Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo

Het algemene doel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van eiwit-eiwitinteracties op het celoppervlak te evalueren. Dit wordt bereikt door in een tweede stap twee receptoren van belang te kloneren, een myo terminaal aan twee fluoroforen met overlappende emissie- en spectra. De twee vectoren worden gelijktijdig getransfecteerd in endotheelcellen voor receptorexpressie.

Op dit punt helpen de fluorforen bij het evalueren van de totale mate van expressie en de lokalisatie van de receptor. Vervolgens worden de beeldvormingsparameters vastgesteld met behulp van een enkele transfectie als controle op de confocale microscoop. Individuele, getransfecteerde cellen worden geselecteerd op basis van hun relatieve niveaus van receptorexpressie en lokalisatie.

Regio's binnen deze cellen worden vervolgens afgebeeld om de mate van FRET-resultaten te evalueren. Deze tonen interacties tussen tie-1 en tie-2 op het oppervlak van de endotheelcel op basis van FRET en confocale microscopie. Hallo, ik ben Tom Seger van het laboratorium van Dr. William Barton van de afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie aan de Virginia Commonwealth University.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het evalueren van eiwit-eiwitinteracties in endotheelcellen middels FRET-gebaseerde confocale microscopie. In ons laboratorium gebruiken we deze methode om receptorinteracties tijdens angiogenese te bestuderen. Laten we beginnen.

Om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren met een FRET-gebaseerde proximity-assay, begint u met het kloneren van de betreffende receptoren in de Nhe I- en Eco R I-sites van de pcDNA3.1-hygro of -neo vector die monomerisch CFP of YFP bevat. De bepaling van FRET is empirisch en is kritisch afhankelijk van de lengte van de linker tussen het transmembraan domein en het begin van het fluorofoor. Daarom moeten verschillende linkerlengtes worden onderzocht voor elk nieuw receptorpaar dat wordt bestudeerd. Transformeer en amplificeer de vectoren volgens het bijbehorende protocol.

Bereid vervolgens DNA van transfectiekwaliteit voor, transformeer en amplificeer de vectoren volgens het bijbehorende protocol. Bereid daarna DNA van transfectiekwaliteit en verdun dit tot een werkconcentratie van 1 µg/µL. Om de cellen voor te bereiden voor transfectie onder een weefselkweekkap, worden EAHY 92 6 cellen gekweekt in compleet DMEM overgeplaatst naar 35 millimeter schaaltjes met dekglas met 2 mL medium. Bereid één schaaltje voor om de expressie van elke individuele receptor te evalueren, evenals één schaaltje voor elk receptorpaar.

Laat de cellen de volgende dag incuberen in een atmosfeer van 95% koolstofdioxide bij 37 °C. De cultuur moet op de dag van transfectie een confluentie van ongeveer 70 tot 90% hebben. Bereid nucleolipidecomplexen door twee microgram van het chimerische receptorvector-DNA te mengen met acht microliter Fuji N HD in 200 microliter voorverwarmd optimum; voor receptorparen transfecteert men met één microgram van elke receptor voor een totaal van twee microgram. Meng dit voorzichtig door inversie en laat het 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Bereid tijdens de incubatieperiode de cellen voor op transfectie door het verse medium af te zuigen en elke plaat voorzichtig en kort te wassen met warm PBS voordat twee milliliters voorverwarmd compleet DMEM zonder antibiotica wordt toegevoegd. Het is belangrijk om de aanwezigheid van penicilline en streptomycine te vermijden, aangezien deze aanzienlijk toxischer zijn voor cellen tijdens de behandeling. Voeg het complex druppelgewijs toe aan de cellen en incubeer nogmaals 20 tot 24 uur. Zuig na 24 uur voorzichtig het medium van de cellen af en pipetteer na de transfectie vers compleet DMEM met antibiotica.

De cellevensvatbaarheid moet relatief hoog blijven. Er mogen weinig tot geen zwevende cellen worden waargenomen. Voor live-cell imaging maken we gebruik van een A-T-C-S-P twee A OBS confocale laser-scanningmicroscoop uitgerust met blauwe diode argon- en groene, oranje en rode helium-neonlasers, een H-C-X-P-I-A-O 63 x 1,3 NA glycerine-immersieobjectief, een gemotoriseerde XY-tafel en een stage-incubator met controle van temperatuur, vochtigheid en kooldioxide.

Experimentele controles zijn cruciaal om fluorophore-crosstalk tussen de emissiekanalen te elimineren, evenals om expressieproblemen en aspecifieke fluorescentie te evalueren. Daarom worden transfecties met één enkel fluorophore gebruikt bij het opzetten van elke beeldsessie om crosstalk tussen de emissiekanalen voor CFP en YFP uit te sluiten. Plaats de CFP-expressiecontrole in de objecthouder-incubator onder wit licht.

Stel de Z-plaat af om op de cellen te focussen. Stel de instellingen van het SP-venster voor emissiedetectie van CFP in op 465 tot 505 nanometer en voor YFP op 525 tot 600 nanometer; exciteer terwijl beide emissiekanalen worden gemonitord de CFP bij 458 nanometer. Gebruik de A OTF om het laservermogen zo in te stellen dat aanzienlijke bleed-over van CFP naar het YFP-emissiekanaal wordt geëlimineerd.

Sla deze instelling op. Voer dezelfde controle uit voor YFP-crosstalk in het CFP-kanaal door het excitatievermogen bij 514 nanometer aan te passen. Sla deze instelling op voor de cellen die alleen YFP tot expressie brengen.

Plaats vervolgens de cellen die CFP en YFP tot expressie brengen in de podiumincubator. Gebruik de sequentie-instellingen van de LICO-confocale software. Lokaliseer met de LICO-software cellen die vergelijkbare niveaus van CFP en YFP tot expressie brengen met een correcte membraanlokalisatie, gebruikmakend van een software-geaccepteerd photobleaching-programma.

Stel de donor- en acceptorgegevens respectievelijk in op uw opgeslagen CFP- en YFP-instellingen. Zoom in op de cel en markeer een interessegebied (Region of Interest of ROI) op het celmembraan waarin de fotodestructie van YFP moet plaatsvinden, en start het programma voor fotodestructie van de acceptor. Stel de AOTF in op 100% van 514 nanometers en laat het laser-bleaching doorgaan totdat 70% van de YFP-emissie is uitgeput.

Om het bleken te versnellen worden tijdens fotobleken doorgaans ROI's gekozen in de rasteras van de laser. Monitor de cellulaire beweging en verwerp metingen die zijn verkregen bij een aanzienlijke beweging in het XY-vlak. Omdat deze metingen onjuiste FRET-efficiënties kunnen rapporteren, worden beelden vóór en na het bleken opgenomen voor zowel de donor als de acceptor, en wordt de FRET-efficiëntie berekend als FRET-efficiëntie is gelijk aan (post - DLO) gedeeld door depost voor alle depost groter dan D pre, waarbij D pre en D post respectievelijk de donorintensiteiten voor en na fotobleken zijn.

JMP wordt gebruikt om de mate van experimentele variabiliteit te bepalen. Individuele receptoren moeten gefuseerd worden aan zowel CFP als YFP met variërende lengtes van de juxtamembraansequentie. Om het best mogelijke paar receptor-FRET-partners te identificeren, liggen de transfectie-efficiënties doorgaans tussen de 30 en 40%, ondanks eerdere bevindingen door anderen.

We hebben niet vastgesteld dat de transfectie en expressie van de ene vector die van de andere bevordert. In feite observeren we regelmatig exclusieve expressie van slechts één van de twee. Deze representatieve afbeeldingen tonen een acceptor-fotoblekinganalyse van FRET die plaatsvindt tussen CFP en YFP in een EAHY 9 26-cel.

De emissiekanalen van CFP en YFP werden afzonderlijk gemonitord voor en na fotobleken, en de berekeningen werden beperkt tot de regio. Binnen het rode kader wordt de FRET-efficiëntie weergegeven als een absoluut bereik, van hoog (roodgekleurd) bij 1,0 tot laag (paarsgekleurd) bij nul, op een vergrote overlay van een samengesteld A-C-F-P-Y-F-P beeld voor oriëntatiedoeleinden voor het T-receptorsysteem. Typische waarden voor de FRET-efficiëntie zijn, zoals hier getoond, 20 tot 28% voor epitheelcellen en 19 tot 23% voor endotheelcellen.

Zodra deze techniek onder de knie is, duurt de uitvoering doorgaans drie tot vier dagen als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de lengte van de linker tussen uw doeleiwit en het gefuseerde fluorescerende eiwit, evenals hun expressieniveaus en cellulaire beweging, direct van invloed zijn op de FRET-meting na de procedure. Bovendien kunnen biochemische assays met betrekking tot signaalactivatie worden uitgevoerd om inzicht te krijgen in signaaltransductiepaden na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek biedt een assay waarmee proteïne-proteïne-interacties die zwak of transient zijn, kunnen worden bestudeerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw eigen FRET-gebaseerde proximity assays in levende cellen kunt uitvoeren. Vergeet niet dat er bij het werken met cellen in weefselkweek altijd passende veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw toekomstige fret-experimenten.