele fluorofoor transfecties gebruikt voor het opzetten van elk beeld sessie. Negatieve FRET controles (met gebruikmaking van bekende noninteracting receptoren) zullen moeten worden uitgevoerd, om de achtergrond te bepalen FRET die optreedt als gevolg van te expressie. <ol><li> Te elimineren overspraak tussen de emissie-kanalen voor CFP en YFP, plaats van het GVB uitdrukking controle naar het podium incubator. Met behulp van wit licht, stel de Z-plaat te richten opnaar de cellen. </li><li> Set SP-venster de instellingen voor emissie detectie van het GVB om 465 tot 505 nm en YFP tot 525-600 nm. </li><li> Terwijl het toezicht zowel emissie-kanalen, prikkelen het GVB bij 458 nm. Met behulp van de AOTF, stelt u het laservermogen tot aanzienlijke bloeden te elimineren dan van het GVB in de YFP emissie-kanaal. Bewaar deze instelling. </li><li> Voer dezelfde controle voor YFP overspraak (met de YFP expressie controle) in de GVB-kanaal door het aanpassen van de excitatie vermogen bij 514 nm voor de cellen die alleen YFP. Bewaar deze instelling. </li><li> Volgende plaats cellen die co-expressie CFP en YFP naar het podium incubator. Met behulp van de volgorde instelling voor de Leica confocale software, zoek cellen die een vergelijkbaar niveau van CFP en YFP met de juiste membraan lokalisatie. </li><li> Met behulp van de Leica software acceptor foto bleken programma, de donor en acceptor instellingen op uw opgeslagen CFP en YFP-instellingen, respectably. </li><li> Zoomen op de cel, markeert een ROI (gebied van belang) waarin de foto-vernietiging van YFP is voor te komen op de celmembraan en het programma te beginnen. </li><li> Voor de foto-vernietiging van de acceptor, pas de AOTF tot 100% bij 514 nm en laat de laser bleken om door te gaan tot de 70% van de emissie YFP is uitgeput. Te versnellen bleken, zijn ROI meestal gekozen in het raster as van de laser (X-as). </li><li> Tijdens de foto-bleken, toezicht op de cellulaire beweging en verwerpen metingen verkregen met aanzienlijke beweging in het XY-vlak, omdat deze metingen kunnen melden valse FRET efficiëntie. </li><li> Pre-en post-bleekmiddelen beelden worden opgenomen voor zowel de donor (GVB) en de acceptor (YFP) en FRET efficiëntie wordt berekend als: FRET Eff = (D post-D pre) / D post voor alle D bericht&gt; D pre waarbij D pre en D na is de donor intensiteit voor en na fotobleken respectievelijk. </li><li> JMP Software (SAS) wordt gebruikt om de omvang van de experimentele variabiliteit te bepalen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Transfectie efficiëntie zijn meestal tussen de 30 tot 40%. Ondanks de eerdere bevindingen door anderen, hebben we niet gezien dat transfectie en expressie van een vector die van de andere gunsten. Sterker nog, we vaak waarnemen exclusieve uitdrukking van een fluorofoor hersenschim of het ander. Typische FRET efficiëntie variëren tussen receptor systemen. Voor de Tie-receptor-systeem, typische waarden zijn 20-28% van epitheliale cellen en 19-23% in endotheelcellen. Voor de negatieve controles, typische efficiëntie worden hieronder 2-3%. De mate van variabiliteit aanzienlijk zullen dalen met ervaring. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Representatief beeld van de getransfecteerde EA.hy 926 cellen. A) DIC beeld van EA.hy 926 cel monolaag. B) Fluorescentie beeld van de cellen wordt weergegeven in (A). C) Overlay van (A) en (B) aan te tonen ~ 20-30% transfectie-efficiëntie. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve acceptor foto-bleken analyse van FRET zich tussen het GVB en YFP in een EA.hy926 cel. Het GVB emissie kanaal (boven panelen) en YFP emissie-kanaal (twee onderste panelen) werden afzonderlijk gevolgd voor en na de acceptor fotobleking. Fotobleken experimenten werden beperkt tot, en FRET waarden berekend uit de regio in de groene doos. FRET efficiëntie wordt weergegeven als een absolute variëren van hoog (rood-1.0) tot laag (paars-0.0) op een vergrote overlay van een GVB / YFP samengevoegde afbeelding voor oriëntatie doeleinden.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor succes. De meest prominente onder hen is de relatieve niveaus van expressie tussen de twee chimère receptoren. Om dit probleem te omzeilen, kan een te maken stabiele cellijnen te drukken beide eiwitten van belang, of te identificeren optimale ratio&#39;s van vector DNA gelijkwaardige expressie mogelijk te maken. Op dezelfde manier, als gevolg van niet-uniforme transfectie in een schotel, zal eiwitniveaus zelden gelijkwaardig tussen cellen. Daarom moet aandacht worden besteed aan &#39;hoog&#39; expressors te onderscheiden van &#39;laag&#39;. Degenen die display &#39;gemiddelde&#39; niveaus van eiwit levert doorgaans betrouwbare en reproduceerbare FRET efficiëntie. Een methode ons lab heeft gevoerd om dit probleem te verlichten is het gebruik van adeno-en Lenti-virussen &#39;zelfs&#39; genexpressie. Bovendien, een alternatieve methode om acceptor foto-bleken voor het bepalen van FRET efficiëntie is gesensibiliseerd emissie. Hoewel, ondanks het potentieel van gevoelig emissie naar individuele cellen in real-time monitor, hebben we gevonden acceptor foto-bleken te zijn gevoeliger en betrouwbaarder. Tot slot kan met behulp van FRET aan eiwit interacties te controleren uitdagend zijn, en vereist een zorgvuldige selectie van de linker lengtes voor membraan-gebonden receptoren. Bovendien is de toevoeging van C / YFP vaak grote invloed op eiwit expressie niveau en resulteert in aggregatie in het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat. Echter, voor voorbijgaande aard, of instabiel, interacties, FRET is de ideale methode om te gebruiken.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasschaaltjes</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 Competente Cellen</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging eiwit-eiwit interacties in vivo</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Eiwit-eiwit interacties zijn een kenmerk van alle essentiële cellulaire processen. Echter, veel van deze interacties zijn van voorbijgaande aard, of energetisch zwak, het voorkomen van het identificatie en analyse door middel van traditionele biochemische methoden, zoals co-immunoprecipitatie. In dit verband hebben de genetisch encodable fluorescerende eiwitten (GFP, RFP, enz.) en de bijbehorende overlappende fluorescentiespectrum een revolutie in ons vermogen om zwakke interacties in vivo met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) 1-3 monitor. Hier hebben we detail ons gebruik van een FRET-gebaseerde nabijheid test voor het toezicht op receptor-receptor interacties op de endotheliale celoppervlak.

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Eiwit-eiwitinteracties zijn kenmerkend voor alle essentiële cellulaire processen. Veel van deze interacties zijn echter transient, of energetisch zwak, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van eiwit-eiwitinteracties op het celoppervlak te evalueren. Dit wordt bereikt door in een tweede stap twee receptoren van belang te kloneren, een myo terminaal aan twee fluoroforen met overlappende emissie- en spectra. De twee vectoren worden gelijktijdig getransfecteerd in endotheelcellen voor receptorexpressie.Op dit punt helpen de fluorforen bij het evalueren van de totale mate van expressie en de lokalisatie van de receptor. Vervolgens worden de beeldvormingsparameters vastgesteld met behulp van een enkele transfectie als controle op de confocale microscoop. Individuele, getransfecteerde cellen worden geselecteerd op basis van hun relatieve niveaus van receptorexpressie en lokalisatie.Regio's binnen deze cellen worden vervolgens afgebeeld om de mate van FRET-resultaten te evalueren. Deze tonen interacties tussen tie-1 en tie-2 op het oppervlak van de endotheelcel op basis van FRET en confocale microscopie. Hallo, ik ben Tom Seger van het laboratorium van Dr. William Barton van de afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie aan de Virginia Commonwealth University.Vandaag laten we u een procedure zien voor het evalueren van eiwit-eiwitinteracties in endotheelcellen middels FRET-gebaseerde confocale microscopie. In ons laboratorium gebruiken we deze methode om receptorinteracties tijdens angiogenese te bestuderen. Laten we beginnen.Om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren met een FRET-gebaseerde proximity-assay, begint u met het kloneren van de betreffende receptoren in de Nhe I- en Eco R I-sites van de pcDNA3.1-hygro of -neo vector die monomerisch CFP of YFP bevat. De bepaling van FRET is empirisch en is kritisch afhankelijk van de lengte van de linker tussen het transmembraan domein en het begin van het fluorofoor. Daarom moeten verschillende linkerlengtes worden onderzocht voor elk nieuw receptorpaar dat wordt bestudeerd. Transformeer en amplificeer de vectoren volgens het bijbehorende protocol.Bereid vervolgens DNA van transfectiekwaliteit voor, transformeer en amplificeer de vectoren volgens het bijbehorende protocol. Bereid daarna DNA van transfectiekwaliteit en verdun dit tot een werkconcentratie van 1 µg/µL. Om de cellen voor te bereiden voor transfectie onder een weefselkweekkap, worden EAHY 92 6 cellen gekweekt in compleet DMEM overgeplaatst naar 35 millimeter schaaltjes met dekglas met 2 mL medium. Bereid één schaaltje voor om de expressie van elke individuele receptor te evalueren, evenals één schaaltje voor elk receptorpaar.Laat de cellen de volgende dag incuberen in een atmosfeer van 95% koolstofdioxide bij 37 °C. De cultuur moet op de dag van transfectie een confluentie van ongeveer 70 tot 90% hebben. Bereid nucleolipidecomplexen door twee microgram van het chimerische receptorvector-DNA te mengen met acht microliter Fuji N HD in 200 microliter voorverwarmd optimum; voor receptorparen transfecteert men met één microgram van elke receptor voor een totaal van twee microgram. Meng dit voorzichtig door inversie en laat het 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur.Bereid tijdens de incubatieperiode de cellen voor op transfectie door het verse medium af te zuigen en elke plaat voorzichtig en kort te wassen met warm PBS voordat twee milliliters voorverwarmd compleet DMEM zonder antibiotica wordt toegevoegd. Het is belangrijk om de aanwezigheid van penicilline en streptomycine te vermijden, aangezien deze aanzienlijk toxischer zijn voor cellen tijdens de behandeling. Voeg het complex druppelgewijs toe aan de cellen en incubeer nogmaals 20 tot 24 uur. Zuig na 24 uur voorzichtig het medium van de cellen af en pipetteer na de transfectie vers compleet DMEM met antibiotica.De cellevensvatbaarheid moet relatief hoog blijven. Er mogen weinig tot geen zwevende cellen worden waargenomen. Voor live-cell imaging maken we gebruik van een A-T-C-S-P twee A OBS confocale laser-scanningmicroscoop uitgerust met blauwe diode argon- en groene, oranje en rode helium-neonlasers, een H-C-X-P-I-A-O 63 x 1,3 NA glycerine-immersieobjectief, een gemotoriseerde XY-tafel en een stage-incubator met controle van temperatuur, vochtigheid en kooldioxide.Experimentele controles zijn cruciaal om fluorophore-crosstalk tussen de emissiekanalen te elimineren, evenals om expressieproblemen en aspecifieke fluorescentie te evalueren. Daarom worden transfecties met één enkel fluorophore gebruikt bij het opzetten van elke beeldsessie om crosstalk tussen de emissiekanalen voor CFP en YFP uit te sluiten. Plaats de CFP-expressiecontrole in de objecthouder-incubator onder wit licht.Stel de Z-plaat af om op de cellen te focussen. Stel de instellingen van het SP-venster voor emissiedetectie van CFP in op 465 tot 505 nanometer en voor YFP op 525 tot 600 nanometer; exciteer terwijl beide emissiekanalen worden gemonitord de CFP bij 458 nanometer. Gebruik de A OTF om het laservermogen zo in te stellen dat aanzienlijke bleed-over van CFP naar het YFP-emissiekanaal wordt geëlimineerd.Sla deze instelling op. Voer dezelfde controle uit voor YFP-crosstalk in het CFP-kanaal door het excitatievermogen bij 514 nanometer aan te passen. Sla deze instelling op voor de cellen die alleen YFP tot expressie brengen.Plaats vervolgens de cellen die CFP en YFP tot expressie brengen in de podiumincubator. Gebruik de sequentie-instellingen van de LICO-confocale software. Lokaliseer met de LICO-software cellen die vergelijkbare niveaus van CFP en YFP tot expressie brengen met een correcte membraanlokalisatie, gebruikmakend van een software-geaccepteerd photobleaching-programma.Stel de donor- en acceptorgegevens respectievelijk in op uw opgeslagen CFP- en YFP-instellingen. Zoom in op de cel en markeer een interessegebied (Region of Interest of ROI) op het celmembraan waarin de fotodestructie van YFP moet plaatsvinden, en start het programma voor fotodestructie van de acceptor. Stel de AOTF in op 100% van 514 nanometers en laat het laser-bleaching doorgaan totdat 70% van de YFP-emissie is uitgeput.Om het bleken te versnellen worden tijdens fotobleken doorgaans ROI's gekozen in de rasteras van de laser. Monitor de cellulaire beweging en verwerp metingen die zijn verkregen bij een aanzienlijke beweging in het XY-vlak. Omdat deze metingen onjuiste FRET-efficiënties kunnen rapporteren, worden beelden vóór en na het bleken opgenomen voor zowel de donor als de acceptor, en wordt de FRET-efficiëntie berekend als FRET-efficiëntie is gelijk aan (post - DLO) gedeeld door depost voor alle depost groter dan D pre, waarbij D pre en D post respectievelijk de donorintensiteiten voor en na fotobleken zijn.JMP wordt gebruikt om de mate van experimentele variabiliteit te bepalen. Individuele receptoren moeten gefuseerd worden aan zowel CFP als YFP met variërende lengtes van de juxtamembraansequentie. Om het best mogelijke paar receptor-FRET-partners te identificeren, liggen de transfectie-efficiënties doorgaans tussen de 30 en 40%, ondanks eerdere bevindingen door anderen.We hebben niet vastgesteld dat de transfectie en expressie van de ene vector die van de andere bevordert. In feite observeren we regelmatig exclusieve expressie van slechts één van de twee. Deze representatieve afbeeldingen tonen een acceptor-fotoblekinganalyse van FRET die plaatsvindt tussen CFP en YFP in een EAHY 9 26-cel.De emissiekanalen van CFP en YFP werden afzonderlijk gemonitord voor en na fotobleken, en de berekeningen werden beperkt tot de regio. Binnen het rode kader wordt de FRET-efficiëntie weergegeven als een absoluut bereik, van hoog (roodgekleurd) bij 1,0 tot laag (paarsgekleurd) bij nul, op een vergrote overlay van een samengesteld A-C-F-P-Y-F-P beeld voor oriëntatiedoeleinden voor het T-receptorsysteem. Typische waarden voor de FRET-efficiëntie zijn, zoals hier getoond, 20 tot 28% voor epitheelcellen en 19 tot 23% voor endotheelcellen.Zodra deze techniek onder de knie is, duurt de uitvoering doorgaans drie tot vier dagen als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de lengte van de linker tussen uw doeleiwit en het gefuseerde fluorescerende eiwit, evenals hun expressieniveaus en cellulaire beweging, direct van invloed zijn op de FRET-meting na de procedure. Bovendien kunnen biochemische assays met betrekking tot signaalactivatie worden uitgevoerd om inzicht te krijgen in signaaltransductiepaden na de ontwikkeling ervan.Deze techniek biedt een assay waarmee proteïne-proteïne-interacties die zwak of transient zijn, kunnen worden bestudeerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw eigen FRET-gebaseerde proximity assays in levende cellen kunt uitvoeren. Vergeet niet dat er bij het werken met cellen in weefselkweek altijd passende veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw toekomstige fret-experimenten.

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Het protocol presenteert een methode voor in vivo covalente hechting van biotine aan eiwitten op basis van hun nabijheid tot een biotineligase die is gefuseerd met een interessant eiwit. Deze modificatie maakt een selectieve verrijking van de eiwitten mogelijk met behulp van streptavidinekorrels als dat nodig is in eiwitinteractiestudies.

In vivo Nabijheidsbiotinylering voor onderzoek naar eiwitinteractie in Paramecium tetraurelia

Leer eiwit-eiwit interacties beoordelen op het celoppervlak van endotheelcellen met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheidsassay. Deze methode maakt visualisatie van receptorinteracties tijdens angiogenese mogelijk.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo

Meer video's verkennen